Zell-Capture mit einer mikrofluidischen Vorrichtung

Die Geräte, so wie wir sie vorbereitet haben, sind in Kits mit 10 oder 20 Stück verpackt, und wenn sie ankommen, werden sie kalt in einer Schachtel verschickt und das Kit enthält alle Komponenten, die Sie zum Ausführen benötigen. Das Experiment in dem Kit ist, ist ein Päckchen mit allen Spritzen und Puffern, die bei Raumtemperatur bleiben können. Es gibt auch eine Kopie des Protokolls, dem wir in diesem Experiment folgen werden.

Es gibt auch eine Kühlbox, in der sich die eigentlichen Geräte und alle laufenden Puffer befinden, die gekühlt werden müssen. In der Regel werden die Kits in Gruppen von 10 oder 20 Stück verpackt. Bei Nichtgebrauch sollten die Kits gekühlt werden.

Jede Spritze und jede Kit-Komponente wird sorgfältig beschriftet und die Etiketten entsprechen der Tabelle im Protokoll, dem wir folgen. Es gibt also keine Unklarheiten, welche Spritzen- oder Kit-Komponente in den einzelnen Schritten verwendet werden soll. Nachdem wir die Geräte ausgepackt und in eine biologische Sicherheitswerkbank gelegt haben, werden wir das Verfahren durchführen, bei dem die Neutrophilen isoliert und für nachgelagerte genomische Anwendungen lysiert werden, denn wir werden es sein, weil der Lebensretter, den wir erhalten, für die Isolierung verwendet wird, oder wir werden die RNA aus dem Zelllysat extrahieren.

Aus diesem Grund wollen wir sicherstellen, dass unser Bereich sauber ist, nicht nur im sterilen Sinne, sondern auch frei von allen RNAs, die typischerweise in der Umwelt vorhanden sind. Daher ist es sehr wichtig, dass Sie Ihren gesamten Bereich und Ihre Geräte mit der Lösung abwischen, die RNAs zerstört. In der Regel wischen wir also alle unsere Werkzeuge und unsere Arbeitsflächen mit RNA SAP oder RNAs ab, die Sie von einer Reihe von Herstellern erhalten können.

Das Gerät wird in einem Heißsiegelbeutel geliefert. Jedes Gerät ist versiegelt und mit einem Barcode versehen. Sie sollten, Sie sollten sich diesen Barcode notieren, wenn Sie mit klinischen Proben arbeiten.

Das Gerät wird also entsiegelt, die Abdeckung abgenommen und in die Halterung des Pumpenverteilers gelegt. Bei der Blutprobe, die wir verwenden, handelt es sich um eine Vollblutprobe. Wir werden es durch die Standard-Ein-Mil-BD-Spritze fließen lassen, und diese ist mit Spritze eins beschriftet.

In der Regel wird die Spritze aus der Packung genommen und die Kappe vorsichtig vom Blutröhrchen entfernt. Und was Sie tun, ist, dass Sie 700 Mikroliter oder 0,7 Mil Blut fallen lassen und die Hälfte davon oder 350 Mikroliter in ein 1,5-Mil-Röhrchen injizieren. Danke. Auf diese Weise kann Ihr, Ihr Blut zur weiteren Verarbeitung weitergeleitet werden.

Ihr, Ihre Tube mit Blut kann weitergegeben werden und trotzdem haben Sie im Falle eines Geräteausfalls noch mehr Blut übrig. Was wir jetzt also tun werden, ist, dass wir die Spritze, in der sich Blut befindet, auf diese Nadel laden, die mit diesem Gerät mit einem Stück Schlauch verbunden ist. Wir wollen sehr mit dem mikrofluidischen Isolationsgerät sein.

Wir möchten sehr vorsichtig sein, dass keine Luftblasen in das Gerät oder in das Gerät gelangen oder das Gerät nicht richtig funktioniert. Normalerweise nehmen wir die Spritze, drücken auf den Kolben und geben die Flüssigkeit auf die Oberseite des Geräts, um sicherzustellen, dass sie vollständig verheiratet ist, bevor wir die gesamte Flüssigkeit ausgestoßen haben. Wir halten an, entfernen vorsichtig den Spritzenkörper von der Nadel und füllen im Grunde die Nadelspitze oder den Köderanschluss der Nadel mit dem restlichen Puffer, der sich in dieser Spritze befindet.

Den entsorgen wir. Dann nehmen wir unsere Spritze mit Blut und stecken sie in diese Ködernabe. Achten Sie darauf, kein Blut zu verschütten und keine Luftblasen einzuführen.

Es ist am besten, einen Kemo zu verwenden, der den Körper der Spritze und den Schlauch hält, falls Blut verschüttet wird. Sobald die Spritze mit dem Schlauchgehäuse oder der Nadel verbunden ist, klopfen wir ein paar Mal scharf darauf, um alle Luftblasen zu entfernen, die sich möglicherweise am Anschluss befinden. Diese Spritze wird dann auf die Spritzenpumpe und dann auf die Spritzenpumpe geladen und mit der Feststellschraube gesichert.

Die Spritzenpumpe ist eingeschaltet und bereits auf unsere Durchflussbedingungen voreingestellt. Wir werden dieses Blut mit 30 Mikrolitern pro Minute durch das Gerät fließen lassen. Sobald der Spritzenkörper in die Spritzenpumpe geladen ist, drücken wir den Knopf am beweglichen Kolbenarm und schieben ihn nach unten, bis er die Oberseite des Kolbens berührt und beginnt, Flüssigkeit durch die Spitze des Kolbens herauszudrücken.

Es ist eine stumpfe Spitze aus Edelstahl. Sobald wir wissen, dass das System vorbereitet ist, drücken wir auf Ausführen. Um den Blutfluss zu starten, drücken Sie Stopp, um ihn zu stoppen, und dann nehmen Sie ein sauberes 1,5-mil-Zentrifugenröhrchen oder ein Fendorröhrchen und wir werden vorsichtig den Stecker ziehen.

Ziehen Sie nur einen Stecker und ziehen Sie den Schlauch aus einem Anschluss des Geräts. Sobald dieser Schlauch ausgesteckt ist, führen wir ihn in den 1,5-mil-Fendor-Schlauch ein. Wir drücken auf Run, um den Blutfluss wieder zu starten.

Und wenn wir sehen, dass sich ein Tropfen Blut bildet, stoppen wir die Pumpe und führen sie in den Einlass ein, den wir gerade im Gerät geöffnet haben. Wir drücken auf Run, um den Blutfluss zu starten, und stellen einen Timer auf fünf Minuten. Wir wollen sicherstellen, dass das Blut alle Kammern gleichmäßig füllt und dass es keine offensichtlichen Luftblasen im Gerät gibt.

Wenn es Luftblasen gibt, die den Durchfluss in eine der Kammern blockieren, können Sie eine Pinzette nehmen und sie entlang der kleinen Kanäle führen, die zu den Auffangkammern führen, oder der kleinen Kanäle, die aus den Auffangkammern austreten. Dieses Gerät füllt sich gut, also drücken Sie nach fünf Minuten Stopp an der Spritzenpumpe, um den Blutfluss zu stoppen, lösen Sie die Klemme für die Spritze und nehmen Sie sie aus dem Spritzenpumpenhalter. Dann werden wir die Spritze Nummer drei verwenden, die mit nukleasefreiem PBS geladen ist. Wir werden im Grunde wieder sicherstellen, dass die Oberfläche des Geräts verheiratet ist, um Luftblasen zu vermeiden, wir werden auf die Spritze klopfen, um welche herzustellen, stellen Sie sicher, dass sich alle Luftblasen oben auf dem Spritzenkörper befinden.

Lösen Sie den Arm an der Spritzenpumpe und setzen Sie die Drei-Mühlen-Spritze in die Pumpe ein. Ziehen Sie ihn fest und drücken Sie dann den Kolben nach unten, bis er den Kolben der Spritze berührt. Wir drücken Run und warten darauf, dass Flüssigkeit das Gerät ansaugt, und wir warten, bis ein Tröpfchen an der Spitze der Edelstahlnadel zu sehen ist.

Wenn Sie sehen, dass sich ein Tropfen bildet, stoppen Sie die Pumpe. Wir werden das Blut herausnehmen, die Edelstahlspitze, die das Blut enthält. Wir werden den Waschpuffer einfügen und auf Run drücken.

Und wir lassen das fünf Minuten lang laufen. Und Sie sollten ein sauberes Tuch nehmen und nur eine kleine Menge Blut aufwischen, die sich am Einlass oder am Auslass befinden kann. Nach fünf Minuten, in denen Sie den Waschpuffer durch das Gerät laufen lassen, sollte das Gerät vollständig von jeglichem Blut befreit sein und Sie können sehen, dass im Grunde kein rotes Blut mehr im Gerät vorhanden ist. Das Gerät sieht klar aus. Was wir also tun werden, ist, dass wir nach den fünf Minuten den Betrieb des Waschpuffers stoppen werden.

Und wieder nehmen wir die Spritze von der Spritzenpumpe. Wir werden das 1,5-mil-Mikrozentrifugenröhrchen direkt auf dem flexiblen Auslassschlauch verschließen. Und wir werden das Röhrchen, das Mikrozentrifugenröhrchen, vorsichtig anheben und den Abfallschlauch aus dem Gerät herausziehen.

Wir werden das in einem Behälter für biologische Gefahrstoffe wegwerfen. Im Kit befindet sich ein neuer Auslassschlauch, der eigentlich aus Teflon besteht. Er hat wieder eine Spitze aus Edelstahl.

Wir werden den alten Auslassschlauch durch diesen neuen Auslassschlauch ersetzen. Wir werden diesen Auslassschlauch nehmen und versuchen, ihn um eine Art U- oder V-Form zu biegen. Und dann ist auch noch eine Kaya Shredder Säule im Lieferumfang enthalten, diese schert die DNA und homogenisiert im Grunde dein Zellleben.

werden also die violette Kappe der Schreddersäule öffnen und den Auslassschlauch in die Kay Schreddersäule einsetzen. Wir nehmen aus dem Kit die zweite Spritze heraus, die besagt, dass wir sie für RLT verwenden werden. Es handelt sich um eine Standard-BD-Spritze mit einer 22-Gauge-Spitze aus Edelstahl.

Wir werden das verwenden, um 350 Mikroliter Standard-RLT aus Kyogen in das Gerät zu injizieren. Da das Gerät ein Totvolumen von etwa 50 Mikrolitern hat, wollen wir das RLT injizieren, aber hinter dem RLT wollen wir einen Luftstopfen injizieren, um das Totvolumen des Geräts in die Chi-Schreddersäule abzulassen. Die Art und Weise, wie wir das machen, ist, dass wir unsere Spritze nehmen, ziehen, 350 Mikroliter Luft aufsaugen und dann 350 Mikroliter oder 0,35 mil RLT anschließen, und die RLT befindet sich nun am Boden der Spritze.

Widerstehen Sie der Versuchung, die Spritze umzudrehen und die Luft einzuspritzen. Die Luft ist da, um sicherzustellen, dass wir das gesamte RLT in unsere Kay-Schredderkolonne bekommen. Wir werden den Schlauch aus dem Waschpuffer herausziehen.

Wir werden unsere Spritze mit dem RLT einführen und den RLT langsam über einen Zeitraum von etwa 30 Sekunden in das Gerät injizieren, wobei wir sicherstellen, dass der Auslassschlauch seinen Abfall in die Chi-Schreddersäule ausstößt. Sobald Luft in das Gerät injiziert wird, drücken Sie auf den Plumer und warten, bis die gesamte Flüssigkeit in die Kay Shredder-Säule abgegeben wird. Wir drehen die Kay-Aktenvernichtersäule auf einer Mikrozentriersäule mit einer Waage von 15.000 U/min oder einer maximalen Drehzahl an einer Tisch-Mikrozentriersicherung für zwei Minuten.

Nachdem wir die Säule zwei Minuten lang gedreht haben, nehmen wir die Probe heraus, die sich jetzt in RLT befindet, und legen sie in eines der mitgelieferten Kryo-Fläschchen mit violetter Kappe. Wenn Sie mit einer klinischen Probe arbeiten, nehmen Sie Proben aus diesen Kryo-Fläschchen, die Sie zu Beginn des Experiments beschriften. Hier ist das Lysat im Kryo-Fläschchen.

Dieses Kryo-Fläschchen wird sofort in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad AC C gestellt und für den Versand oder die spätere RNA-Extraktion gelagert. Dies ist also ein alternatives Protokoll für die Isolierung von Neutrophilen. Anstatt die Zellen mit RLT-Puffer zu lysieren, werden wir sie mit einer standardmäßigen histologischen Färbung färben.

Ein Fleck. Also nehmen wir das mit dem Gerät versiegelte Gerät aus dem Beutel und packen es wieder aus, notieren uns die Chargennummer auf dem Gerät und platzieren die Petrischale. Im Petrischalenhalter.

Wir nehmen die eine Mil-Spritze aus der Beutelspritze Nummer eins, laden sie mit 700 Mikrolitern Blut und injizieren die Hälfte davon, 350 Mikroliter, in ein DPH-Röhrchen. Das lassen wir beiseite. Nehmen Sie die Spritze vier, die den Schlauch hat, den wir zur Auswahl verwenden werden, und injizieren Sie das Blut in das Gerät.

Halten Sie die Basis der Nadel von der Spitze des Schlauchs auf chemische Weise. Nehmen Sie den Spritzenkörper ab und füllen Sie den Köder. Der Adapter würde diese Spritze puffern und entsorgen.

Wir führen die bluthaltige Spritze mit dem Chem-Tuch in die Nadel ein, um eventuelle Überschwängungen aufzufangen. Wir klopfen auf die Spritze, um alle Luftblasen an der Verbindung zwischen der Nadel und dem Spritzenkörper zu entfernen. Wir laden die Spritze in die Spritzenpumpe, wir entlüften den Schlauch, indem wir den beweglichen Arm der Spritzenpumpe nach unten drücken.

Wir trennen den Schlauch von einer der Steckdosen des Geräts, dem Erfassungsgerät, und stecken ihn in einen 1,5-mil-Einorschlauch. Und dann fangen wir an, Blut fließen zu lassen, indem wir den Lauf auf die Spritzenpumpe drücken. Wir warten, bis sich ein Blutstropfen an der Edelstahlspitze bildet.

Sobald sich das Tröpfchen gebildet hat, drücken Sie Stopp, tupfen Sie das Blut ab, geben Sie es in das Gerät und drücken Sie auf Ausführen. Jetzt stellen wir einen Timer auf fünf Minuten. Okay, nachdem Sie fünf Minuten lang durch das Gerät geflossen sind, drücken Sie Stopp an der Spritzenpumpe und lassen Sie die Spritze los.

Und wir werden diese Spritze durch die Drei-Mil-Spritze ersetzen, die unseren Waschpuffer enthält, der nur ein XPBS ist. Auch hier möchten wir sicherstellen, dass die Oberseite des Geräts verheiratet ist, und dann entfernen wir die Nadelspitze, die das Blut oder den Pluslauf enthält. Beginnen Sie mit der Grundierung des Geräts.

Wir werden Tröpfchen bilden, wir führen sie in das Gerät ein und drücken Lauf, tupfen Sie das Blut am Einlass oder am Auslassschlauch ab und lassen es nach dem Waschschritt fünf Minuten lang fließen. Auch hier stoppen wir die Spritzenpumpe und entfernen die Spritze aus dem Pumpenhalter. Um eine standardmäßige GIM-Aufrechterhaltung durchzuführen, werden wir zunächst die Zellen reparieren und sie mit 100 % Methanol dehydrieren.

Wir haben also eine Spritze, eine Drei-Mil-Spritze, die mit Methanol vorgeladen ist. Auch hier werden wir die Spritze grundieren, sicherstellen, dass Methanol fließt, die Spritzenpumpe stoppen, sie in das Gerät einführen und auf "Run" drücken. Wir werden sie zwei bis vier Minuten lang in dieser Methanollösung fixieren.

Nach zwei bis vier Minuten Fixierung und Methanol stoppen wir die Pumpe, geben die Spritze mit Methanol frei und laden hier eine Spritze, eine Drei-Mil-Spritze mit eem sustain standard eem sustain von Sigma, verdünnt eins bis fünf in deionisiertem Wasser. Nachdem wir verdünnt hatten, luden wir in die Spritze und am Ende der Spritze befestigten wir einen 0,8-Mikron-Filter, um alle Partikel herauszufiltern, die in das Gerät gelangen und das Gerät verstopfen würden. Der Fleck für fünf bis 10 Minuten.

Und dann spülen wir mit dem Wasser von Deion i ab. Nach fünf bis 10 Minuten Färbung stoppen wir die Spritzenpumpe und tauschen die Spritze mit dem Färbepuffer gegen die Spritze aus, die deionisiertes Wasser enthält, wir waschen sie im Grunde aus, bis wir sehen, dass die blaue Farbe des SAI vom Gerät gewaschen wurde. Sobald das überschüssige Gim-Sustain aus dem Gerät gespült wurde, stoppen wir die Waschlösung.

Und dann werden wir die Wasserspritze aus dem Einlass entfernen. Dann nehmen wir den Auslassschlauch des Geräts. Wir werden den Schlauch am Ende mit unserer Pinzette greifen.

Dies ist ein flexibler Tigon-Schlauch, den wir wieder in den Einlass des Geräts einführen werden. Dies versiegelt das Gerät und hält die Zellen hydratisiert und ihre Morphologie intakt. Jetzt wird mein Kollege, Dr. John Hong Chang, ein alternatives Protokoll für die Isolierung von Zöliakie-4-positiven Lymphozyten zeigen, gefolgt von einer Immunfluoreszenzfärbung direkt im mikrofluidischen Gerät.

Mein Name ist Shong Hong und heute werde ich Ihnen die Zellfärbung in einem mikrofluidischen Gerät demonstrieren, in diesem Stadium kann ich Ihnen bereits gezeigt haben, wie Sie ein Mikro-Flic-Immunaffinitätsisolationsgerät verwenden, um Blutzellen spezifisch aus beispiellosem Vollblut zu isolieren. Zu seinem Zweck will er die Zellen läusen und aus diesen isolierten Zellen Protein- und DNA-Gehalt gewinnen. Nun, für die Zwecke meiner Forschung bin ich daran interessiert, die Zellen zu erhalten und dann die Zellzahl zu erhalten, zum Beispiel, um die Zöliakie-Vier-Zellzahl aus Vollblut zu erhalten und dies als Indikator für diagnostische Zwecke zu verwenden.

Das verwendete Gerät ist also dem von Ken sehr ähnlich. Es besteht aus einer geraden P-D-M-S-A-Kammer. Die Geometrie ist etwas anders, so dass die Operationsparameter leicht unterschiedlich sind, während im Allgemeinen die gesamte Operationsprozedur sehr ähnlich ist.

Ich überspringe also alle Schritte der Zellentnahme und des Spülens und springe direkt in den Schritt der Zellfärbung bei der Zellzählung. Hier habe ich also ein Gerät, das bereits aus halben Zellen besteht, die aus Vollblut gewonnen wurden, und das Gerät ist bereits mit PBS gespült. Die ausgehenden Zellen waren also bereits aus dem Gerät ausgewaschen und ich bereitete im Voraus eine Antikörpermischung vor, die speziell zur Markierung der Zellen verwendet wird, die in das Gerät isoliert wird.

Die Antikörperkonzentration, die wir hier verwendet haben, wurde also für die Färbung der Zellen mit sehr hoher Fluoreszenzintensität unter dem Fluoreszenzmikroskop optimiert. Das Verfahren ist also recht einfach. Wir laden die mit der Antikörperlösung gefüllte Spritze auf die Spritzenpumpe und stellen dann sicher, dass die Durchflussrate auf die richtigen Parameter eingestellt ist, die wir benötigen.

Und dann starten wir die Spritzenpumpe, beobachten das Ende des Schlauchs und stellen sicher, dass die Lösung bereits herauskommt, damit keine Blase mehr im Schlauch ist. Und dann können wir den Schlauch in das mikrofluidische Gerät stecken, in dem wir die Zellen einfangen lassen. Jetzt fließt also Antikörper in das Gerät, um die Zellen zu färben, die wir isoliert haben, in das Gerät, die Flussrate hier, ich verwende fünf Mikroliter pro Minute, aber abhängig von der Gerätegeometrie dort könnte es unterschiedliche Flussparameter geben, die Sie für Ihren Zweck verwenden möchten.

Und wir lassen die Antikörperlösung fünf Minuten lang einfließen, was ausreicht und genug Volumen hat, um die gesamte Lösung im Mikropho-Kanal zu ersetzen. Nach der Antikörperinjektion stoppen wir also den Fluss. Also floaten wir fünf Minuten lang in Antikörpern mit fünf Mikrolitern pro Minute, um die gesamte Lösung im Mikrokanal zu ersetzen.

Danach stoppen wir den Durchfluss und lassen das Gerät 30 Minuten lang inkubieren und bei Raumtemperatur erhitzen. Dies sollte also im Dunkeln erfolgen, damit der Antikörper nicht abgeschreckt wird, während die Zellen, die fluoreszierenden Antikörper, abgeschreckt werden können, während die Zellen mit einem färbenden Antikörper inkubiert werden. Nachdem wir also in der Regel 15 bis 30 Minuten lang gefärbt haben, ziehen wir einfach den Schlauch aus dem Gerät und ersetzen die Antikörperspritze durch eine Pufferspritze, um den ungebundenen Antikörper vom Gerät abzuwaschen.

Die Waschlösung hier enthält also 1%BSA in PBS-Lösung. BSA wird verwendet, um die Nichtbindung von Antikörpern an der Oberfläche zu blockieren, und wir werden das Gleiche tun. Zuerst passen wir also die Durchflussrate an der Spritzenpumpe an, um sicherzustellen, dass es die richtige Durchflussrate ist, die wir wollten, und dann starten wir die Spritzenpumpe und stellen sicher, dass tatsächlich Flüssigkeit aus dem Schlauch austritt, bevor wir sie an das Gerät anschließen.

Der Zweck dabei ist, dass keine Blase wie Reste in den Schläuchen zurückbleibt. Wenn wir also injizieren, gelangt keine Blase in unser Gerät. Also stecken wir einfach den Schlauch in das Gerät und lassen ihn weitere fünf Minuten fließen, um alle Auswaschungen, alle ungebundenen Antikörper aus dem Gerät zu ersetzen.

Nach dem Waschschritt fixieren wir die Zellen mit 1%PFA. Der Zweck dabei ist, dass das Gerät einige Wochen bis zu einigen Wochen gelagert werden kann, wenn die Bildgebung sofort durchgeführt werden kann. Das Verfahren ist also recht einfach.

Es ist ähnlich wie das, was wir zuvor gemacht haben. Wir laden die Spritze auf die Pumpe, stellen die Durchflussrate auf die gewünschte ein, und dann starten wir die Spritzenpumpe und stecken den Schlauch in unser Gerät, um die Paraform-IDE-Lösung zu injizieren, die das Fixiermittel in unser Gerät ist, um die Zellen zu fixieren. Auch hier ließen wir es etwa fünf Minuten lang fließen.

PFA ersetzt also den gesamten Puffer im Gerät, um alle Zellen im Gerät zu fixieren. Nach dem PFA-Fixierungsschritt nehmen wir also einfach die PFA-Spritze ab und schon ist das Gerät bereit für die Bildgebung. In einigen Fällen möchten die Menschen eine Zellkernfärbung haben, die sie zeigen können, um sie mit ihrer Zelloberflächenmarker-Färbung zu überlagern.

Zu diesem Zweck wird am Ende eine Kernfärbung mit DPI durchgeführt. Also laden wir einfach die DPI-Spritze, schalten die Spritzenpumpe ein und lassen DPI in unser Gerät fließen. Jetzt wird der Zellkern in diesen Zellen angefärbt, um die Position der Zellen zu zeigen.

Und das DPI-Färbebild kann später mit der Oberflächenmarker-Färbung überlagert werden, um zu zeigen, wo sich die Zellen befinden. Am Ende der DPI-Färbung müssen wir also die L-Bande DPI P erneut mit Pufferlösung abwaschen. Auch hier verwenden wir also PBS mit 1 % BSA, um die ausgehenden dpi abzuwaschen.

Und die Operation ist ähnlich wie bei früher. Wir stecken einfach die Pufferspritze in unser Gerät und lassen den Puffer in das Gerät fließen, um ungebundenen Dap abzuwaschen. Das ist also das gesamte Verfahren zum Färben von Zellen in einem Mikrofluidgerät.

Und nach all den Färbevorgängen sind die Geräte bereit für die Bildgebung. Und da wir PFA-Fixing durchgeführt haben, können die Geräte auch einige Wochen gelagert werden. Wenn die Bildaufnahme nicht sofort durchgeführt werden konnte.