Eine einfache Technik zur Isolierung und Kultivierung von murinen Astrozyten

Schneiden Sie eine Mausrinde in kleine Stücke und geben Sie sie in ein kaltes Seziermedium, das eine gepufferte Salzlösung enthält.

Fügen Sie Verdauungsenzyme hinzu, um die extrazelluläre Matrix zu dissoziieren.

Um Enzymreste zu entfernen, waschen Sie es mit dem Kaltpräpariermedium.

Ersetzen Sie dieses Medium durch ein Medium zur Anreicherung von Astrozyten.

Verwenden Sie anschließend eine Pipette, um die Gewebestücke zu dissoziieren.

Die Suspension durch ein Sieb passieren, um undissoziiertes Gewebe zu entfernen und einzelne Zellen zu erhalten.

Übertragen Sie die Zellen auf eine positiv geladene, polymerbeschichtete Platte. Durch Schütteln inkubieren.

Die Astrozyten haften fest, während sich die locker gebundenen Neuronen, Mikroglia und Oligodendrozyten ablösen.

Das Anreicherungsmedium wandelt reife Astrozyten in sich teilende polygonale Astrozyten um.

Entfernen Sie die abgelösten Zellen und waschen Sie die Astrozyten mit einem Phosphatpuffer.

Fügen Sie Verdauungsenzyme hinzu, um Astrozyten abzulösen.

Fügen Sie ein serumhaltiges Medium hinzu, um die enzymatische Aktivität zu stoppen. Sammeln Sie die Astrozyten in einem Röhrchen und zentrifugieren Sie.

Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen in einem Astrozyten-Reifungsmedium, um eine typische sternförmige reife Astrozytenstruktur zu fördern.

Schneiden Sie jegliches kortikale Gewebe, das zur Erzeugung von Astrozyten verwendet werden soll, in Stücke, die nicht größer als 1 Kubikmillimeter sind. Sobald alle Gewebestücke gesammelt sind, warten Sie, bis sie sich am Boden des Röhrchens abgesetzt haben. Saugen Sie dann so viel Medium wie möglich an. Fügen Sie anschließend 2 bis 3 Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Aspirieren Sie anschließend vorsichtig das Trypsin-EDTA und lassen Sie Gewebestücke in einer minimalen Menge Flüssigkeit am Boden des Röhrchens. Fügen Sie anschließend 5 Milliliter vorgekühltes Dissektionsmedium hinzu, um das restliche Trypsin-EDTA abzuwaschen, und pipettieren Sie an die Seite des oberen Röhrchens, um eine Durchmischung der Gewebestücke zu erreichen. Aspirieren Sie dann das Dissektionsmedium und lassen Sie die Gewebestücke in so wenig Flüssigkeit wie möglich.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt mit vorgekühltem Seziermedium zweimal. Nach dem letzten Waschschritt 1 Milliliter DMEM PLUS bei Raumtemperatur zugeben und das Gewebe durch Auf- und Abpipettieren ohne Blasenbildung titrieren.

Astrozyten reagieren sehr empfindlich auf den pH-Wert, daher ist es wichtig, die Bildung von Blasen zu vermeiden, da dies den pH-Wert der Lösung verändern kann.

Legen Sie anschließend ein 100-Mikron-Zellsieb in die Öffnung eines 50-Milliliter-Röhrchens und befeuchten Sie den Filter mit 4,5 Millilitern vorgekühltem DMEM PLUS. Pipettieren Sie 1 Milliliter der dissoziierten Gewebesuspension auf das Zellsieb und fügen Sie weitere 4,5 Milliliter vorgekühltes DMEM PLUS hinzu, um die Zellen durch das Sieb zu spülen. Am Tag in vitro 7 nach der Dissektion stellen Sie die 10-Zentimeter-Schalen mit Zellen in DMEM PLUS auf einen Schüttler im Inkubator und schütteln Sie die Schalen sechs Stunden lang bei 110 U/min.

20 bis 30 Minuten vor Ende des sechsstündigen Schüttelns 1X PBS, DMEM PLUS, NB+H und 0,25 % Trypsin EDTA auf 37 Grad im Wasserbad vorwärmen. Nehmen Sie nach sechsstündigem Schütteln die Kulturschalen vom Shaker und ersetzen Sie das Medium sofort durch 10 Milliliter vorgewärmtes 1X PBS pro Schale. Entfernen Sie anschließend PBS und fügen Sie 3 Milliliter vorgewärmtes Trypsin-EDTA pro Gericht hinzu.

Inkubieren Sie die Proben dann vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 5 Milliliter vorgewärmtes DMEM PLUS zu 3 Millilitern Trypsin EDTA in jede Schale hinzu. Pipettieren Sie die Zellen aus der Schale und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Danach zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 3.220 mal g bei 20 Grad Celsius für vier Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 Milliliter vorgewärmtem NB+H.