Selektive Einzelneuronen-Laserablation an einer Zebrafischlarve mit einem konfokalen Mikroskop

Nehmen Sie eine vorgewärmte Agaroselösung, die eine anästhesierte transgene Zebrafischlarve enthält, die ein fluoreszierendes Protein in spinalen Motoneuronen exprimiert.

Bringen Sie die Larve in eine Glasschale mit einem Agarosering.

Drehen Sie die Larve mit einem Mikroskop auf die Seite. Lassen Sie dann die Agarose sich verfestigen und die Larve immobilisieren.

Fügen Sie einen Puffer mit Anästhetikum hinzu, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.

Stellen Sie die Schale auf den konfokalen Mikroskoptisch und lokalisieren Sie mit Hellfeld-Bildgebung die dorsale Rückenmarksregion.

Wechseln Sie in den Fluoreszenzmodus, um fluoreszierende Motoneuronen zu visualisieren.

Bestimmen Sie die zentrale Z-Ebene des Zellsomas für eine präzise Ablationszielung.

Konfigurieren Sie Bildgebungsparameter für eine hochauflösende Erfassung bei gleichzeitiger Minimierung von Lichtschäden.

Sobald die gewünschte Z-Ebene scharf ist, führen Sie eine Ablation an der Zielneuronenregion mit einem fokussierten ultravioletten Laser durch.

Die Laserenergie stört zelluläre Strukturen, was zu Fluoreszenzverlust und Zelltod führt. Der irreversible Fluoreszenzverlust bestätigt eine präzise Ablation, ohne die umgebenden Zellen zu beeinträchtigen.

Ziehe mit einer verstellbaren Pipette eine Larve heraus und lass sie bis zum unteren Ende der Spitze sinken. Lassen Sie die Larve in einer minimalen Menge Flüssigkeit in die vorgeheizte Agarose fallen, ziehen Sie dann den Fisch mit Agarose hoch und geben Sie ihn schnell in eine zuvor vorbereitete 35-Millimeter-Glasbodenschale. Positionieren Sie das Tier oder mehrere Tiere unter einem Präpariermikroskop mit einem normalen Pinsel in der Agarose auf den Seiten, so dass Körper und Schwanz flach sind.

Lassen Sie den eingebetteten Fisch 10 bis 15 Minuten ruhen, bis die Agarose fest ausgehärtet ist. Verwenden Sie dann etwa zwei Milliliter Eiwasser mit Trikan, um die 35-Millimeter-Petrischale vorsichtig aufzufüllen. Platzieren Sie die Petrischale mit einer eingebetteten Larve auf dem konfokalen Mikroskoptisch und fokussieren Sie sich mit Hellfeldbeleuchtung und 40-facher Vergrößerung auf die dorsale Seite des Rückenmarks des Tieres. Wechseln Sie zu einer geeigneten Fluoreszenzeinstellung und visualisieren Sie die interessierende Struktur, um zu bestätigen, dass alle Bildgebungsparameter den Anforderungen für die nachfolgende Ablation entsprechen.

Um die Dicke der Struktur für die UV-Laserablation zu bestimmen, verwenden Sie den Z-Antrieb, um die Ober- und Unterseite der interessierenden Struktur zu überprüfen, indem Sie manuell nach oben und unten fokussieren. Zeichnen Sie die Z-Ebene, die abgetragen werden soll, manuell auf, z. B. die Mitte der Zelle. Um eine Laserablation durchzuführen, starten Sie den FRAP-Assistenten, indem Sie auf das Dropdown-Menü oben im Software-Menü klicken.

Bestimmen Sie im neuen Fenster die Bildparameter für den Ablationsansatz, indem Sie das Format, die Scangeschwindigkeit und die Mittelwertbildung auswählen. Wenn die Z-Ebene für die Ablation noch nicht ausgewählt wurde, drücken Sie die Live-Taste und fokussieren Sie durch die Probe, bis die fluoreszierende Struktur oder die gewünschte Z-Ebene, die abgetragen werden soll, scharf ist. Sobald die allgemeinen Bildparameter eingestellt sind, greifen Sie auf den Bleichschritt zu, um die spezifischen Ablationskomponenten zu steuern, und aktivieren Sie dann den 405-Nanometer-Laser, indem Sie ihn für den Bleichvorgang aktivieren.

Verwenden Sie als Nächstes die Zoom-in-Option, um die Bleichintensität bei ausgewähltem ROI zu maximieren, indem Sie das Scanfeld reduzieren und so die Verweilzeit maximieren. Wählen Sie einen oder mehrere ROIs für die Ablation aus, indem Sie eines der Zeichenwerkzeuge im Bildaufnahmefenster verwenden. Zielen Sie zum Beispiel mit dem kreisförmigen Zeichenwerkzeug von etwa 4 bis 8 Mikrometern auf den Axonhügel.

Nachdem Sie den ROI festgelegt haben, wählen Sie die Schaltfläche Zeitverlauf und bestätigen Sie die Anzahl der Zyklen, in denen die ROIs gescannt und abgetragen werden. Wählen Sie die Rahmen vor und nach dem Bleichen nach Belieben, um kurz vor und unmittelbar nach dem Bleichvorgang einen Überblick über das gesamte Bild zu erhalten.

Mit diesen Einstellungen können Forscher mehrere Verfeinerungsebenen vornehmen. Durch die Anpassung der Laserleistung, der Scangeschwindigkeit, der Zeilenmittelwertbildung, der Größe des interessierenden Bereichs und der Wiederholungen bietet diese Technik ein hohes Maß an Freiheit, um Stress oder Tod in einzelnen Zellen zu verursachen.

Nachdem Sie alle erforderlichen Ablationsparameter festgelegt haben, drücken Sie auf Experiment ausführen und überwachen Sie die Effizienz der Ablation. Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll.