Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die genregulatorischen Aktivitäten von CIS-regulatorischen Elementen oder CRE, die während der metamorphen Entwicklung von Drosophila melan gastro aktiv sind, quantitativ zu messen. Beginnen Sie mit standortspezifischen Integrationsmethoden, um Linien von CREs zu generieren, die transgen als Reporter-Transgene aufgenommen wurden. Mit einem Stereomikroskop erhalten Sie transgene Proben des richtigen Entwicklungsstadiums.

Entnehmen Sie die Proben aus der äußeren Kneipe und montieren Sie sie auf ein Glasmikroskop. Fahren Sie fort, um das Niveau und Muster der Expression fluoreszierender Reporterproteine in ganzen Mount-Proben durch konfokale mikroskopische Analyse aufzuzeichnen. Quantifizieren Sie schließlich den Grad der Expression fluoreszierender Reporterproteine für aufgezeichnete konfokale Bilder mit dem Softwaretool Image J.

Diese Ergebnisse weisen ein genetisches regulatorisches Aktivitätsniveau zu, um das regulatorische Element zu unterstützen und weitere vergleichende Genexpressionsstudien an modifizierten CRE-Versionen zu erleichtern. Dieses Verfahren kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten und interessiert sich für die Genregulation und wie diese Genregulation kodiert. DNA fühlt sich an wie Entwicklungs- und Evolutionsbiologie.

Dieses Verfahren wurde entwickelt, um Einblicke in cis-regulatorische Elemente zu geben, die während der metamorphen Entwicklung von Drosophila melanogaster wirken. Prinzipiell lässt es sich aber auch auf cis-Regulationselemente anwenden, die in anderen Entwicklungsstadien und bei anderen Fruchtfliegenarten oder auch bei anderen Modellorganismen wirken. Um transgene Linien zu erweitern, stellen Sie zwei Fläschchen mit mehreren männlichen und weiblichen Fliegen an abwechselnden Tagen auf.

Übertragen Sie die Fliegen aus einem der Fläschchen in ein neues Fläschchen. Wiederholen Sie dies eine Woche lang. Stellen Sie nach zwei Wochen sicher, dass die transgenen Fruchtfliegen von der Larve bis zum erwachsenen Entwicklungsstadium reichen.

Beginnen Sie mit der Inszenierung der Proben am Ende des dritten Larvenstadiums im Instar, wenn das ER gebildet wird. Beachten Sie, dass die Probe nicht beweglich ist. Das ER ist weich weiß und die Kugeln sind abgewandt und geben diesen Zeitpunkt an.

Als Null-HAPF. Männchen von Weibchen unterscheiden sich durch das Vorhandensein von bilateral angeordneten Gonaden in der Nähe des Körpermittelpunkts, die als durchscheinende Kreise für das Staging basierend auf der Länge der Metamorphose erscheinen. Bei null HAPF die Proben mit einem angefeuchteten Pinsel in ein frisches Fläschchen umfüllen.

Fügen Sie ein Stück Kim-Tuch hinzu und befeuchten Sie es mit Wasser, damit die Proben nicht austrocknen. Inkubieren Sie nun das Fläschchen bei 25 Grad Celsius bis zum gewünschten HAPF. Alternativ können die Proben durch Sortierung auf der Grundlage der Identifizierung des Vorhandenseins und der Position mehrerer morphologischer Marker sortiert werden, wie im Begleittext beschrieben.

Kleben Sie mit Laborklebeband ein Stück Packband mit der Klebebandoberfläche nach oben auf ein Sezierbrett. Befeuchten Sie einen Pinsel und tragen Sie mit einem Pinsel Feuchtigkeit auf die Proben auf. Übertragen Sie die Proben auf ein Kim-Tuch.

Übertragen Sie die Proben auf das Packband und kleben Sie sie mit der Rückenfläche nach oben. Lassen Sie die Proben 15 Minuten trocknen. Öffnen Sie die Notaufnahme schrittweise mit einer Pinzette.

Beginnen Sie am vorderen Ende oder im Dauerwelle und fahren Sie zum hinteren Ende fort. Übertragen Sie dann pui auf einen Tropfen viskoses Öl auf einen Objektträger und bewerten Sie die Probe mikroskopisch für ganze Passepartout-Proben. Verwenden Sie entweder das Forex- oder das 10-fach-Objektiv, um die Probe in den Fokus zu bringen.

Passen Sie mit der konfokalen Mikroskopsoftware die Anregungswellenlänge für das gewünschte fluoreszierende Protein an, um Photobleiche zu verhindern. Beginnen Sie mit einer Laserintensität von fünf bis 10 %Wenn das Signal nicht überwältigend ist, erhöhen Sie die Intensität nach Bedarf, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Aktivieren Sie für konfokale Bilder Softwareeinstellungen, die den Durchschnitt von Pixelmessungen aus Replikationsscans ermöglichen, wie z. B. die Kalman-Mittelung für quantitative Vergleiche der CRE-Aktivität unter Verwendung des Kaiserschnitts, bei dem die Fluoreszenz am intensivsten erscheint.

Wechseln Sie zu einer Nachschlagetabelle für Sättigungswarnungen und passen Sie die Kanalspannungsverstärkung und den Offset auf Einstellungen an, bei denen nur wenige Pixel gesättigt sind. Stellen Sie bei Bedarf die konfokale Blende ein. Sobald die optimalen Einstellungen ermittelt wurden, führen Sie den ZS-Scan aus, um eine Reihe von Bildern entlang der Z-Achse zu erhalten.

Wenn der Scan abgeschlossen ist, konvertieren Sie den Bildstapel in eine Projektion und speichern Sie diese Bilddatei im TIF-Format. Für den quantitativen Vergleich der CRE-Aktivitäten verwenden Sie die gleichen konfokalen Einstellungen für alle replizierten Proben und Reportertransgenlinien. Für das Experiment mit dem Programm Image J öffnen Sie ein TIFF-Bild, das ausgewertet werden soll.

Klicken Sie auf die Schaltfläche zur Freihandauswahl und umreißen Sie den Bereich der Probe, in dem eine Quantifizierung gewünscht ist. Um eine Pixelwertstatistik zu erhalten, klicken Sie auf die Registerkarte "Analysieren" und wählen Sie dann "Messen" aus. Notieren Sie sich den mittleren Pixelwert aus dem Ergebnisfeld.

Erfassen Sie auch einen zweiten mittleren Pixelwert aus einem Hintergrundbereich, in dem die CRE nicht aktiv ist. Um einen angepassten mittleren Pixelwert abzuleiten, generieren Sie weiterhin Pixelwertstatistiken für replizierte Exemplare. Bestimmen Sie dann aus den replikangepassten mittleren Pixelwerten die durchschnittliche regulatorische Aktivität für A CRE und berechnen Sie auch den Standardfehler des Mittelwerts.

Dieses Experiment nutzt die Intensität des Phänotyps des weißen Rettungsauges, um transgene Linien homozygot zu machen. Ein genetischer Hintergrund der Weißgenmutante mit einer A-TTP-Landestellensequenz wird für die ortsspezifische Transgenintegration verwendet. Transgene Individuen, hemizygot und homozygot für den integrierten Vektor, unterscheiden sich durch die Intensität des geretteten Augenfarbenphänotyps durch die Anzahl der Kopien des integrierten Mini-Weiß-Gens.

Homozygote Linien werden dann durch Kreuzung von männlichen und weiblichen Fliegen mit dem dunkelsten Phänotyp der Augenfarbe festgestellt. Morphologische Marker werden verwendet, um das metamorphe Stadium von Drosophila während der Metamorphose von der Larve zur adulten Fruchtfliege zu bestimmen. Das Exemplar durchläuft eine Reihe stereotyper Morphologien, die zur Bestimmung des Geschlechts und zur Annäherung an das Entwicklungsstadium herangezogen werden können. Hier.

Eine Wildtyp-Version von A CRE, die als dimorphes Element bezeichnet wird, führt zu einer hohen EGFP-Reporterexpression im ASIC-Abdominalsegment des weiblichen PUY. Es wurde festgestellt, dass eine Sequenz von 13 Basenpaaren innerhalb dieser CRE eine Bindungsstelle für den DSX-Transkriptionsfaktor ist, und die in vivo Bedeutung dieser Sequenz wird durch die Quantifizierung der regulatorischen Aktivität für die CRE bei Mutation dieser Bindungsstelle demonstriert. Quantitative Analysen deuten darauf hin, dass die Mutation dieser DSX-Stelle die regulatorische Aktivität auf 28 plus oder minus 3% der Wildtyp-Expression im Zusammenhang mit der hier verwendeten Transgen-Insertionsstelle reduzierte.

In ähnlichen Vergleichen werden die regulatorischen Aktivitäten für intraspezifische CRE-Allele oder zwischen autologen CREs verschiedener Spezies bewertet, z. B. im Vergleich zu EGFP-Spiegeln im weiblichen Segment. A Sechs, angetrieben von den autologen autologen CREs des Magens D, Melin, Canin S, für die Spezies D-Stimulanzien und D-Willi, besitzen regulatorische Aktivitäten von 75 plus oder minus 4 % bzw. null plus oder minus 0 %. Folgende Verfahren Methoden wie RNA-Interferenz können mit Transkriptionsfaktor-Genen verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie diese Transkriptionsfaktor-Gene mit CYS-regulatorischen Elementen interagieren.

Dies würde durch die Zunahme und Abnahme der Expression von fluoreszierenden Reporterproteinen angezeigt werden, die durch CIS-regulatorische Elemente nach ihrer Entwicklung angetrieben werden. Dieses Verfahren ebnete Forschern auf dem Gebiet der Genregulation den Weg, um die funktionelle Bedeutung von cis-regulatorischen Elementmotiven und evolutionären Mutationen für die Genexpression zu erforschen.