Charakterisierung von gentechnisch veränderten mesenchymalen Stammzellen für neurotherapeutische Anwendungen

Beginnen Sie mit transgenen mesenchymalen Stammzellen der Maus – multipotenten Zellen, die aus dem Knochenmark gewonnen werden.

Die Zellen sind so verändert, dass sie GFP und therapeutische neurotrophe Faktoren exprimieren, die das Wachstum und Überleben der Neuronen unterstützen.

Waschen Sie die Zellen mit Puffer und fixieren Sie sie, um die zelluläre Integrität zu erhalten.

Erneut mit Puffer waschen und dann eine Lösung hinzufügen, um die Zell- und Kernmembranen zu permeabilisieren und unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.

Einführung von Primärantikörpern, die auf ein Zellproliferationsmarkerprotein abzielen, das ausschließlich im Zellkern von sich teilenden Zellen exprimiert wird.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fügen Sie Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper hinzu, die auf die Primärantikörper abzielen, und einen DNA-bindenden Farbstoff, um die Zellkerne gegenzufärben.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Reagenzien zu entfernen.

Legen Sie die Platte in das High-Content-Screening-System ein und nehmen Sie Bilder auf, um Fluoreszenzsignale zu erkennen.

Die Expression des Zellproliferationsmarkers deutet auf eine aktive Zellteilung hin, was auf die Eignung der transgenen Zellen für neurotherapeutische Anwendungen hindeutet.

Um einen Ki-67-Zellproliferationsassay durchzuführen, verwenden Sie 0,1 molare Phosphatpuffer, um die Zellkulturen eine Minute lang zu spülen. Verwenden Sie nach dem Waschen 4 % Paraformaldehyd oder PFA bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um die Kulturen zu fixieren.

Entfernen Sie nach der Fixierung das PFA und spülen Sie die Vertiefungen mit PBS dreimal für jeweils sieben Minuten. Nachdem Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll blockiert haben, tragen Sie 100 Mikroliter Primärantikörperlösung auf jede Vertiefung auf. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Nachdem Sie die Zellen bei jeder Wäsche dreimal sieben Minuten lang gewaschen haben, tragen Sie einen Sekundärantikörper auf, legen Sie die Zellen in die Dunkelheit und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Decken Sie die Platte nach weiteren drei Wäschen ab und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei 4 Grad Celsius.

Um eine automatisierte Bildgebung durchzuführen, laden Sie die immunmarkierte Platte in das HCS-System und lassen Sie die Platte 20 Minuten lang äquilibrieren. Öffnen Sie die Bilderfassungs- und -analysesoftware des HCS-Systems. Wählen Sie die Aufnahmeeinstellungen für das 10X-Objektiv mit Kamera-Binning bei 1 und Verstärkungseinstellung bei 2.

Verwenden Sie die Funktion für die automatische Belichtung, um die Z-Ebene zu ermitteln, in der sich die Zellen befinden, und berechnen Sie den Versatz für jede gewünschte Wellenlänge. Erfassen Sie für die hier gezeigte Analyse Bilder für DAPI, GFP und Cy3.

Wählen Sie die maximale Intensitätsstufe, bei der die negativen Kontrollvertiefungen kein Signal für die Bildaufnahme anzeigen. Verwenden Sie die gleichen Schwellenwerteinstellungen für positive Vertiefungen. Nehmen Sie schließlich Bilder auf und speichern Sie sie in einer Datenbank, bevor Sie eine Bildanalyse gemäß dem Textprotokoll durchführen.