Bewertung der Internalisierung von Zieloberflächenproteinen mit Hilfe eines Biotin-Derivats

Behandeln Sie kortikale Astrozyten der Maus mit einem spaltbaren Biotin-Derivat.

Inkubieren Sie bei niedriger Temperatur, um die Internalisierung von Proteinen zu verhindern und die Bindung von Biotin an die Zieloberflächenproteine zu erleichtern.

Waschen und fügen Sie ein warmes Medium hinzu, dann inkubieren, um die Internalisierung der biotinylierten Proteine zu induzieren.

Waschen und behandeln Sie mit einem membranundurchlässigen Reduktionsmittel, um das nicht internalisierte Biotin zu spalten.

Fügen Sie ein Abschreckreagenz hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und waschen Sie es.

Entnehmen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie. Entfernen Sie den Überstand.

Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, um die Zellen zu lysieren, wodurch die nicht-biotinylierten und internalisierten biotinylierten Proteine freigesetzt werden.

Zentrifuge, um die Zelltrümmer zu pelletieren.

Sammeln Sie den Überstand, der Proteine enthält, fügen Sie Streptavidin-Agarose-Kügelchen hinzu und mischen Sie, um die biotinylierten Proteine einzufangen.

Zentrifugieren Sie, um die Kügelchen zu pelletieren, und entsorgen Sie den Überstand.

Fügen Sie einen Ladepuffer hinzu und erhitzen Sie, um die Proteine aus den Kügelchen zu denaturieren und freizusetzen.

Lassen Sie das Protein auf ein Gel laufen und übertragen Sie es auf eine Blotting-Membran.

Nachweis mit primären und sekundären Antikörpern, um eine eindeutige Proteinbande zu visualisieren und eine erfolgreiche Proteininternalisierung zu bestätigen.

Nehmen Sie zunächst die Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit 4 Millilitern gekühltem CM-PBS und stellen Sie das Geschirr auf zerstoßenes Eis. Aspirieren Sie das CM-PBS und pipettieren Sie dann 3 Milliliter Biotinpuffer in jede Schale. Kippen Sie die Schalen ein paar Mal hin und her, um sicherzustellen, dass der Puffer gut verteilt ist, und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf Eis.

Aspirieren Sie dann den Biotin-Puffer und ersetzen Sie ihn durch 5 Milliliter warmes Medium. Eine Kulturschale wird 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und eine zweite Schale 30 Minuten lang bei der gleichen Temperatur inkubiert. Lassen Sie ein anderes Gericht bei 4 Grad Celsius als Null-Minuten-Probe.

Am Ende der Inkubationszeit wird das Medium verworfen und die Zellen dreimal mit 4 Millilitern gekühltem CM-PBS gewaschen. Anschließend wird das CM-PBS aspiriert, dann 6 Milliliter Reduktionspuffer über die Zellen pipetiert und die Probe 15 Minuten lang auf Eis gelassen.

Ersetzen Sie dann das Medium durch 6 Milliliter frischen Reduzierpuffer und legen Sie die Probe für weitere 15 Minuten auf Eis.

Dieser Schritt ist kritisch, da das im Reduktionspuffer enthaltene Glutathion die an der Zelloberfläche verbleibenden Biotin-Anteile spaltet. Dadurch wird sichergestellt, dass nur internalisierte Proteine verzerrt und markiert werden.

Entfernen Sie anschließend die Reduktionslösung und ersetzen Sie sie durch 6 Milliliter Abschreckpuffer. Lassen Sie die Probe weitere 15 Minuten auf Eis und wiederholen Sie den Abschreckschritt erneut. Entsorgen Sie dann den Quenching-Puffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 Millilitern gekühltem PBS.

Aspirieren Sie das CM-PBS und kratzen Sie dann die Zellen mit einem Zellheber in 1 Milliliter gekühltes PBS und überführen Sie die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 100 g drei Minuten lang pelletiert. Nach drei Minuten wird der Überstand verworfen und die Zellen in 500 Mikrolitern Lysepuffer resuspendiert.

Lassen Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie sie alle fünf Minuten ein. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius, um das Reinigungsmittel und die löslichen Materialien zu pelletieren. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.

Geben Sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze 150 Mikroliter der Streptavidin-Agarose-Aufschlämmung in das Lysat und inkubieren Sie es drei Stunden lang bei 4 Grad Celsius auf einem Shaker. Nach drei Stunden pelletieren Sie die Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 g für 30 Sekunden bei 4 Grad Celsius. Die Kügelchen in 1 Milliliter Waschpuffer resuspendieren und drei Minuten lang bei 4 Grad Celsius wiegen. Pelletieren Sie die Kügelchen und entsorgen Sie den Überstand.

Wiederholen Sie diesen Vorgang noch viermal, um die unspezifische Bindung von nicht-biotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren. Anschließend werden die Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 g für 30 Sekunden bei 4 Grad Celsius pelletiert. Entsorgen Sie den darüber liegenden Waschpuffer und fügen Sie 50 Mikroliter 1x Ladepuffer hinzu.

Geben Sie Biotin und Streptavidin aus den Kügelchen ab, indem Sie sie bei 95 Grad Celsius denaturieren. Diese Fraktion sollte nur internalisierte Zelloberflächenproteine enthalten. Trennen Sie dann den Eingang, die Zelloberfläche und die ungebundenen Fraktionen durch SDS-PAGE und analysieren Sie sie durch Western Blotting.