JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 4:07 Min. • June 17th, 2025
Beginnen Sie mit chemisch fixierten und permeabilisierten murinen Muskelfasern, die in die Vertiefungen einer Multiwell-Platte gelegt werden.
Inkubieren Sie in einer Blockierungslösung, um die unspezifische Antikörperbindung zu minimieren.
Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die auf ein präsynaptisches Protein abzielen, das an der neuromuskulären Verbindung oder NMJ exprimiert wird.
Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die auf die primären Antikörper abzielen, und einem Fluorophor-konjugierten Neurotoxin, das an postsynaptische Acetylcholinrezeptoren bindet.
Mit Puffer waschen, um ungebundene Reagenzien zu entfernen.
Legen Sie die Fasern mit Eindeckmedium auf einen Objektträger, positionieren Sie ein Deckglas und befestigen Sie sie mit zylindrischen Magneten, um die Fasern abzuflachen.
Beginnen Sie mit der Bildgebung mit einem konfokalen STED-Mikroskop.
Bei der Laserbeleuchtung fluoreszieren die markierten Proteine.
Die konfokale Mikroskopie ist aufgrund ihrer begrenzten Auflösung und Fluoreszenzausbreitung nicht in der Lage, feinere NMJ-Strukturen klar aufzulösen.
Im Gegensatz dazu wird bei der STED-Mikro
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