Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Das übergeordnete Ziel des Fallexperiments ist es, Makromoleküle durch mechanischen Aufschluss vektorfrei an die Zielzellen zu bringen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Zielzelltyp mit dem gewünschten Abgabematerial in Suspension gebracht und in das Reservoir eines speziell entwickelten mikrofluidischen Geräts geladen wird. In einem zweiten Schritt wird das mikrofluidische Gerät unter Druck gesetzt und die Zellen werden durch eine Reihe von mikrofluidischen Kanälen getrieben, die die Zellen zusammendrücken, um eine vorübergehende Membranstörung zu ermöglichen.

Als nächstes werden die Zellen in Gegenwart des Zielträgermaterials inkubieren lassen, um den diffusiven Transport des Materials in das Zellzytoplasma zu erleichtern. Während die Zellmembran repariert wird. Es werden Ergebnisse erzielt, die eine effektive Abgabe von Makromolekülen durch den Einsatz von Durchflusszytometrie zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Ation und Lipo Perfection besteht darin, dass sie in der Lage ist, schwierige Zelltypen und Materialien zu adressieren, die mit anderen Methoden nicht effektiv bereitgestellt werden können. Diese Methode kann Schlüsselfragen im biologischen Bereich beantworten, z. B. wie die Reprogrammierung von Zellen verbessert werden kann. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose von Krebs, da das System die Manipulation von Immunzellen ermöglicht, um ihre Anti-Tumor-Wirksamkeit zu verbessern.

Um zu beginnen, stellen Sie das mikrofluidische Gerät, den Gerätehalter, die hier gezeigten und im begleitenden Textprotokoll aufgeführten Kunststoffflüssigkeitsbehälter und O-Ringe her oder kaufen Sie sie und füllen Sie dann drei verschließbare Behälter zur Hälfte mit 70 % Ethanol. Legen Sie die Geräte in den ersten Behälter, die Behälter und O-Ringe in den zweiten Behälter und die Halterungen in den dritten. Füllen Sie dann die Behälter den Rest des Weges mit 70 % Ethanol.

Als nächstes wird der Behälter mit den Behältern und O-Ringen sowie der Behälter mit den Haltern fünf bis 10 Minuten vor dem Gebrauch in einem Ultraschallbad behandelt. Dies wird dazu beitragen, alle kontaminierenden Partikel aus früheren Experimenten zu entfernen, während die Komponente den Arbeitsbereich in einer Biosicherheitswerkbank mit 70 % Ethanol abwischt. Sterilisieren Sie dann alle erforderlichen Materialien, einschließlich der drei Behälter und einer Pinzette, indem Sie sie mit 70 % Ethanol abwischen und in die Biosicherheitswerkbank legen, um mit der Montage zu beginnen.

Legen Sie zunächst zwei bis drei fusselarme Tücher in den Arbeitsbereich. Entfernen Sie dann die Plastikbehälter mit einer Pinzette aus dem Ethanolbehälter und legen Sie sie auf die Tücher, um den Feuchtigkeitstransport und die Verdunstung von Ethanol aus der Innenfläche zu erleichtern. Klopfen Sie vorsichtig auf die Behälter, um die Entfernung der Ethanollösung zu erleichtern.

Verwenden Sie bei Bedarf Druckgas, um den Behälter vollständig zu spülen. Sobald die Behälter getrocknet sind, setzen Sie die O-Ringe in die entsprechenden Schlitze an den Behältern ein. Platzieren Sie dann den Chip mit einer Pinzette mit der bedruckten Seite nach oben in der Gerätehalterung.

Vergewissern Sie sich, dass der Chip flach in der Halterung liegt und passen Sie ihn gegebenenfalls mit der Pinzette an. Wenn das Gerät nicht richtig in seine Halterung passt, besteht die Gefahr, dass es bei den nachfolgenden Schritten kaputt geht. Setzen Sie anschließend die Behälter vorsichtig auf die Halterung und richten Sie sie an den Clips aus.

Achten Sie darauf, dass die O-Ringe nicht aus ihren Schlitzen fallen. Drücken Sie während dieses Vorgangs vorsichtig auf die Behälter, bis sie einrasten. Stellen Sie sicher, dass beide Seiten der Behälter fest sitzen und dass sich der Chip in der richtigen Position zu befinden scheint.

Drücken Sie nicht mit übermäßiger Kraft auf die Behälter. Da der Druck die Chips für Primär oder Adhärenz brechen könnte. Zelllinien: Platzieren Sie die Zellen ein bis zwei Tage vor dem Experiment so, dass sie nicht mehr als 80 % konfluent sind.

Am Tag des Experiments. Unmittelbar vor dem Experiment werden die Zellen entnommen und wiederbelebt, in Medien oder einem anderen gewünschten Puffer mit einer Menge von einer bis 10 Millionen Zellen pro Milliliter suspendiert. Führen Sie dann die Zellsuspension vorsichtig durch ein 40-Mikron-Zellsiebnetz, um zu verhindern, dass Zellklumpen und Matrix das Gerät verstopfen.

Nach dem Abseihen werden 300 Mikroliter der Zellsuspension mit der gewünschten Konzentration des Abgabematerials in einem separaten Röhrchen gemischt. Für diese Demonstration wurden zwei Mikroliter Dextrin mit fünf Milligramm pro Milliliter und zwei Mikroliter Alexa verwendet. Pro 50 Mikroliter Zellsuspension werden 4 88 Isotopenkontrollantikörper zugegeben.

Mischen Sie anschließend vorsichtig 100 Mikroliter der Zellen durch Pipettieren. Pipettieren Sie dann mit Gelladespitzen die Zellen und das Verabreichungsmaterial in eines der Reservoire, befestigen Sie einen Druckschlauch an dem gefüllten Reservoir und ziehen Sie den Knoten mit den Fingern fest, um die richtige Decke zu gewährleisten. Stellen Sie dann den Luftdruck am Regler auf 70 PSI ein, um die Geschwindigkeit zu steuern, mit der sich die Zellen durch das Gerät bewegen.

Der Druck sollte für die spezifische Kombination aus Zelle und mikrofluidischem Chip optimiert werden, die in jedem Experiment verwendet wird. Wenn alles vorbereitet ist, heben Sie das Gerät auf Augenhöhe und richten Sie es so aus, dass die Flüssigkeit im Behälter gut sichtbar ist. Drücken Sie dann das Druckknopfventil, um das Reservoir unter Druck zu setzen und den Zellfluss zu starten.

Beobachten Sie die Geschwindigkeit, mit der die Flüssigkeit aus dem Behälter fließt. Wenn sich die Flüssigkeit im Verhältnis zu ihrer ursprünglichen Durchflussrate erheblich verlangsamt, ist das montierte Gerät wahrscheinlich verstopft und muss ausgetauscht werden. Die erhöhte Scherung, die durch die Blockade verursacht wird, führt zu einem überdurchschnittlichen Zelltod.

Wenn der Flüssigkeitsstand etwa zwei Millimeter vom Boden des Behälters entfernt ist, drehen Sie den Regler schnell auf null PSI, um den Durchfluss zu stoppen. Es ist wichtig, den Luftstrom zu stoppen, bevor das Reservoir geleert wird, da sonst die Probe aus dem Auffangbehälter ausgestoßen werden kann. Sammeln Sie dann die behandelten Zellen aus dem Auslaufreservoir und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Bei Raumtemperatur nehmen die bewerteten Zellen bis zu 10 Minuten lang Material auf. Nach 10 Minuten werden die Zellen mit zusätzlichen Medien beschichtet oder die Zellen entsprechend den experimentellen Anforderungen weiter verwendet. Wiederholen Sie diese Schritte, um so viele behandelte Zellen wie nötig zu entnehmen, und tauschen Sie die Chips nach Bedarf aus, wenn sie verstopft sind, und entsorgen Sie die mit C verstopften Geräte für jede weitere Probe.

Ändern Sie die Fließrichtung, um Verstopfungen zu minimieren. Wenn Sie mit dem Sammeln der Zellen fertig sind, trennen Sie die Behälter vorsichtig von der Haupthalterung, indem Sie die Cliparme zur Seite schieben. Legen Sie dann jedes zu verwendende Teil in den entsprechenden Vorratsbehälter und füllen Sie ihn mit frischem 70%igem Ethanol.

Legen Sie schließlich alle gebrauchten Chips zur ordnungsgemäßen Entsorgung in einen separaten Behälter. Die Verabreichungseffizienz und die Zellviabilität von Helazellen wurden gemessen. Nach einer Reihe von Experimenten wurden drei verschiedene mikrofluidische Chips in einem Bereich von Geschwindigkeiten bis zu 600 Millimetern pro Sekunde getestet.

Diese Tests zeigten, dass erhöhte Strömungsgeschwindigkeiten die Abgabe von fluoreszierend konjugiertem Dextrin mit drei Kilodalton in die Zellen für jeden der getesteten Chips verbesserten. Darüber hinaus führten erhöhte Geschwindigkeiten auch dazu, dass die Lebensfähigkeit der Zellen bei den getesteten Geräten um etwa 20 % sank. Diese Menge an Zelltod ist relativ gering und bei unsachgemäß konstruierten Geräten oft viel höher.

Die Aufnahme von pazifischem blau-konjugiertem Dextrin in die links gezeigte Kontrollzellpopulation ist das Ergebnis einer begrenzten Oberflächenbindung und endozytärer Effekte. Da die Zellen dem Trägermaterial für die gleiche Zeit ausgesetzt sind wie die behandelten Zellen. Auf der rechten Seite ist die Population lebender Zellen zu sehen, die das mikrofluidische Gerät passieren, während sie der gleichen Dextrinkonzentration ausgesetzt sind wie die Kontrollzellen.

Die Zellen im schattierten Bereich gelten als nicht zugestellt, und die Zellen rechts von der Linie werden als zugestellt definiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, die Lebend-Post-Optometrie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Liefereffizienz und Materialfunktionalität nach seiner Entwicklung zu beantworten.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der regenerativen Medizin den Weg, die Zellprogrammierung in adulten Primärzellen durch direkte Proteinabgabe zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Selbstquetschsystem für Ihre gewünschte Anwendung einrichten und bedienen.