Messung der Proteasomaktivität in verschiedenen subzellulären Kompartimenten des Rattengehirns

Beginnen Sie mit subzellulären nukleären und synaptischen Fraktionen, die aus der lateralen Amygdala des Gehirns von Kontroll- und angstkonditionierten Ratten entnommen werden.

Jede subzelluläre Fraktion enthält unterschiedliche Konzentrationen von 20S-Proteasomen, dem katalytischen Kern des Proteasom-Komplexes, der für den Abbau unerwünschter zellulärer Proteine verantwortlich ist.

Geben Sie einen Assay-Puffer mit ATP und einem fluorogenen Peptidsubstrat zu den Proben und inkubieren Sie.

In Gegenwart von ATP spaltet das Proteasom das fluorogene Peptid und setzt freie fluorogene Moleküle frei.

Messen Sie mit einem Plattenleser die Fluoreszenzintensität in regelmäßigen Abständen.

Quantifizieren Sie die Fluoreszenz, indem Sie sie mit bekannten Standardkonzentrationen des fluorogenen Moleküls vergleichen.

Die Fluoreszenzintensität ist proportional zur Proteasomaktivität in der Probe.

Eine erhöhte Proteasomaktivität in der Kernfraktion von angstkonditionierten Ratten deutet auf Veränderungen in der gedächtnisbezogenen Genexpression hin, während eine verminderte Aktivität in der synaptischen Fraktion auf Veränderungen in der synaptischen Proteinexpression hinweist, die für die Aufrechterhaltung des Langzeitgedächtnisses notwendig sind.

Um den Assay einzurichten, erwärmen Sie den Plattenleser auf 37 Grad Celsius und halten Sie ihn während des Laufs. Stellen Sie die Anregung auf 360 Nanometer und die Emission auf 460 Nanometer ein. Wenn die verwendete 96-Well-Platte klar ist, stellen Sie die Optikposition auf Unten. Wenn eine dunkle 96-Well-Platte verwendet wird, stellen Sie die Position der Optik auf Oben. Programmieren Sie einen kinetischen Lauf mit einer Zeit von 2 Stunden, der alle 30 Minuten gescannt wird.

Rekonstituieren Sie den im Kit enthaltenen 20s 10x Assay-Puffer mit 13,5 Millilitern Reinstwasser. Fügen Sie 14 Mikroliter 100 millimolare ATP zu dem nun 1x Puffer hinzu. Dies erhöht die Proteasomaktivität in den Proben erheblich und verbessert die Zuverlässigkeit des Assays. Rekonstituieren Sie den im Kit enthaltenen AMC-Standard mit 100 Mikrolitern DMSO. Führen Sie Schritte mit dem AMC-Standard im Dunkeln oder bei schlechten Lichtverhältnissen aus, da der Standard lichtempfindlich ist.

Erstellen Sie eine Standardkurve von AMC aus einer Reihe von hohen bis niedrigen AMC-Konzentrationen. Diese Kurve wird für die Kalibrierung von Platten-Readern und die Analyse der Proteasomaktivität in den homogenisierten Proben verwendet. Rekonstituieren Sie das im Kit enthaltene Proteasomsubstrat mit 65 Mikrolitern DMSO. Führen Sie diesen Schritt auch im Dunkeln oder bei schlechten Lichtverhältnissen durch, da der Untergrund lichtempfindlich ist.

Erstellen Sie dann eine Verdünnung des Proteasomsubstrats von 1 bis 20 in einem neuen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung eines 20-S-Assay-Puffers. Geben Sie eine normalisierte Menge der gewünschten Proben auf eine 96-Well-Platte. Führen Sie jede Stichprobe doppelt aus. Die benötigte Probenmenge variiert je nach Gewebevorbereitung. Im Allgemeinen sind 10 bis 20 Mikrogramm für jede subzelluläre Fraktion ausreichend.

Bringen Sie das Volumen der Probenvertiefung mit Reinstwasser auf 80 Mikroliter. Die zugegebene Menge hängt von der Menge der zugegebenen Probe ab. In zwei getrennten Brunnen allein 80 Mikroliter Wasser hinzufügen. Dabei handelt es sich um die Untersuchungsleerproben. Geben Sie 10 Mikroliter 20 S Assay-Puffer in jede Vertiefung, einschließlich der Assay-Leerproben. Verwenden Sie einen Repeater oder eine automatisierte Pipette, um ein konsistentes Assay-Volumen über die Wells hinweg zu gewährleisten.

Schalten Sie das Licht aus oder begeben Sie sich in einen dunklen Raum. Geben Sie alle 100 Mikroliter verdünnter AMC-Standards in eine neue Vertiefung, wobei Sie für jeden Standard eine einzelne Vertiefung verwenden. Verwenden Sie im Dunkeln einen Repeater oder eine automatisierte Pipette, um 10 Mikroliter verdünntes Proteasomsubstrat in Vertiefungen mit Proben- und Assay-Rohlingen hinzuzufügen, jedoch nicht den AMC-Standard. Legen Sie die Platte in den Plattenleser und starten Sie den kinetischen Lauf.