Name: Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Lernen Sie die quantitative Analyse cis-regulatorischer Elemente in transgenen Drosophila melanogaster. Diese Methode nutzt Reporter-Transgene und konfokale Mikroskopie zur Messung genregulatorischer Aktivitäten während der Metamorphose.

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Wir danken: Nicolas Gompel und Benjamin Prud&#39;homme für ihre Beiträge zur Entwicklung dieses Protokolls; Melissa Williams und vier anonymen Gutachtern für Anmerkungen zum Manuskript; der University of Dayton Graduiertenschule für Forschungsstipendien an WAR, und der University of Dayton Biology Department und Research Institute (UDRI) für Forschungs-Unterstützung für TMW. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Stipendium 11BGIA7280000 zu TMW unterstützt.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

cis-regulatorische Elemente kodieren die genomische Programm, das Genexpressionsmuster und damit den Prozess der Entwicklung 1 gibt, und sind prominente Standorte für beide Mutationen zugrunde liegende morphologische Evolution 2-4 und phänotypischen Variation für menschliche Züge 5,6,19. Trotz dieser großen Bedeutung sind die regulatorischen Logik für CREs wenig verstanden. Ein prominentes Grund dafür Verständnis Defizit ist der Mangel an geeigneten Methoden, um quantitativ zu v...

quantitativen vergleich der cis-regulatory element (cre) aktivitäten in transgenen drosophila melanogaster</em

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Genexpressionsmuster von cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen, die auch als Enhancer oder cis-regulatorischen Modulen angegeben. Ein typisches CRE besitzt eine Anordnung von Bindungsstellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren Proteine, die eine regulatorische Logik angeben, wann, wo und auf welcher Ebene die regulierten Gens (s) zum Ausdruck zu verleihen. Der vollständige Satz von Cres in ein Tier Genom kodiert des Organismus Programm für die Entwicklung 1 und empirische als auch theoretische Studien zeigen, dass Mutationen in Cres eine herausragende Rolle spielte in morphologische Evolution 2-4. Darüber hinaus deuten die menschliche genomweiten Assoziationsstudien, dass die genetische Variation in CREs tragen wesentlich zur phänotypischen Variation 5,6. So Verständnis regulatorischen Logik und wie Mutationen betreffen solche Logik ist ein zentrales Ziel der Genetik. Reporter Transgene bieten eine leistungsfähige Methode, um die in vivo Funktion StudieTION Cres. Hier ist ein bekannter oder vermuteter CRE-Sequenz ist zu heterologen Promotor und kodierenden Sequenzen für ein Reporter-Gen kodiert ein leicht beobachtbaren Protein-Produkt gekoppelt. Als ein Reporter-Transgen in einen Wirtsorganismus eingesetzt ist, wird die CRE die Aktivität sichtbar in Form der kodierten Reporter-Protein. P-Element vermittelte Transgenese in der Fruchtfliege Drosophila Arten (D.) melanogaster 7 hat seit Jahrzehnten verwendet werden, um Reporter Transgene in diesem Modell Organismus einbringen, obwohl die genomische Anordnung der Transgene ist zufällig. Daher ist Reportergen-Aktivität stark von der lokalen Chromatinstruktur und Gen-Umwelt beeinflusst, die Begrenzung CRE Vergleiche werden qualitative. In den letzten Jahren wurde die phiC31 basierte Integration System für den Einsatz in D. melanogaster angepasst Transgene in spezifischen Genom Landeplätze 8-10 einfügen. Diese Fähigkeit hat die quantitative Messung der Gen hergestellt und hier relevant, CRE-Aktivität 11-13 feasible. Die Herstellung von transgenen Fruchtfliegen ausgelagert werden können, einschließlich phiC31-basierte Integration, wodurch die Notwendigkeit für teure Ausrüstung zu kaufen und / oder Kenntnisse in spezialisierten Transgen Injektion Protokolle. Hier präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur quantitativen Auswertung eines CRE Tätigkeit und zeigen, wie dieser Ansatz verwendet werden, um die Auswirkungen einer Einführung Mutation auf einem CRE Tätigkeit zu messen und die Aktivitäten der orthologen CREs vergleichen. Obwohl die Beispiele für eine CRE aktiv sind während der Fruchtfliege Metamorphose, kann der Ansatz auf andere Entwicklungsstadien, Fruchtfliege Arten oder Modell-Organismen angewandt werden. Letztlich sollte eine breitere Anwendung dieser Methode zu untersuchen CREs Voraus ein Verständnis der regulatorischen Logik und wie Logik kann variieren und sich entwickeln.

Phänotypische Variation für Züge können durch Mutationen in cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen, die Kontrolle Genexpressionsmuster führen. Methoden für den Einsatz in Drosophila melanogaster abgeleitet werden können quantitativ vergleichen Sie die Ebenen der räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression durch modifizierte oder natürlich vorkommende Varianten CRE vermittelt.

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Genexpressionsmuster werden durch Sequenzen von cis-regulatorischen Elementen (CRE) festgelegt, die auch als Enhancer oder cis-regulatorische Module bezeichnet werden. Ein typisches CRE ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die genregulatorischen Aktivitäten von cis-regulatorischen Elementen oder CREs, die während der metamorphogenetischen Entwicklung von Drosophila melanogaster aktiv sind, quantitativ zu messen. Beginnen Sie mit standortspezifischen Integrationsmethoden, um Stämme zu erzeugen, in denen CREs als Reportergene transgen eingefügt wurden. Gewinnen Sie mithilfe eines Stereomikroskops transgene Exemplare des richtigen Entwicklungsstadiums.Entnehmen Sie die Proben aus dem äußeren Pub und bringen Sie sie auf einem Glasobjektträger an. Fahren Sie mit der Aufnahme der Intensität und des Musters der Expression des fluoreszierenden Reportereiweißes in Ganzpräparaten mittels konfokaler mikroskopischer Analyse fort. Quantifizieren Sie abschließend die Expression des fluoreszierenden Reportereiweißes für die aufgezeichneten konfokalen Bilder mithilfe des Software-Tools ImageJ.Diese Ergebnisse ordnen einem assistierenden regulatorischen Element ein Maß an genregulatorischer Aktivität zu und ermöglichen weitere vergleichende Studien zur Genexpression an modifizierten Versionen regulatorischer Elemente. Dieses Verfahren kann helfen, zentrale Frage

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Forschung

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Biology

Biologie

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Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Verordnung der Chromatin-Umgebung ist ein wesentlicher Prozess erforderlich für die ordnungsgemäße Genexpression. Hier beschreiben wir eine Methode zur Steuerung der Genexpression durch die Rekrutierung von Chromatin-modifizierende Maschinen Gen-spezifischen und reversibel.

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