Visualisierung der Proteinkinase-A-Aktivität in einer Maus mit Hilfe der Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie

Befestigen Sie eine anästhesierte Maus mit einem Schädelfenster über ihrem motorischen Kortex auf einem Laufband.

Die Maus exprimiert einen Protein-Kinase-A-Reporter in kortikalen Neuronen.

Positionieren Sie das Laufband unter einem Zwei-Photonen-FLIM-Objektiv.

Füge einen Wassertropfen zwischen dem Objektiv und dem Schädelfenster hinzu.

Lassen Sie die Maus aufwachen und sich an das Laufband gewöhnen.

Lokalisieren Sie mithilfe der Hellfeldbeleuchtung den Bildbereich. Schließen Sie das Mikroskopgehäuse, um externes Licht zu blockieren.

Stellen Sie die Bildgebungsparameter ein, initiieren Sie die Drehung des Laufbands, um die Fortbewegung zu induzieren, und beginnen Sie mit der Bildgebung.

Die erzwungene Fortbewegung aktiviert PKA, das den Reporter phosphoryliert und seine Donor- und Akzeptorfluorophore näher zusammenbringt.

Das Mikroskop steuert einen Infrarotlaser, der den Donor dazu anregt, Energie auf den Akzeptor zu übertragen, wodurch die Fluoreszenzlebensdauer des Donors verkürzt wird.

Wenn die Fortbewegung stoppt, kehren PKA und der Reporter in ihren inaktiven Zustand zurück, wodurch der Energietransfer verringert und die Fluoreszenzlebensdauer des Donors verlängert wird.

Analysieren Sie die Bilder, um die kortikalen PKA-Spiegel in Ruhe und Fortbewegung zu vergleichen.

Mindestens zwei Wochen nach der Installation des Schädelfensters stellen Sie die Wellenlänge des Zwei-Photonen-Anregungslasers auf 960 Nanometer ein und bestätigen Sie eine fehlende Reaktion auf das Einklemmen der Zehen in der anästhesierten Versuchsmaus. Platzieren Sie die betäubte Maus auf dem motorisierten Laufband und montieren Sie die Kopfplatte der Maus an der Kopfplattenhalterung des Laufband-Setups. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädelfensterdeckglases mit 70 % Ethanol und platzieren Sie das motorisierte Laufband unter dem 2pFLIM-Objektiv.

Tragen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser zwischen die Schädelfensterabdeckung im Objektiv auf und lassen Sie die Maus mindestens 10 Minuten lang aufwachen und sich an die Umgebung des Laufbandes und des Mikroskops gewöhnen. Navigieren Sie zur Injektionsstelle unter Epi-Beleuchtung und dokumentieren Sie die Referenzmerkmale unter Hellfeld, um die Bildgebung desselben interessierenden Bereichs bei nachfolgenden Bildgebungssitzungen zu unterstützen.

Schalten Sie die epi-illumination-Lichtquelle aus. Schließen Sie das Gehäuse des 2pFLIM-Mikroskop-Rigs ein. Um die Photomultiplier-Röhren des 2pFLIM-Mikroskops zu aktivieren, schalten Sie die Spannungssteuerung des Hardware-Befehls ein. Um ein 2pFLIM-Bild mit Z-Stapel zu erfassen, legen Sie die Bildgröße auf 128 x 128 Pixel fest. Die Scangeschwindigkeit beträgt 2 Millisekunden pro Zeile, das Sichtfeld 90 bis 100 Mikrometer im Bild, durchschnittlich drei Bilder.

Passen Sie die Imaging-Einstellungen basierend auf der Vorbereitung und der Hardwarekonfiguration an. Und überprüfen Sie das aufgenommene Bild in der FLIM-Ansicht. Verwenden Sie ein verkleinertes Sichtfeld, eine verringerte Scangeschwindigkeit, eine höhere Laserleistung und eine größere Anzahl von Bildern, die gemittelt werden sollen, um die Anzahl der integrierten Photonen zu erhöhen und den Fehler bei der Lebensdauerschätzung nach Bedarf zu reduzieren.

Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Photonen pro interessierendem Bereich erhalten. Eine praktikable integrierte Fotozählung für ein positives Soma in Sicht liegt bei etwa 1.000 bis 10.000 Photonen.

Wenn das Bild optimiert wurde, erfassen Sie in regelmäßigen Abständen mindestens 15 Minuten lang auf dem Laufband wiederholte Z-Stapel-Grundlinienbilder mit einer Geschwindigkeit von 0. Stellen Sie dann die Laufbanddrehung während der Aufnahme von 2pFLIM-Bildern 15 Minuten lang auf etwa Zentimeter pro Sekunde ein, gefolgt von einer mindestens 20-minütigen Bildaufnahme nach dem Ausschalten der Laufbanddrehung, um die Dauer der Proteinkinase-A-Aktivität nach Beendigung der erzwungenen Fortbewegung zu beurteilen.

Für die 2pFLIM-Bildanalyse öffnen Sie die Bilder in der Filmansicht und klicken Sie auf die Felder für den minimalen und maximalen Bereich der Einzelphotonenzählung, um die entsprechenden Werte für den minimalen und maximalen Einzelphotonenzählbereich einzugeben. Klicken Sie auf das Feld für den Wert für die Zeit 0, um den Wert für die Zeit 0 einzugeben, und klicken Sie auf das Feld für den minimalen Schwellenwert für die Lebensdauer der Leuchtdichte, um den gewünschten Schwellenwert zwischen 5 und 30 Photonen einzugeben.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Gruppe und weisen Sie einen Experimentgruppennamen zu, um eine Gruppe zu generieren, die die Daten aus jedem hinzugefügten FLIM-Bild kombiniert. Klicken Sie im Steuerungsmodul für den Interessenbereich auf Region of Interest, und zeichnen Sie einen Interessenbereich um ein Alpha-positives T-ACCR-Soma. Verschieben Sie die untere und obere Z-Grenze in den Schiebereglern für den Z-Stapel, um den Z-Stapelbereich zu verringern und die Signalkontamination durch Hintergrundphotonen und andere Z-Dips zu minimieren, und klicken Sie auf das Pluszeichen, um das FLIM-Bild zur Gruppe hinzuzufügen.

Klicken Sie auf calc, um die mittlere Lebensdauer des Lebensdauerschätzungsfehlers für den interessierenden Bereich zu berechnen, und öffnen Sie die nächste Datei in der 2pFLIM-Bildgebungsserie. Messen Sie im Laufe der Zeit in jedem aufeinanderfolgenden Bild dasselbe alpha-positive T-ACCR-Soma und passen Sie den interessierenden Bereich um das Soma nach Bedarf an. Wenn alle Bilder analysiert wurden, wählen Sie im Modul Gruppensteuerungen die Delta-Mittelwerte Photonenemissionszeit Delta-Mittelwert der Photoemission T0 aus und klicken Sie auf das Feld für die Basisliniennummer, um den Index für die interessierenden Bilder einzugeben und die Bilder zu definieren, die zur Berechnung der Basislebensdauer verwendet werden.

Klicken Sie dann auf Diagramm, um ein Diagramm zu erstellen, das die FLIM-Reaktion auf die T-ACCR-alpha-positive Aktivität während des Experiments in den definierten interessierenden Regionen enthält, um einen Vergleich der Proteinkinase A-Aktivität während der Fortbewegung der Kinase in verschiedenen interessierenden Regionen zu ermöglichen.