Bewertung der Internalisierung von Zieloberflächenproteinen mit Hilfe eines Biotin-Derivats

Behandeln Sie kortikale Astrozyten der Maus mit einem spaltbaren Biotin-Derivat.

Inkubieren Sie bei niedriger Temperatur, um die Internalisierung von Proteinen zu verhindern und die Bindung von Biotin an die Zieloberflächenproteine zu erleichtern.

Waschen und fügen Sie ein warmes Medium hinzu, dann inkubieren, um die Internalisierung der biotinylierten Proteine zu induzieren.

Waschen und behandeln Sie mit einem membranundurchlässigen Reduktionsmittel, um das nicht internalisierte Biotin zu spalten.

Fügen Sie ein Abschreckreagenz hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und waschen Sie es.

Entnehmen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie. Entfernen Sie den Überstand.

Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, um die Zellen zu lysieren, wodurch die nicht-biotinylierten und internalisierten biotinylierten Proteine freigesetzt werden.

Zentrifuge, um die Zelltrümmer zu pelletieren.

Sammeln Sie den Überstand, der Proteine enthält, fügen Sie Streptavidin-Agarose-Kügelchen hinzu und mischen Sie, um die biotinylierten Proteine einzufangen.

Zentrifugieren Sie, um die Kügelchen zu pelletieren, und entsorgen Sie den Überstand.

Fügen Sie einen Ladepuffer hinzu und erhitzen Sie, um die Proteine aus den Kügelche