Performing Benutzerdefinierte MicroRNA Microarray-Experimenten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung eines microRNA-Microarray-Experiments. Dies wird erreicht, indem zunächst gedruckte Microarray-Objektträger erworben werden, die eine Bibliothek von Mikro-RNA-Sonden enthalten, und RNA-Proben in geeigneter Qualität und Menge vorbereitet werden. Als nächstes werden die RNA- und A-kontrollierte DNA-Probe mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert.

Dann werden die markierten Nukleinsäuren zur Hybridisierung auf einen Microarray-Objektträger gegeben. Schließlich wird der Microarray-Objektträger gewaschen und gescannt und der Objektträger regeneriert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die genomweite Expression von microRNAs durch Analyse des Objektträgers auf Hybridisierungsintensitäten der einzelnen microRNA-Sonden zeigen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Genexpression zu beantworten, z. B. wie sich normale physiologische Bedingungen oder pathologische Zustände auf globaler Ebene auf den Expressionsbedarf von Mikros auswirken. Die Qualität der Microarray-Herstellung ist einer der wichtigsten Faktoren für den Erfolg eines Microarray-Experiments. Nach der Isolierung der RNA mit einem Verfahren, bei dem kleine RNAs konserviert und in einer Konzentration von mindestens zwei Milligramm pro Milliliter suspendiert werden, wird die RNA in einem Reaktionsvolumen von 20 Mikrolitern markiert, indem zuerst etwa 25 Mikrogramm Gesamt-RNA mit 0,5 Mikrogramm von fünf Primzahlen P-C-U-D-Y 5 4 7 3 Prime in einem X HEPs-Puffer gemischt werden, der mit T vier RNA-Ligase 1D TT ergänzt wird. und ein TP. Wenn weniger RNA verfügbar ist, verkleinern Sie die RNA-Menge und die Reaktion.

Wenn die RNA sehr verdünnt ist, fügen Sie einen Träger wie Hefe, TRNA hinzu, um die Ausfällung zu unterstützen, und inkubieren Sie die Reaktion zwei bis 24 Stunden lang auf Eis in einem Kühlschrank. Als nächstes fügen Sie Natriumacetat zu 0,3 molaren und dann drei Volumen Ethanol hinzu und fällen Sie die RNA über Nacht bei minus 20 Grad Celsius aus. Um die Objektträger zum ersten Mal zu verwenden, hybridisieren Sie sie in einer gefilterten Lösung aus drei XSSC, 0,1 % SDS und 0,2 % BSA für 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Tauchen Sie die Rutschen anschließend einige Male in Wasser. Trocknen Sie dann die Objektträger in Isopropanol mit einer Zentrifuge mit einem Objektträgeradapter fünf Minuten lang bei 22 Grad Celsius bei 100 mal G. Spülen Sie die Lifter-Streifen mit Wasser ab.

Legen Sie dann in Ethanol vor dem Trocknen an der Luft einen Objektträger in eine Microarray-Hybridisierungskammerbasis und einen Lifter-Slip auf den Slide, so dass der Lifter-Slip den Sondenbereich und seine weißen Streifen bedeckt. Berühren Sie den Objektträger im Dunkeln, schleudern Sie die gefällte markierte RNA herunter, waschen Sie sie einmal mit 70%Ethanol und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Das Pellet sollte eine rötliche Farbe haben.

Bereiten Sie eine Hybridisierungslösung mit einem 15- bis einem 100stel Volumen der gereinigten markierten Referenz-DNA pro RNA-Probe her. Lösen Sie das RNA-Pellet vollständig mit etwa 60 Mikrolitern der Hybridisierungslösung auf, um sicherzustellen, dass die Hybridisierungslösung nicht austrocknet. Geben Sie während der Inkubation 20 Mikroliter Wasser in jede der Befeuchtungsvertiefungen. Im Boden der Microarray-Hybridisierungskammer.

Fügen Sie dem Objektträger eine Mischung aus markierter RNA und Referenz-DNA hinzu. Berühren Sie mit einer dünnen Pipettenspitze vorsichtig die Kante des Lifter-Gleiters und saugen Sie ihn durch. Lassen Sie die Lösung in den Raum zwischen dem Lifter-Slip und dem Slide eindringen.

Setzen Sie die Abdeckung der Hybridisierungskammer über die Basis. Verschließen Sie dann die Kammer mit Metallklammern. Legen Sie die gesamte Kammer in die Plastiktüte, die mit der Kammerkassette geliefert wird.

Legen Sie zum Schluss die Kammerkassette in einen Behälter mit einem feuchten Papiertuch. Decken Sie dann den Behälter mit Plastikfolie ab und stellen Sie ihn für etwa 24 Stunden in einen 37 Grad Celsius feuchten Zellkultur-Inkubator. Um die Objektträger nach der Hybridisierung zu verarbeiten, zerlegen Sie die Kammerkassetten nacheinander, tauchen Sie einen Objektträger ein und dessen Lifter gleitet in zwei XSSC bei 22 Grad Celsius.

Der Lifter-Slip fällt auf natürliche Weise von der Rutsche, waschen Sie die Slides zweimal in 0,8 XSSC, dann dreimal in 0,4 XSSC für insgesamt ein bis zwei Minuten. Trocknen Sie die Objektträger mit einer Zentrifuge mit einem Objektträgeradapter. Scannen Sie anschließend die Dias mit einem Microarray-Scanner und verwenden Sie ein Programm wie blue fuse, um die Intensitäten in den Bilddateien zu quantifizieren.

Untersuchen Sie einzelne Flecken, um abnormale Flecken auszuschließen, die normalerweise durch den Porenschnittdruck oder die Handhabung von Objektträgern nach der Hybridisierung entstehen. Verwenden Sie für die Datenanalyse und -präsentation Programme wie Gene Springing und Excel, um den Microarray wiederzuverwenden. Entfernen Sie den Objektträger, indem Sie ihn mit Wasser abspülen und dann 10 bis 20 Minuten lang in eine Färbeschale mit einem Millimolar NAOH und 0,1 XSSC bei 62 Grad Celsius vorwärmen.

Wiederholen Sie die Inkubation ein zweites Mal. Waschen Sie die Rutschen mehrmals bis zu 60 Minuten in Wasser unter leichtem Schütteln bei 22 Grad Celsius. Trocknen Sie die Objektträger mit einer Zentrifuge und lagern Sie sie bei 22 Grad Celsius.

Die Objektträger können ohne Vorhybridisierung verwendet werden. Diese Abbildung zeigt ein gescanntes Bild eines Microarrays, das sehr präzise und starke Hybridisierungssignale zeigt. Rote Flecken resultierten aus der Hybridisierung der Referenz-DNA, grüne Flecken aus der DY 5 47-markierten RNA-Probe, und die gelben Flecken stammten aus der Hybridisierung von DNA und RNA mit denselben Sonden.

Die Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen technischen Replikaten der Microarray-Hybridisierung liegen bei etwa 0,99, was auf eine hervorragende Reproduzierbarkeit hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein benutzerdefiniertes Mikrostrahlenexperiment durchführen, nicht nur für die Quantifizierung von Mikronase, sondern auch für die Quantifizierung anderer Arten von Nukleinsäuren wie mRNAs.