Quantifizierung der Verteilung eines präsynaptischen Proteins im Gehirn von Mäusen mittels Immunfluoreszenz

Nehmen Sie ein chemisch fixiertes Maushirnstück, das in ein gewebeeinbettendes Medium eingebettet ist.

Waschen Sie die Scheibe mit Puffer, um das Medium zu entfernen.

Fügen Sie eine Lösung hinzu, die die Membranen permeabilisiert und unspezifische Bindungsstellen blockiert.

Entfernen Sie die Lösung.

Um neuronale synaptische Proteine sichtbar zu machen, inkubieren Sie die Scheibe mit primären Antikörpern.

Diese Antikörper zielen auf ein präsynaptisches Protein ab, das in den Synapsen bestimmter Hirnregionen exprimiert wird, und ein ubiquitär exprimiertes synaptisches Protein als Referenzmarker.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Einführung von Fluorophor-markierten Sekundärantikörpern, die auf die Primärantikörper abzielen.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Sekundärantikörper zu entfernen.

Gegenfärbung der Zellkerne mit einem DNA-bindenden Farbstoff.

Mit Puffer waschen und die Scheibe mit einem geeigneten Eindeckmedium aufsetzen.

Visualisieren Sie die Scheibe unter einem konfokalen Mikroskop.

Berechnen Sie die mittleren Fluoreszenzintensitätsverhältnisse des Zielproteins und des Referenzmarkers, um die Verteilung des Zielproteins über verschiedene Gehirnregionen hinweg zu analysieren.

Um die Scheiben für die Immunfärbung vorzubereiten, verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um die PB-Lösung aus einer Vertiefung zu entfernen, ohne die Gehirnscheiben einzuziehen. Verwenden Sie dann eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um 250 Mikroliter frisches PB hinzuzufügen, um sie von überschüssigem OCT zu waschen. Wiederholen Sie dieses Waschen für jede Vertiefung zu diesem Zeitpunkt, um ein Austrocknen der Scheiben zu vermeiden.

Verwenden Sie dann eine Plastikpipette, um die PB-Lösung aus der ersten Vertiefung zu entfernen. Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um 250 Mikroliter Blockierungspuffer pro Vertiefung hinzuzufügen, und arbeiten Sie wieder von Vertiefung zu Vertiefung. Die Platte bei Raumtemperatur auf einem Shaker drei Stunden lang inkubieren. Während der Inkubation werden 250 Mikroliter Antikörperpuffer pro Vertiefung in ein Reaktionsröhrchen gegeben.

Verwenden Sie dann eine 2-Mikroliter-Pipette, um die entsprechende Menge Antikörper hinzuzufügen, pipettieren Sie ihn direkt in die Lösung und pipettieren Sie ihn mehrmals vorsichtig auf und ab, um ihn zu mischen. Werfen Sie dann einen Vortex auf diesen verdünnten Antikörper, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten.

Entfernen Sie den Blockierungspuffer mit einer Kunststoffpipette und fügen Sie 250 Mikroliter Primärantikörperlösung pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte auf einem Shaker bei 4 Grad Celsius über Nacht.

Am nächsten Tag entfernen Sie die Antikörperlösung mit einer Kunststoffpipette. Waschen Sie die Scheiben mit 300 Mikrolitern Waschpuffer 1 pro Vertiefung, jeweils dreimal 10 Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur. Während des Waschens wird der Fluorophor-gekoppelte Sekundärantikörper in einem Reaktionsröhrchen auf die gleiche Weise verdünnt, wie dies zuvor mit dem Primärantikörper geschehen ist.

Entfernen Sie nach dem Waschen den Waschpuffer mit einer Kunststoffpipette und fügen Sie 250 Mikroliter Sekundärantikörperlösung pro Vertiefung hinzu. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 90 Minuten inkubieren. Nach abgeschlossener Inkubation die Antikörperlösung mit einer Kunststoffpipette entfernen. Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit Waschpuffer 2 auf die gleiche Weise wie mit Waschpuffer 1.

Während dieser Wäsche verdünnen Sie den DAPI-Fleck in 0,1 molaren PB, um eine Konzentration von 1 bis 2000 zu erreichen. Nachdem Sie den Waschpuffer von der Platte entfernt haben, fügen Sie 250 Mikroliter DAPI-Lösung hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Schüttler.

Nachdem Sie die DAPI-Lösung mit einer Kunststoffpipette entfernt haben, verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um 500 Mikroliter 0,1 molaren PB pro Vertiefung hinzuzufügen. Legen Sie einen Objektträger unter ein Stereoskop. Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um drei separate Tropfen mit 0,1 molaren PB auf den Objektträger zu geben. Legen Sie mit dem Pinsel eine Scheibe pro Tropfen auf die Folie, glätten Sie die Scheiben und richten Sie sie aus.

Nachdem alle Scheiben richtig positioniert sind, verwenden Sie ein Papiertaschentuch, um überschüssiges PB zu entfernen, und trocknen Sie vorsichtig, ohne die Scheiben vollständig zu trocknen. Geben Sie dann 80 Mikroliter Einbettmedium auf den Objektträger und decken Sie ihn vorsichtig mit einem Deckglas ab, um die Gehirnschnitte einzubetten.

Decken Sie die Objektträger ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden, und lassen Sie sie ein bis zwei Stunden im Abzug trocknen, und bewahren Sie sie dann in einer Objektträgerbox bei 4 Grad Celsius auf, bis sie für die konfokale Mikroskopie bereit sind.

Nachdem Sie virtuelles Gewebe des gesamten Gehirnschnitts für verschiedene Kanäle erfasst haben, wie im Manuskript beschrieben, laden Sie alle einzelnen Kanäle für ein Bild in Fiji, indem Sie auf Datei und dann auf Öffnen klicken. Verwenden Sie dann das Freihandauswahlwerkzeug, um eine Hemisphäre im DAPI-Kanal abzugrenzen. Klicken Sie auf Bearbeiten, dann auf Auswahl und dann auf Maske erstellen, um eine Maske des ausgewählten Bereichs zu erstellen.

Klicken Sie dann auf Analysieren und dann auf Partikel messen, um die mittlere Fluoreszenzintensität für einzelne Kanäle zu bestimmen, und stellen Sie sicher, dass Sie verschiedene Kanäle auswählen, um die mittleren Fluoreszenzintensitätswerte für jeden Kanal zu bestimmen.

Kopieren Sie danach die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in eine Tabelle. Um die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in einem Interessenbereich zu bestimmen, grenzen Sie den Bereich mit dem Freihandauswahlwerkzeug ab.