Analyse von Amyloid-Strukturen in einem Gewebeschnitt mit Hilfe der Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie

Nimm einen Gewebeschnitt mit Amyloid-Aggregaten, die abnormale Proteinablagerungen darstellen.

Das Gewebe ist mit dem Fluoreszenzfarbstoff Heptamer-Formylthiophenessigsäure oder hFTAA gefärbt, der spezifisch an Beta-Faltblattstrukturen von Amyloidfibrillen bindet.

Nehmen Sie den Objektträger mit einem konfokalen Mikroskop auf, das mit einer Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie ausgestattet ist, die die Fluoreszenzlebensdauer der Farbstoffmoleküle misst.

Optimieren Sie die Mikroskopeinstellungen für eine effektive Anregung der Farbstoffmoleküle.

Wenn Laserlicht das Gewebe beleuchtet, regt hFTAA an und fluoresziert.

Eine stärkere Farbstoffbindung in kompakten Strukturen führt zu längeren Lebensdauern, während eine schwächere Farbstoffbindung in weniger kompakten Strukturen zu kürzeren Lebensdauern führt.

Später generiert die Software ein farbcodiertes Bild des Aggregats.

Farben wie Rot und Gelb erscheinen in der Peripherie, was auf eine kürzere Fluoreszenzlebensdauer hinweist, die weniger kompakte, instabile Amyloidstrukturen widerspiegelt.

Während Farben wie Blau und Grün im Kern längere Fluoreszenzlebensdauern repräsentieren und kompaktere und stabilere Amyloidstrukturen widerspiegeln.

Tauchen Sie die Schnitte am Tag der Färbung jeweils 10 Minuten lang in aufeinanderfolgende Bäder mit 99 % Ethanol, 70 % Ethanol, dH_2O und PBS und lassen Sie die Gewebeschnitte dann unter Umgebungsbedingungen trocknen. Während das Gewebe trocknet, bereiten Sie eine Arbeitslösung aus HFTAA vor, indem Sie das Material 1 auf 10.000 in PBS verdünnen. Wenn das Gewebe trocken ist, geben Sie Tröpfchen der HFTAA-Arbeitslösung zu jedem Gewebeabschnitt, um ihn zu bedecken. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Spülen Sie die Färbelösung mit 500 Mikrolitern PBS ab und tauchen Sie den Objektträger dann 10 Minuten lang in das PBS-Bad. Nachdem Sie den Schnitt unter Umgebungsbedingungen trocknen ließen, montieren Sie ihn mit Fluoreszenz-Eindeckmedium. Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht absetzen.

Der Amyloid-Nachweis kann direkt nach der Montage oder auch ohne Montage durchgeführt werden. Wenn das Ziel des Experiments jedoch darin besteht, qualitativ hochwertige spektrale Informationen zu sammeln, wird eine Inkubation über Nacht bevorzugt.

Schalten Sie das Mikroskop in den FLIM-Modus, stellen Sie die Lochblende auf 20, die Anregungswellenlänge auf 490 Nanometer und die Laserintensität auf 0,5 % ein. Verwenden Sie gepulste Laser mit 40 Megahertz. Richten Sie in der FLIM-Software die Photonenzählung über 550 Nanometer ein. Verfolgen Sie im Fenster Anzeigeparameter die Photonenzählung, bis die maximale Anzahl bei etwa 4.000 Photonenzahlen liegt. Speichern Sie die Datei und exportieren Sie sie als SPC-Bild.