Name: Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Lernen Sie die Identifizierung und Validierung genomischer Enhancer-Elemente mittels ChIP-seq-Analyse und Reporter-Assays in embryonalen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht funktionelle Untersuchungen der Genregulation.

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Die Autoren danken Dr. Bence Daniel, Matt Peloquin, Dr. Endre Barta, Dr. Balint L Balint und Mitgliedern des Nagy-Labors für Diskussionen und Kommentare zum Manuskript. L.N wird durch Zuschüsse des Ungarischen Fonds für wissenschaftliche Forschung (OTKA K100196 und K111941) unterstützt und durch den Europäischen Sozialfonds und den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung sowie das Ungarische Hirnforschungsprogramm - Zuschuss-Nr. KTIA_13_NAP-A-I/9.

1. Enhancer Auswahl Basierend auf Chip-seq Analyse <ol><li> Laden Sie die RXR ChIP-seq Rohdaten fastq Datei (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) von http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ </li><li> Download und Dekomprimierung der erforderlichen BWA-Index-Datei für die Ausrichtung (in unserem Fall: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz HINWEIS: Besuch https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts für weitere Informationen in Bezug auf die Schritte der Analyse der Bioinformatik und die Skripte unter verwendet zum Download bereit. </li><li> Richten Sie das Beispiel fastq Datei zu mm10 Genom (verwenden Sie das Skript aus: perform_alignment.sh). Dies wird einen Ordner mit einer .bam Datei und Statistiken der Ausrichtung erstellen. Aligned RXR ChIP-seq Daten (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) und die entsprechende Indexdatei (.bai) finden Sie hier: http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ HINWEIS: BWA ist ein Software-Paket, das rela ausrichtettiv kurze Sequenzen (zB ChIP-seq Ergebnisse) zu einer Sequenzdatenbank, wie der Maus Bezugsgenom (beispielsweise MM10) 13. </li><li> Führen Sie das Skript (callpeaks.sh) für Spitzen Berufung und de novo - Motiv - Analyse. Verwenden Sie die .bam Datei als Eingabe. Das Drehbuch basiert auf Homer findPeaks 14. HINWEIS: Die Ausgabedateien geben uns Informationen über die Gesamtzahl der Spitzen, die Anreicherung der Motive, der Prozentsatz der Hintergrund, und die Zielsequenzen mit Motiven, etc. (Abbildung 1). Typischerweise werden mehrere Motive in der Reihenfolge ihrer Bedeutung aufgelistet. </li><li> Ordnen Sie den Platz # 1 Motiv (NR Hälfte `AGGTCA`) (verwenden Sie das Skript: remap_motif.sh) HINWEIS: Als Ergebnis erzeugt das Skript eine .bed-Datei, die zeigen, welcher Chip-Spitzen decken genomische Regionen, die die kanonischen Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors von Interesse enthalten. </li><li> Downloaden und visualisieren Ergebnisse der ausgerichteten RXR ChIP-seq liest (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (auch die .bai Download)) und die AGGTCA Motiv Vorkommen (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) durch Integrative Genomics Viewer (IGV) 15 mutmaßliche RAR / RXR - Bindungsstellen (Abbildung 2 und Abbildung 3) zu identifizieren. HINWEIS: Die Integration von verschiedenen ChIP-seq Daten werden helfen , mehr genau vorhersagen 16,17 guter Kandidat Verstärker. Jüngste Studien zeigten , dass aktive Enhancer werden typischerweise für P300 angereichert und korrelieren mit H3K4me1 und H3K27ac und werden in offenen Chromatinstruktur Regionen, wodurch DNase-I - Überempfindlichkeits Anzeige wird ebenfalls 18-21 empfohlen. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Definieren Sie einen Bereich von Interesse&quot; in 15 IGV 200 zu erhalten - 400 bp - Sequenz des ausgewählten genomischen Region und diese Sequenzen für die nachfolgende Primer - Designs verwendet werden . </li></ol> 2. Reporter Assay HINWEIS: Das Luciferin / Luciferase-System wird verwendet,als ein sehr empfindlicher Reporter-Assay für die Transkriptionsregulation. In Abhängigkeit von der Luciferase-Enzym Enhancer-Aktivität erzeugt wird, die die Oxidation von Luciferin katalysieren, wird zu Oxyluciferin in bioluminescense führt, die detektiert werden kann. Als ersten Schritt sollten putative Enhancer identifizierten Sequenzen subkloniert in einen Reportervektor (zB TK-Luciferase 22, pGL3 oder NanoLuc) werden. <ol><li> Primer - Design <ol><li> Design - PCR - Primer für die Amplifikation von 200 bis 400 bp mutmaßlicher Enhancer - Regionen von Primer3 (hier erhältlich: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 </li><li> Copy-Paste die genomische Sequenz von IGV, die die mutmaßliche Bindungsstelle in Primer3 enthält (siehe Schritt 1.7). Set Produktgrößenbereich von 250 bis 300 bp in Primer3. </li><li> Überprüfen Sie die PCR - Primer die UCSC Genome Browser ist In - silico - PCR - Tool (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24 Hinweis: Dieses Protokoll in einem späteren Schritt verwendet HindIII und BamHI-Restriktionsenzymen für die Clonierung. Überprüfen Sie, ob die PCR - amplifizierte Sequenz wie von der UCSC In-silico - PCR - Tool vorhergesagt wird AAGCTT oder GGATCC Restriktionsstellen (zB http://nc2.neb.com/NEBcutter2/) enthalten. </li><li> Erhalten Sie die erforderlichen Primer von einem kommerziellen Anbieter. </li></ol></li><li> PCR - Amplifikation von Enhancer - Sequenz aus genomischer DNA <ol><li> Reinige template genomische DNA aus primären Zellen (zB primäre embryonale Fibroblasten). Verwenden Sie im Handel erhältlichen Kits für gDNA Isolation und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die hohe Qualität der gDNA ist von wesentlicher Bedeutung für eine erfolgreiche PCR-Amplifikation. Geeignete BAC-Klone können verwendet werden, wenn die PCR nicht leicht von gDNA ist. </li><li> Bereiten Sie 50 ul PCR - Reaktion , die 100 ng gDNA, 5 ul 10x - Puffer, 3 ul MgSO 4 (25 mM), 5 ul dNTP (jeweils 2 mM), 1,5 ul Fwd Primer (10 &amp; mgr; M), 1,5 ul Rev - Primer (10 uM) , 1 &amp; mgr; l DNA-Polymerase <li> Stellen Sie die PCR-Zyklus (2 min 95 ° C (20 sec 95 ° C, 10 sec 58 bis 65 ° C, 18 sec 70 ° C) Wiederholungs x25, 2 min 70 ° C, für immer 4 ° C). Eingestellt Glühtemperatur mit der Betrachtung des Primers des vorhergesagten Tm-Werten. </li><li> Man reinige das PCR-Produkt mit einem handelsüblichen PCR Purification Kit und folgen den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Einführung der Restriktionsstellen für die Klonierung durch die PCR mit Primern , Wiederholen , wie oben verwendet, aber das Hinzufügen Auskragungen an ihren 5&#39; - Enden (zB Fwd: 5&#39;-AAGCTT ATAT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3 &#39;(HindIII), Rev: 5&#39;-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 &#39;(BamHI)). </li><li> Versuch 5 &amp; mgr; l des PCR-Produkts auf einem Agarosegel für unspezifische PCR-Produkte zu überprüfen. HINWEIS: Wenn mehrere Bänder festgestellt werden, das gesamte PCR-Produkt führen und das entsprechende Band durch ein kommerzielles Gel-Extraktions-Kits reinigen. </li></ol&gt; </li><li> Beschränkung HINWEIS: Für die Klonierung Insert stromaufwärts von TK - Promotor 22 das gereinigte PCR - Produkt und der Vektor (zB TK-Luc) sollten mit HindIII und BamHI verdaut werden. <ol><li> Vorbereiten eines 50 &amp; mgr; l Reaktionsgemisch, enthaltend 1 &amp; mgr; g gereinigtes PCR Produkt, 1 ul HindIII (20 U / ul), 1 ul BamHI (20 U / ul) und 5 ul 10x-Puffer. </li><li> Bereiten Sie eine 250 &amp; mgr; l Reaktionsgemisch, das 5 ug Vektor (TK Luc oder alternative Reportervektor), 5 ul HindIII (20 U / ul), 5 ul BamHI (20 U / ul), 5 ul thermisch empfindlichen alkalische Phosphatase (1 U / ul) und 25 ul 10x-Puffer. HINWEIS: AP Behandlung des Vektors stark verringert die Selbstligation von Einzel verdauten Vektor und damit den Hintergrund. </li><li> Inkubieren der Reaktionsgemische für 4 h bei 37 ° C, dann die verdauten PCR-Produkte zu reinigen und um den Vektor mit einem handelsüblichen PCR-Reinigungskits. </li></ol></li><li> Ligation <ol><li> Stellen Sie die Reaktion für die Ligation in PCR-Röhrchen mit 2 ul 10x T4-DNA-Ligase-Puffer, 10 ng TK-Luc Vektor, 50 ng Einsatz (verdaute PCR-Produkt), 1 ul T4-DNA-Ligase (400 U / ul) und Nuklease-freies Wasser bis zu 20 &amp; mgr; l. HINWEIS: Bereiten Sie eine negative Kontrolle, wo die Reaktion nicht Insert enthält. </li><li> Vorsichtig mischen, die Reaktion durch Auf- und Abpipettieren, Spin-down kurz die PCR-Röhrchen Mini-Zentrifuge und dann bei RT inkubieren 10 min. </li><li> Hitze inaktiviert bei 65 ° C für 10 min , dann auf Eis kühlen und zu verwenden , 5 &amp; mgr; l des Produkts zur Umwandlung in 50 &amp; mgr; l kompetente Zellen (beispielsweise DH5 &amp; agr;). </li><li> Verwenden Sie Standard-Hitzeschockverfahren Bakterien verwandeln, Kolonien aufzunehmen und Plasmid-DNA mit einem kommerziellen Kit isolieren. Überprüfen Sie alle Konstrukte durch auf die nächsten Schritte vor der Sequenzierung. </li></ol></li><li> Transfektion von ES - Zellen <ol><li> Verwenden Sie 48-Well-Platten. In 200 ul 0,1% Gelatine solutIonen / well 30 min vor der Zell plating. </li><li> Platte embryonale Stammzellen (ES-Zellen) am Tag vor der Transfektion. Verwenden Sie Feeder-freie ES - Zellen und die Platte in einer Dichte von 3 × 10 4 Zellen pro Vertiefung in 250 &amp; mgr; l ES Medien / Vertiefung. </li><li> Bereiten Sie die Plasmid - Mischungen (jede Mischung wird für 8 Vertiefungen berechnet, 4 unbehandeltem und 4 Retinsäure-behandelten) mischen . 1: 1250 ng TK-Luc Leer (Negativkontrolle), 950 ng β-Galactosidase kodierenden Vektor (&amp; beta; Gal), Mix 2 : TK-Luc HOXA1 Enhancer (positive Kontrolle) 1250 ng, 950 ng &amp; bgr; Gal, Mix 3: 1,250 ng TK-Luc PRMT8 Enhancer (Region of Interest), 950 ng &amp; bgr; Gal. HINWEIS: ES-Zellen exprimieren die gewünschten Transkriptionsfaktoren (RAR / RXR). Lassen Sie Brunnen untransfizierten Grundwerte zu bestimmen später während der Luciferase und β-Galactosidase-Messungen. </li><li> In der Transfektion Qualität reduziert Serum Medien zu jedem Plasmid mischen bis zu 106 &amp; mgr; l Gesamtvolumen (ausreichend für 8 Vertiefungen). </li><li> In 4,5 ul ES Qualität transfizierbarenIonen-Reagenz dann durch Pipettieren 15-mal nach oben und unten vorsichtig mischen. Inkubieren Das Transfektionsgemisch für 10 min bei RT. </li><li> In 13 ul des Transfektionsgemisch zu den Zellen pro Vertiefung, gründlich mischen durch Pipettieren. Legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator (37 ° C) O / N vor Ligand Behandlung. </li><li> Entfernen Sie das Medium vorsichtig durch Absaugen von Zellen und 250 &amp; mgr; l frisches Medium / Well, enthaltend 0,01 bis 1 &amp; mgr; M all-trans-Retinsäure (RA) als endgültige Konzentration oder DMSO als Vehikel. Inkubieren Zellen für 24 bis 48 Stunden. HINWEIS: Retinsäure ist lichtempfindlich. </li></ol></li><li> Herstellung von Zelllysaten <ol><li> Verdünnte 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 M Dithiothreitol (DTT) (in H 2 O), 10 ml 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml Glycerin, 5 ml Triton X-100, sterile Wasser bis zu 100 ml) sterilem Wasser auf 1x, fügen Sie 20 ul 1 M DTT / 10 ml und äquilibrieren vor dem Gebrauch auf RT. Herstellung von 10 ml für eine 48-Well-Platte an dem Tag des Assays. </li&gt; <li> Entfernen Sie das Medium vorsichtig durch Absaugen von Zellen. Spülen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. In 200 ul 1x Lysepuffer / Vertiefung direkt zu den Zellen. </li><li> Schütteln für 2 h bei RT (chemische Lyse). Gefriert die Zelllysate auf der Platte bei -80 ° C (mechanische Lyse). Lysate kann für mehrere Tage bei -80 ° C gelagert werden. </li><li> Tauen der Lysate. Nach dem vollständigen Auftauen übertragen Zelllysate auf eine 96-Well-Platte, eine elektronische Multikanal-Pipette. Transfer 80 ul des Zelllysats auf 96-Well-Platte klar für β-Galactosidase-Test und 40 &amp; mgr; l des Zelllysats auf einer weißen Platte für Luciferase-Messung. Vermeiden Sie Blasen bilden. </li></ol></li><li> β-Galaktosidase - Assay HINWEIS: Beta-Galactosidase oder alternativen zweiten Reporter sollten als interne Kontrolle zur Berücksichtigung von nicht-spezifischen experimentellen Variationen verwendet werden. <ol><li> Bereiten β-Galactosidase - Substrat - Puffer: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g KCl, 1,0 g MgSO 4 • 7H 2 O, bis zu 1.000 ml mit sterilem Wasser zu machen. PH-Einstellung auf 7,4. Filter zu sterilisieren (0,2 Mikron) und lagern bei 4 ° C </li><li> Mix 1 ml β-Galactosidase-Substrat-Puffer mit 4 mg ONPG (o-Nitrophenyl-β-D-Galactosidase). Fügen 3,5 ul 2-Mercaptoethanol (&amp; bgr; ME) pro 1 ml des Puffers unmittelbar vor der Verwendung. Füge 100 &amp; mgr; l β-Galactosidase-Substrat-Puffer zu 80 &amp; mgr; l Zelllysat. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 ° C, bis eine schwach gelbe Farbe entwickelt hat. Lesen Sie die Absorption bei OD 420 nm auf einem Plattenleser und Export von Daten. HINWEIS: Die Zeit hängt von der Transfektionseffizienz abhängig, in der Regel nicht länger als 30 min. </li></ol></li><li> Luziferase Assay <ol><li> Bereiten Sie 50 ml Luciferinsubstrat Reagenz: 15,1 mg D-Luciferin Salz, 82,7 mg ATP Salz, 185 mg MgSO 4 • 7H 2 O, in den 50 ml Polypropylen - Röhrchen,dann 1,5 ml 1 M HEPES-Puffer hinzufügen, 48,5 ml ATP freies Wasser, Wirbel, stellen Sie sicher, dass alle Verbindungen vollständig auflösen. Halten von 5 bis 10 ml Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Warm 5 ml Luciferinsubstrat Reagenz auf RT vor dem Start. Je 100 &amp; mgr; l Substratreagenz in jede Vertiefung der weißen Platte, die 40 &amp; mgr; l des Zelllysats enthält, und messen Sie das Signal sofort eine Leucht Zähler Maschine. </li><li> Erhalten Aktivitäten von mindestens drei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausführung Transfektionen. </li><li> Berechnen Sie zuerst die Basis normalisierte Luciferase-Aktivität und die Basis normalisiert β-Galactosidase-Werte für jeden gut durch die Mittelwerte subtrahiert von jedem gemessenen Wert für nicht-transfizierten Zellen gemessen. Dann wird das Verhältnis der Luciferase / β-Galaktosidase-Aktivität. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisierung von RNA-Vergrößerer HINWEIS: Ein direkter Indikator für die Enhancer-Aktivität hat aus den jüngsten Genom-w entstandenide Studien , die viele kurze nicht-kodierenden RNAs, in einer Größe von 50 bis 2.000 nt identifiziert, die von Enhancern transkribiert werden, und Enhancer RNAs bezeichnet (ERNAS) 16,25,26 (Figur 4). erná Induktion korreliert stark mit der Induktion von benachbarten Exon-codierenden Genen. Somit signalabhängige Enhancer - Aktivität kann durch den Vergleich Erna Produktion zwischen verschiedenen Bedingungen durch RT-qPCR in vivo quantifiziert werden. <ol><li> Richtlinien für die Primer - Design für Erna Nachweis von RT-qPCR <ol><li> Wählen Sie genomischen Regionen für Erna Messungen, die mindestens 1,5 sind - 2 kb weg von kommentierten Transkriptionsstartstellen. HINWEIS:, ein hohes Maß an mRNA Transkription über intragenischen Enhancer verhindern genaue Quantifizierung von Erna im Sinne Orientierung, Antisense-Ernas bei intragenischen Enhancer sind nachweisbar und sind ähnlich in der Ebene zu Ernas bei extragenischen Enhancer ist wichtig. </li><li> In der Regel verwenden Regionen 200 - 1000 bp from die Mitte der Transkriptionsfaktor Stelle von Interesse für Primerdesign entweder auf dem Sense- oder Antisense - Strang (Abbildung 4 und Abbildung 6) -Bindung. HINWEIS: Wenn GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 oder H3K27ac ChIP-seq Daten verfügbar sind, von den gewünschten Zelltypen und Bedingungen kann es für eine genauere Primer-Design verwendet werden. Ernas werden aus vermeintlichen Enhancer-Regionen durch ein hohes Maß an H3K4me1 und me3 gekennzeichnet transkribiert. Die Expression von Ernas korreliert positiv mit der Anreicherung von aktivierten Enhancer Histon-Marke H3K27ac. </li><li> Design von PCR - Primern für fluoreszierende Farbstoffbasis RT-qPCR Messung ERNAS durch Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 anti-sense - Sequenz Generieren (reverse Komplement der Sense - Strang) für Primerdesign gemäß: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Einfügen 200-300 bp der Sense- oder Antisense-Sequenz für Primer-Design. </li></ol></li><li> Die Messung der ERNA Transcription </strong&gt; <ol><li> Isolieren der Gesamt-RNA aus behandelten Zellen mit handelsüblichen sauren Phenol / Chloroform-Extraktion basierende Reagenz nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Verwenden Sie DNaseI isolierte RNA behandeln, bevor diese in reverse Transkriptionsreaktion verwendet wird. Inactivate DNase gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor reversen Transkription. </li><li> Messen Sie RNA-Konzentration nach DNase I Behandlung und Verwendung 1000 ng pro RT-Reaktion. Verwenden Sie hochwertige Reverse-Transkriptase. HINWEIS: Wie große Anzahl von ERNAS nicht polyadenyliert werden kann, die reverse Transkription der Verwendung von Zufallsprimern erfordert. </li><li> Detect Reverse Erna von RT-qPCR unter Verwendung von Standardverfahren transkribiert. Messen Sie eine nicht-behandlungsabhängige mRNA für die Normierung (zB 36B4, PPIA, GAPDH, actb). </li></ol></li></ol>

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<li>Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+DNA-binding+and+transcriptional+activation+functions+in+the+human+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor.</a> Cell. 49, 39-46 (1987).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40, e115(2012).</li>
<li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+update+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li>
<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In den letzten Jahren haben Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie groß angelegte Vorhersagen von Enhancern in vielen Zelltypen und Geweben ermöglicht 7-9. Der oben beschriebene Workflow ermöglicht die primäre Charakterisierung von Kandidaten-Enhancern, die auf der Grundlage von ChIP-seq-Daten ausgewählt wurden. Die detaillierten Schritte und Hinweise helfen jedem, eine routinemäßige Enhancer-Validierung im Labor einzurichten.
Der kritischste Schritt beim Luciferase-Reporter-...

Die Entwicklung eines mehrzelligen Organismus erfordert eine präzise regulierte Expression von Tausenden von Genen in sich entwickelnden Geweben. Die Regulation der Genexpression wird zu einem großen Teil durch Enhancer erreicht. Enhancer sind kurze nicht-kodierende DNA-Elemente, die an Transkriptionsfaktoren (TFs) gebunden werden können und aus der Ferne wirken, um die Transkription eines Zielgenszu aktivieren 1. Enhancer sind im Allgemeinen cis-wirksam und am häufigsten direkt stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle (TSS) zu finden, aber neuere Studien beschrieben auch Beispiele, bei denen Enhancer viel weiter flussaufwärts gefunden wurden, auf dem 3' des Gens oder sogar innerhalb der Introns und Exons2. 
Es gibt Hunderttausende von potentiellen Enhancern in den Genomen von Wirbeltieren1. Neuere Methoden, die auf der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basieren, liefern Hochdurchsatzdaten des gesamten Genoms, die für die Enhancer-Analyse verwendet werden können3-9. Obwohl die durch ChIP-seq-Experimente gewonnenen Daten die Wahrscheinlichkeit, zell- und gewebespezifische Enhancer zu identifizieren, stark erhöhen, ist es wichtig zu bedenken, dass nachgewiesene Bindungsstellen nicht unbedingt direkte DNA-Bindungs- und/oder funktionelle Enhancer identifizieren. Daher ist eine weitere funktionelle Analyse der neu identifizierten Enhancer unabdingbar. In dieser Arbeit stellen wir einen grundlegenden dreistufigen Prozess der mutmaßlichen Identifizierung und Validierung von aktiven Enhancern vor. Dazu gehören: 1) Auswahl putativer Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen durch bioinformatische Analyse von ChIP-seq-Daten, 2) Klonierung und Validierung dieser regulatorischen Sequenzen in Reporterkonstrukten und 3) Messung von Enhancer-RNA (eRNA). 
Die Exposition von embryonalen Stammzellen (ES) gegenüber Retinsäure (RA) wird häufig verwendet, um die neuronale Differenzierung der pluripotenten Zellen zu fördern 10. RA entfaltet seine Wirkung, indem es an RA-Rezeptoren (RARα, β, γ) und Retinoid-X-Rezeptoren (RXRα, β, γ) bindet. RARs und RXRs in einer Form von Heterodimeren binden an DNA-Motive, die als RA-Antwortelemente bezeichnet werden und typischerweise als direkte Wiederholungen der AGGTCA-Sequenz (als halbe Stelle bezeichnet) angeordnet sind und die Transkription regulieren. Experimente zur Ligandenbehandlung ermöglichten die Identifizierung mehrerer Retinsäure-regulierter Gene in ES-Zellen 11,12. Allerdings wurden die Enhancer-Elemente für viele dieser Gene noch nicht beschrieben. Um zu demonstrieren, wie der hier beschriebene Workflow zur Identifizierung und Validierung von Enhancern verwendet werden kann, zeigen wir Schritt für Schritt die Auswahl und Charakterisierung von zwei Retinsäure-abhängigen Enhancern in embryonalen Stammzellen.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA-Polymerase</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>für die PCR-Amplifikation von Enhancer aus gDNA</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Taschentuch-Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>für die Isolierung genomischer DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>für die Aufreinigung von PCR-Produkten</td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>für die Gelextraktion, wenn mehr PCR-Produkte</td></tr><tr><td>vorhanden sind HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>Freisetzung von 5'- und 3'-Phosphatgruppen aus DNA</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>für die Ligation</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>für die Plasmidisolierung</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES Medien</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES Medien</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acid</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ES Medien</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES Medien</td></tr><tr><td>Beta Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FuGENE HD&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>für die Transfektion</td></tr><tr><td>All-trans-Retinsäure</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Ligand, zur Aktivierung von RAR/RXR</td></tr><tr><td>96-Well-Klarplatte</td>, <td>Greiner</td><td>655101</td><td>für Beta-Galactosidase-Assay</td></tr>, <tr><td>96-Well-Weißplatte</td>, <td>Greiner</td><td>655075</td><td>für Luciferase-Assay</td></tr>, <tr><td>D-Luciferin, Kaliumsalz</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>für Luciferase-Assay</td></tr>, <tr><td>ATP-Salz</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>für Luciferase-Assay</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>für Luciferase-Assay</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>für Luciferase-Assay</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>für Beta-Galactosidase-Assay</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226; H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>für Beta-Galactosidase-Assay</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>für Beta-Galactosidase-Assay</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>für Beta-Galactosidase-Assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-Nitrophenyl-&beta;-D-Galactosidase)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>für Beta-Galactosidase-Assay</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Reverse-Transkriptionskit für cDNA mit hoher Kapazität</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>reverse Transkription von eRNA</td></tr><tr><td>Rnase-freie Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase-Behandlung</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR-Mastermix</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&trade; Echtzeit-PCR-Nachweissystem</td><td>BioRad</td><td></td><td>qPCR-Maschine</td></tr><tr><td>BioTek Synergy 4 Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>Lumineszenzzähler</td></tr></tbody></table>

vorhersage und validierung von gen-regulatorischen elementen activated während retinsäure induced embryonic stem zelldifferenzierung

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Embryonale Entwicklung ist ein mehrstufiger Prozess, Aktivierung und Unterdrückung vieler Gene beteiligt sind. Enhancer-Elemente im Genom sind dafür bekannt, Gewebe und Zelltyp-spezifische Regulation der Genexpression während der Zelldifferenzierung beizutragen. Somit ist die Identifizierung und die weitere Untersuchung wichtig, um zu verstehen, wie das Zellschicksal bestimmt wird. Integration von Genexpressionsdaten (zB Microarray oder RNA-seq) und die Ergebnisse der Chromatin - Immunopräzipitation (ChIP) -basierten genomweite Studien (ChIP-seq) ermöglicht große Identifizierung dieser Regulationsregionen. Jedoch funktionellen Validierung von zelltypspezifischen Enhancern erfordert weitere in vitro- und in vivo experimentellen Verfahren. Hier beschreiben wir, wie aktive Enhancer kann experimentell identifiziert und validiert werden. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Workflow, der folgendes beinhaltet: 1) Identifizierung der regulatorischen Regionen von ChIP-seq Datenanalyse, 2) Klonierung und expertellen Validierung putative regulatorische Potential der identifizierten genomischen Sequenzen in einem Reporter - Assay, und 3) Bestimmung der Enhancer - Aktivität in vivo durch Enhancer - RNA - Transkript Ebene zu messen. Das vorgestellte Protokoll ist detailliert genug, jedem zu helfen diesen Workflow im Labor einzurichten. Wichtig ist, dass das Protokoll einfach und in jedem zellulären Modellsystem verwendet, angepasst werden.

Wir haben eine pan-spezifischen Antikörper RXR um Gene Rezeptor genomweite, welche RA-geregelt zu identifizieren Anreicherung in ihrer Nähe. Bioinformatik - Analyse von RXR ChIP-seq Daten aus ES - Zellen mit Retinsäure behandelt erhalten zeigten die Anreicherung des Kernrezeptor - Halbstelle (AGGTCA) unter der RXR Stellen besetzt (Abbildung 1). Mit Hilfe eines bioinformatischen Algorithmus abgebildet wir das Motiv Suchergebnisse der Hälfte Website zu den RXR ChIP-seq Dat...

In dieser Arbeit stellen wir einen experimentellen Workflow zur Verfügung, wie aktive Enhancer identifiziert und experimentell validiert werden können.

Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, einen integrierten Satz von Methoden bereitzustellen, um genomische regulatorische Elemente, sogenannte Enhancer, zu identifizieren und experimentell zu validieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Transkription und Regulation biologischer Vorgänge zu beantworten, einschließlich der Auswahl und Nutzung von Enhancern während der Zell-Differenzierung oder als Reaktion auf externe Stimuli. Der Hauptvorteil des vorgestellten Arbeitsablaufs liegt darin, dass das Protokoll leicht angepasst und in beliebigen zellulären Modellsystemen verwendet werden kann.Ich werde die Schritte des Verfahrens demonstrieren. Beginnen Sie damit, einen Kandidaten-Enhancer basierend auf einer vorhandenen ChIP-seq-Analyse auszuwählen. Verwenden Sie einen Genombrowser, um die Ergebnisse des gewünschten ChIP-seq-Experiments anzusehen, und identifizieren Sie Bindungsstellen in der Nähe des Gens von Interesse.Wählen Sie „Region of Interest definieren“, um eine 200–400 Basenpaare lange Sequenz des ausgewählten genomischen Bereichs zu erhalten, und verwenden Sie die Sequenzen für die anschließende Primer-Design. Amplifizieren und klonen Sie den ausgewählten

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Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Reporter-Assay schnell zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Selbst-Erneuerung zu regulieren.

Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

Das Video demonstriert die Methode zur Induktion der Stammzelldifferenzierung in neuronale Vorläuferzellen mit Retinsäure und der Methode der hängenden Tropfenkultur.

Differenzierung embryoider Körperzellen in neurale Vorläuferzellen mit Hilfe von Retinsäure

Dieses Video zeigt eine Technik zur Beurteilung der Retinsäureaktivität in Mausembryonen. Nach der Isolierung von Zellen aus den Mausembryonen werden die Zellen mit Retinsäure (RA)-Reporterzellen co-kultiviert. Embryonale Zellen produzieren RA, die die Beta-Galactosidase-Expression in Reporterzellen induziert, was auf die RA-Aktivität in den embryonalen Zellen hinweist.

Einsatz von Reporterzellen in einer Co-Kultur zur Untersuchung der Retinsäureproduktion durch embryonale Zellen der Maus

Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse aus heterogenen Populationen. Jedoch Gen-Targeting unter Verwendung von herkömmlichen homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen äußerst ineffizient. Hier beschreiben wir Targeting ZNS Mittelhirn spezifischen Transkriptionsfaktor PITX3 Ortes mit EGFP mit Zink-Finger-Nuklease verbesserte homologe Rekombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

Die Manipulation der temporalen Genexpression in differenzierenden embryonalen Stammzellen (ESCs) kann mit induzierbaren Gensystemen erreicht werden. Die Erzeugung dieser Zelllinien ist jedoch kostspielig und zeitaufwändig. Dieses Protokoll erreicht eine schnelle Expression eines Transgens bei der Differenzierung von ES-abgeleiteten Zellen und die anschließende Analyse der nachgeschalteten hämatopoetischen Differenzierung.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung von differenzierten humanen embryonalen Stammzellen, die in Richtung der endgültigen Endoderm zur Verbesserung der Downstream-Anwendungen und weitere Differenzierungen begangen werden.

Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

Methoden zur genauen Messung des Retinsäurespiegels (RA) in kleinen Gewebemengen existieren nicht. Dieses Protokoll beschreibt die einfache, quantitative Messung der relativen RA-Spiegel in E8,5-Embryonen und Neurosphären mit Hilfe einer RA-Reporterzelllinie.

Quantitative Messung der relativen Retinsäure Niveaus in E8.5 Embryonen und Neurosphäre Kulturen Mit der F9 RARE-Lacz Zell-basierte Reporter Assay

Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

Der durchnässte Perlenassay beinhaltet die gezielte Abgabe von Testreagenzien zu jedem Entwicklungszeitpunkt, um die Regulation der Zelldifferenzierung und Morphogenese zu untersuchen. Es wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das auf jedes Versuchstiermodell anwendbar ist, um drei verschiedene Arten von getränkten Perlen herzustellen und diese in die Zwischenziffer eines Hühnerembryos zu implantieren.

Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

Lernen Sie die Identifizierung und Validierung genomischer Enhancer-Elemente mittels ChIP-seq-Analyse und Reporter-Assays in embryonalen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht funktionelle Untersuchungen der Genregulation.

Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung (Video) | JoVE Journal

Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

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