Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen in Mäusen durch kombinierte konfokale und superauflösende Mikroskopie

Beginnen Sie mit chemisch fixierten und permeabilisierten murinen Muskelfasern, die in die Vertiefungen einer Multiwell-Platte gelegt werden.

Inkubieren Sie in einer Blockierungslösung, um die unspezifische Antikörperbindung zu minimieren.

Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die auf ein präsynaptisches Protein abzielen, das an der neuromuskulären Verbindung oder NMJ exprimiert wird.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die auf die primären Antikörper abzielen, und einem Fluorophor-konjugierten Neurotoxin, das an postsynaptische Acetylcholinrezeptoren bindet.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Reagenzien zu entfernen.

Legen Sie die Fasern mit Eindeckmedium auf einen Objektträger, positionieren Sie ein Deckglas und befestigen Sie sie mit zylindrischen Magneten, um die Fasern abzuflachen.

Beginnen Sie mit der Bildgebung mit einem konfokalen STED-Mikroskop.

Bei der Laserbeleuchtung fluoreszieren die markierten Proteine.

Die konfokale Mikroskopie ist aufgrund ihrer begrenzten Auflösung und Fluoreszenzausbreitung nicht in der Lage, feinere NMJ-Strukturen klar aufzulösen.

Im Gegensatz dazu wird bei der STED-Mikroskopie ein Depletionslaser verwendet, um die Fluoreszenzausbreitung zu unterdrücken, was eine klare NMJ-Visualisierung ermöglicht.

Beginnen Sie nach der Euthanasiere, die vorderen Muskeln des Tibialis in kleinen Faserbündeln von etwa 1 Millimeter Breite mit zwei feinen gezackten Pinzetten zu necken. Übertragen Sie dann diese Muskelbündel in eine 24-Well-Platte mit 1 % Triton X-100, das in PBS hergestellt wurde, und lassen Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder fünf Stunden bei 4 Grad Celsius sanft rühren.

Nachdem die Proben dreimal 5 Minuten lang mit PBS bei Raumtemperatur gewaschen wurden, werden die Proben vier Stunden lang bei 4 Grad Celsius unter leichtem Rühren mit einer Blockierungslösung aus 4 % BSA inkubiert, die in PBS mit 1 % Triton X-100 hergestellt wurde. Inkubieren Sie die Proben dann über Nacht mit der gleichen Blockierungslösung, die primäre monoklonale Antikörper entweder gegen Neurofilament M oder synaptisches Vesikel-Glykoprotein 2 enthält, um präsynaptische Axonendigungen bzw. aktive Zonen zu markieren.

Waschen Sie am nächsten Tag die beschrifteten Muskelbündel dreimal für 5 Minuten mit PBS unter sanftem Rühren. Inkubieren Sie sie dann mit geeigneten Sekundärantikörpern, indem Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einen Schüttler legen. Nachdem du die Muskelbündel erneut gewaschen hast, legst du sie auf eine Folie mit Eindeckmedium. Legen Sie dann ein Deckglas der Güteklasse 1,5 auf die Oberseite, gefolgt von zylindrischen Magneten auf beiden Seiten der Folie, um Druck auszuüben und die Muskeln abzuflachen.

Um Bilder mit dem konfokalen Mikroskop aufzunehmen, starten Sie die Mikroskopsoftware und wählen Sie Maschine als Konfigurationsmodus und sammeln Sie Bildstapel der neuromuskulären Verbindungen in jeder Versuchsgruppe gemäß den im Textmanuskript genannten Einstellungen. Klicken Sie am Ende der Sitzung auf Im 3D-Viewer öffnen und wählen Sie eine neuromuskuläre Verbindung aus, die für eine Versuchsgruppe repräsentativ ist, um die 3D-Beschriftung zu visualisieren.