Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Funktion mit Cytochrom C Oxidase / Succinat-Dehydrogenase (COX / SDH) Double-Kennzeichnung Histochemie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine direkte Visualisierung von Defekten an mitochondrialen respiratorischen Enzymen in frischen gefrorenen Gewebeschnitten zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst Kryostatenschnitte von dem interessierenden Organ entnommen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Cox-Histo-Chemie durchzuführen, gefolgt von der SDH-Histo-Chemie.

Zum Schluss werden die Gewebeabschnitte dehydriert, montiert und mit dem Deckel überzogen. Letztendlich können die Ergebnisse das Ausmaß der mitochondrialen Dysfunktion durch die Menge der zellulären Blaufärbung zeigen. Hi.Today werden wir über die Cox SCH-Doppelmarkierungstechnik HISTOCHEMICAL sprechen.

Und während diese Methode zur Untersuchung von Mitochondrienkrankheiten angewendet werden kann, kann sie auch Einblicke in das Altern und altersbedingte Störungen geben. Nachdem Sie das Gehirn eines Tieres entnommen haben, das in Übereinstimmung mit der ethischen Genehmigung getötet wurde, frieren Sie es schnell auf Trockeneis ein. Gefrorenes Gewebe kann bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt und bis zum Schnitt in Aluminiumfolie eingewickelt werden.

Bereiten Sie das Gewebe für die Kryosektion vor, indem Sie das Gehirn auf ein Kryostat-Futter legen und es mit Einbettmasse umgeben. Setzen Sie das Bohrfutter schnell in den Kryostaten ein und sammeln Sie 14-Mikron-Schnitte bei minus 21 Grad Celsius. Tauen Sie die Abschnitte mit einem Heizblock auf den Objektträgern auf und lassen Sie die Objektträger dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur trocknen.

Legen Sie die Objektträger in eine Objektträgerfärbekammer mit nassen Papierstreifen. Da die Reaktionszeiten bei diesem Assay wichtig sind, wird empfohlen, maximal 10 Objektträger pro Experiment unter einer chemischen Haube zu verarbeiten. Bereiten Sie die Inkubation vor, Medium mit Dab und Cytochrom C in PBS und Vortex.

Geben Sie schnell zwei Mikrogramm Rinder-CDEs in das Medium und mischen Sie es gut durch Vortexen. Um alle Körner von CDEs, die noch unter der Haube arbeiten, aufzubrechen, tragen Sie 150 bis 200 Mikroliter Inkubationsmedium auf jeden Objektträger auf, indem Sie die Pipettenspitze verwenden, um es gleichmäßig auf alle Abschnitte zu verteilen. Inkubieren Sie die Objektträger 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie nach 40 Minuten das Inkubationsmedium von den Objektträgern. Waschen Sie die Objektträger viermal für jeweils 10 Minuten in PBS. Nachdem Sie die Objektträger gewaschen haben, bringen Sie sie mit nassen Papierstreifen unter einer chemischen Haube in die Objektträgerfärbekammer zurück.

Bereiten Sie die NBT-Lösung in PBS vor und achten Sie darauf, das PMS vor Lichtwirbeln zu schützen. Tragen Sie schnell 150 bis 200 Mikroliter der NBT-Lösung mit der Pipettenspitze auf jeden Objektträger auf, um sie gleichmäßig auf alle Abschnitte zu verteilen. Inkubieren Sie die Objektträger 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, nach 40 Minuten entfernen Sie überschüssige Lösung von den Objektträgern. Waschen Sie die Objektträger viermal für jeweils 10 Minuten in PBS.

Dehydrieren Sie die Objektträger jeweils zwei Minuten lang in den folgenden aufeinanderfolgenden Konzentrationen von Ethanol. 70 %70 %95 %95 % und 99,5 %Zum Schluss 10 Minuten in einem zusätzlichen 99,5 %-Schritt. Legen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in Xylol, montieren Sie sie mit LAN und bringen Sie Deckgläser an.

Lassen Sie die Rutschen über Nacht trocknen oder lassen Sie sie hier mindestens ein bis zwei Stunden in einem belüfteten Bereich trocknen. Hirnschnitte aus Wildtyp und vorzeitiger Alterung. MT. DNA-Mutator-Mäuse wurden sequentiell auf COX- und SDH-Aktivitäten markiert.

Eine normale Cox-Aktivität, die durch die dunkelbraune Färbung angezeigt wird, ist im Hippocampus von Wildtyp-Mäusen zu beobachten. Cox-Defizite, die durch die Blaufärbung angezeigt wurden, wurden im Hippocampus von MT-DNA-Mutatormäusen nach 12 und 46 Wochen festgestellt. Es gab eine weitere Abnahme der Cox-Aktivität im Alter von 46 Wochen bei M-T-D-N-A-Mutatormäusen, was auf eine weit verbreitete Verschlimmerung der Dysfunktion der Atmungskette hindeutet.

Unzureichende Inkubationszeiten von 10 und 25 Minuten führten zu einer verminderten Ablagerung des Brown-Dab-Reaktionsprodukts. Die verkürzten Inkubationszeiten ermöglichten die Bildung des blauen Foran-Endprodukts während der SDH-Inkubation, was irreführend auf das Vorhandensein von Zellen mit COX-Mangel und das Verrutschen der Abdeckung hindeutet. Die Objektträger während der COX-Inkubation führten auch zu einer ungenauen Bildung und Abscheidung des DAB-Reaktionsprodukts.

Obwohl Cox- und SDH-Aktivitäten, wie hier gezeigt, individuell markiert werden können, hat sich die sequentielle Markierung bei der Lokalisierung von Zellen mit mitochondrialer Dysfunktion als vorteilhaft erwiesen. Ein Beispiel für eine Spezifitätskontrolle für COX- und SDH-Aktivitäten im Gehirn von einer Wildtyp-Maus zeigt eine negative Markierung. Vergessen Sie also nicht, dass die Arbeit mit den Chemikalien in der doppelten Cox-SCH-Kennzeichnung das chemische Protokoll ist und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Laborkleidung und einer Maske, die unter der Chemikalienhaube arbeiten, sowie die Entsorgung des Inkubationsmediums jedes Mal getroffen werden sollten, wenn Sie diesen Assay durchführen.