Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die genregulatorischen Aktivitäten von cis-regulatorischen Elementen oder CREs, die während der metamorphogenetischen Entwicklung von Drosophila melanogaster aktiv sind, quantitativ zu messen. Beginnen Sie mit standortspezifischen Integrationsmethoden, um Stämme zu erzeugen, in denen CREs als Reportergene transgen eingefügt wurden. Gewinnen Sie mithilfe eines Stereomikroskops transgene Exemplare des richtigen Entwicklungsstadiums.

Entnehmen Sie die Proben aus dem äußeren Pub und bringen Sie sie auf einem Glasobjektträger an. Fahren Sie mit der Aufnahme der Intensität und des Musters der Expression des fluoreszierenden Reportereiweißes in Ganzpräparaten mittels konfokaler mikroskopischer Analyse fort. Quantifizieren Sie abschließend die Expression des fluoreszierenden Reportereiweißes für die aufgezeichneten konfokalen Bilder mithilfe des Software-Tools ImageJ.

Diese Ergebnisse ordnen einem assistierenden regulatorischen Element ein Maß an genregulatorischer Aktivität zu und ermöglichen weitere vergleichende Studien zur Genexpression an modifizierten Versionen regulatorischer Elemente. Dieses Verfahren kann helfen, zentrale Fragen zu beantworten und trägt zum Verständnis der Genregulation sowie der Art und Weise bei, wie diese Genregulation codiert ist. DNA spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklungs- und Evolutionsbiologie.

Dieses Verfahren wurde entwickelt, um Einblicke in cis-regulatorische Elemente zu erhalten, die während der metamorphischen Entwicklung von Drosophila melanogaster funktionieren. Im Prinzip kann es jedoch auch auf cis-regulatorische Elemente angewendet werden, die in anderen Entwicklungsstadien oder bei anderen Fruchtfliegenarten – oder sogar bei anderen Modellorganismen – wirken. Um transgene Linien zu vermehren, bereiten Sie an abwechselnden Tagen zwei Gefäße mit jeweils mehreren männlichen und weiblichen Fliegen vor.

Überführen Sie die Fliegen aus einem der Vials in ein neues Vial. Wiederholen Sie dies eine Woche lang. Überprüfen Sie nach zwei Wochen, ob die transgenen Fruchtfliegen alle Entwicklungsstadien von der Larve bis zum erwachsenen Tier umfassen.

Beginnen Sie mit der Einstufung der Proben am Ende des dritten Larvenstadiums, wenn das ER gebildet ist. Beachten Sie, dass die Probe nicht beweglich ist. Das ER ist weich und weißlich, und die Sphäroide weisen zu diesem Zeitpunkt eine abweichende Spezifizierung auf.

Als Null Stunden nach der Puppenbildung (HAPF). Unterscheide Männchen von Weibchen anhand der beidseitig angeordneten Gonaden nahe der Körpermitte, die als durchsichtige Kreise erscheinen, zur Stadieneinteilung basierend auf der Länge der Metamorphose. Zum Zeitpunkt Null HAPF überführe die Proben mit einem angefeuchteten Pinsel in ein frisches Gefäß.

Fügen Sie ein Stück Kimwipe hinzu und befeuchten Sie es mit Wasser, um zu verhindern, dass die Proben austrocknen. Inkubieren Sie nun das Gefäß bei 25 Grad Celsius bis zum gewünschten HAPF. Alternativ können die Proben durch Sortierung anhand der Identifizierung des Vorhandenseins und der Position mehrerer morphologischer Marker entsprechend dem begleitenden Text gestaffelt werden.

Befestigen Sie mit Laborklebeband ein Stück Packband an einem Präparationsbrett, wobei die klebrige Seite nach oben zeigt. Befeuchten Sie einen Pinsel und bringen Sie mit dem Pinsel Feuchtigkeit auf die präparierten Proben auf. Überführen Sie die Proben auf ein Kim-Tuch.

Überführen Sie die Proben auf das Klebeband und befestigen Sie sie mit der dorsalen Seite nach oben. Lassen Sie die Proben 15 Minuten trocknen. Öffnen Sie das ER schrittweise mit einer Pinzette.

Beginnen Sie am vorderen oder vorderen Ende und fahren Sie in Richtung des hinteren Endes fort. Übertragen Sie dann die Larven auf einen Tropfen viskoses Öl auf einem Objektträger und untersuchen Sie die Probe mikroskopisch als Ganzpräparat. Verwenden Sie entweder das Forex- oder das 10x-Objektiv, um die Probe scharfzustellen.

Passen Sie mithilfe der Software des konfokalen Mikroskops die Anregungswellenlänge für das gewünschte fluoreszierende Protein an, um eine Photobleiche zu verhindern. Beginnen Sie mit einer Laserintensität von fünf bis 10 %. Falls das Signal schwach ausfällt, erhöhen Sie die Intensität nach Bedarf, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Aktivieren Sie bei konfokalen Bildern Softwareeinstellungen, die Pixelmessungen aus wiederholten Scans mitteln, wie beispielsweise die Kalman-Mittelung, für quantitative Vergleiche der CRE-Aktivität; verwenden Sie dabei den C-Schnitt, in dem die Fluoreszenz am intensivsten erscheint.

Wechseln Sie zu einer Nachsättigungswarnungs-Nachschlagetabelle und passen Sie die Kanalverstärkung und den Offset an Einstellungen an, bei denen nur wenige Pixel gesättigt sind. Passen Sie gegebenenfalls die konfokale Blende an. Sobald die optimalen Einstellungen festgelegt sind, führen Sie den ZS-Scan durch, um eine Reihe von Bildern entlang der Z-Achse zu erhalten.

Wenn der Scan abgeschlossen ist, konvertieren Sie den Bildstapel in eine Projektion und speichern Sie diese Bilddatei im TIF-Format. Zur quantitativen Vergleich der CRE-Aktivitäten verwenden Sie dieselben Konfokaleinstellungen für alle Replikat-Proben und Reporter-Transgenlinien. Öffnen Sie für das Experiment mit dem Image-J-Programm ein zu bewertendes TIFF-Bild.

Klicken Sie auf die Schaltfläche für die Freihandauswahl und umreißen Sie den Bereich der Probe, in dem eine Quantifizierung gewünscht ist. Um eine Statistik des Pixelwerts zu erhalten, klicken Sie auf den Reiter Analysieren und wählen dann Messen aus. Notieren Sie den mittleren Pixelwert aus dem Ergebnisfenster.

Sammeln Sie außerdem einen zweiten mittleren Pixelwert aus einem Hintergrundbereich, in dem die CRE nicht aktiv ist. Um einen korrigierten mittleren Pixelwert zu erhalten, ermitteln Sie weiterhin Pixelwertstatistiken für replizierte Proben. Anschließend bestimmen Sie aus den korrigierten mittleren Pixelwerten der Replikate die durchschnittliche regulatorische Aktivität für eine CRE und berechnen Sie zudem den Standardfehler des Mittelwerts.

Dieses Experiment nutzt die Intensität des weißen Rettungs-Augenphänotyps, um transgene Linien homozygot zu machen. Ein genetischer Hintergrund mit Mutation im white-Gen und einer A-TTP-Landingstelle-Sequenz wird für die standortspezifische Integration des Transgens verwendet. Transgene Individuen, die für den integrierten Vektor hemizygot oder homozygot sind, werden anhand der Intensität des phänotypisch geretteten Augenfarbphänotyps unterschieden, der von der Kopienzahl des integrierten mini-white-Gens abhängt.

Homozygote Linien werden anschließend etabliert, indem männliche und weibliche Fliegen mit dem dunkelsten Augenfarbephenotyp gekreuzt werden. Morphologische Marker werden verwendet, um den metamorphischen Entwicklungsstadium von Drosophila während der Metamorphose von der Larve zur erwachsenen Fruchtfliege zu bestimmen. Das Exemplar durchläuft eine Reihe charakteristischer Morphologien, anhand derer das Geschlecht identifiziert und der Entwicklungsstand näherungsweise bestimmt werden kann. Hier.

Eine Wildtyp-Version eines CRE, die als dimorphes Element bezeichnet wird, vermittelt hohe Expressionsspiegel des EGFP-Reportergens im abdominalen Segment des ASIC bei weiblichen puy. Innerhalb dieses CRE wurde eine 13 Basenpaare lange Sequenz als Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor DSX identifiziert, und die in-vivo-Bedeutung dieser Sequenz wird durch die Quantifizierung der regulatorischen Aktivität des CRE gezeigt, wenn diese Bindungsstelle mutiert ist. Quantitative Analysen zeigen, dass die Mutation dieser DSX-Bindungsstelle die regulatorische Aktivität auf 28 ± 3 % der Wildtyp-Expression im Kontext der hier verwendeten Transgen-Einfügestelle reduziert.

Ähnliche Vergleiche bewerten regulatorische Aktivitäten für intraspezifische CRE-Allele oder zwischen autologen CREs verschiedener Arten, beispielsweise im Vergleich zu EGFP-Spiegeln im weiblichen Segment. Ein durch die autologen CREs des D. melanogaster-Stamms „Gastric Canin S“ getriebener Wert zeigt für die Arten D. stimulants und D. willi regulatorische Aktivitäten von 75 ± 4 % bzw. 0 ± 0 % auf. Mithilfe von Verfahren wie der RNA-Interferenz können zusätzliche Fragen dazu beantwortet werden, wie diese Transkriptionsfaktor-Gene mit den regulatorischen CYS-Elementen interagieren.

Dies würde durch die Zunahme und Abnahme der Expression des fluoreszierenden Reportergen-Proteins angezeigt, das durch CIS-Regulatorelemente gesteuert wird, nach deren Entwicklung. Dieses Verfahren ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Genregulation den Weg, um die funktionelle Bedeutung von Motiven in cis-Regulatorelementen und evolutionär entstandener Mutationen für die Genexpression zu untersuchen.