Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, einen integrierten Satz von Methoden zur Identifizierung und experimentellen Validierung von genemischen regulatorischen Elementen, sogenannten Enhancern, bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Transkription und Regulation biologischer Ereignisse zu beantworten, einschließlich der Auswahl und Verwendung von Enhancern, der Zelldifferenzierung oder der Reaktion auf externe Reize. Der Hauptvorteil des vorgestellten Arbeitsablaufs besteht darin, dass ein Protokoll leicht angepasst und in beliebigen zellularen Modellsystemen verwendet werden kann.

Ich werde die Schritte des Verfahrens demonstrieren. Wählen Sie zunächst einen Kandidaten-Enhancer basierend auf einer bereits vorhandenen Chip-Seq-Analyse aus. Verwenden Sie einen Genombrowser, um die Ergebnisse des gewünschten Chip-Seq-Experiments anzuzeigen und Bindungsstellen in der Nähe des interessierenden Gens zu identifizieren.

Wählen Sie "Region of Interest definieren", um eine Sequenz von 200 bis 400 Basenpaaren der ausgewählten genomischen Region zu erhalten und die Sequenzen für das nachfolgende Primer-Design zu verwenden. Mit molekularbiologischen Standardtechniken können Sie die ausgewählte genomische Region amplifizieren und zu einem Reporterplasmid-Konstrukt klonen. Um die Enhancer-Aktivität zu testen, transfizieren Sie die Reporterkonstrukte in embryonale Massenstammzellen, indem Sie zunächst 200 Mikroliter 0,1%ige Gelatinelösung pro Vertiefung auf 48-Well-Platten geben.

Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang, bevor Sie sie anrichten. Am Tag vor der Transfektion werden Plattenzuführer-freie embryonale Stammzellen oder ES-Zellen in 250 Mikroliter ES-Medium mit einer Dichte von dreimal 10 bis zu den vierten Zellen pro Vertiefung gelegt. Bereiten Sie am Tag der Transfektion die Plasmidmischungen vor, so dass aus jeder Mischung acht Vertiefungen entnommen werden können.

Fügen Sie jeder Plasmidmischung reduziertes Serummedium in Transfektionsqualität hinzu, um das Volumen auf 106 Mikroliter zu erhöhen. Fügen Sie dann 4,5 Mikroliter Transfektionsreagenz in ES-Qualität hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie 15 Mal auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation 13 Mikroliter pro Vertiefung der Transfektionsmischung in die Zellen geben und durch Pipettieren gründlich mischen. Legen Sie die Zellen dann über Nacht vor der Flechtenbehandlung wieder in den Inkubator. Die Effizienz der Transfektion ist ein entscheidender Schritt.

Wenn ein anderer Zellentyp verwendet wird, muss dieser Schritt optimiert werden. Verwenden Sie den relevantesten Zelltyp, um die Enhancer-Aktivität zu testen und die kontextabhängigen Effekte zu minimieren. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium vorsichtig durch Aspiration und fügen Sie 250 Mikroliter frisches Medium pro Vertiefung hinzu, das ein Mikromolar all-trans-Retinsäure oder DMSO als Vehikel enthält.

Inkubieren Sie die Zellen für 24-48 Stunden. Nach der Herstellung des Lysepuffers gemäß dem Textprotokoll wird das Medium vorsichtig aus den Zellen aspiriert. Verwenden Sie 1X PBS, um die Zellen einmal aufzurichten, und fügen Sie dann 200 Mikroliter 1X Lysepuffer pro Vertiefung hinzu.

Schütteln Sie die Zellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Für eine vollständige Zelllyse frieren Sie dann die Zelllysate in der Platte bei 80 Grad Celsius ein. Nach dem vollständigen Auftauen der Lysate werden mit einer elektronischen Mehrkanalpipette 80 Mikroliter des Zelllysats auf eine klare 96-Well-Platte für die Beta-Galactosidase und 40 Mikroliter des Lysats auf eine weiße Platte für die Luziferase-Messung übertragen.

Um die Beta-Galactosidase durchzuführen, mischen Sie einen Milliliter des Beta-Gal-Substratpuffers mit vier Milligramm OMPG. Fügen Sie dann 3,5 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol zu der Mischung hinzu und fügen Sie sofort 100 Mikroliter des Puffers zu den 80 Mikrolitern Zelllysat hinzu. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius, bis sich die schwache gelbe Farbe entwickelt.

Lesen Sie die Absorption bei 420 Nanometern auf einem Plattenlesegerät ab und exportieren Sie die Daten. Um den Luciferase-Assay durchzuführen, erwärmen Sie das Luciferase-Substratreagenz nach der Vorbereitung des Substratreagenzes gemäß dem Textprotokoll auf Raumtemperatur, bevor Sie beginnen. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter in jede Vertiefung der weißen Platte, die die 40 Mikroliter Zelllysat enthält.

Verwenden Sie sofort ein lumineszierendes Zählgerät, um das Signal zu messen. Erwerben Sie die Aktivitäten aus mindestens drei unabhängigen Transfektionen und Experimenten. Führen Sie Berechnungen für beide Assays gemäß dem Textprotokoll durch.

Um die Primer für den eRNA-Nachweis mittels RTCPR zu entwerfen, wählen Sie eine genomische Region aus, die mindestens 1,5 bis zwei Kilobasen von annotierten Gentranskripten entfernt ist. Identifizieren Sie die relative Richtung des Gens und bestimmen Sie die Position der Sinnes- und Antisense-Transkripte. Um Primer für die Enhancer-RNA-Quantifizierung zu entwerfen, wählen Sie die Regionen 200-1.000 Basenpaare von der Mitte der Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors entfernt.

Wenn sich das Gen auf dem Minusstrang befindet, kopieren Sie 200-300 Basenpaare des positiven Strangs und wandeln Sie die Sequenz um, um die umgekehrte Komplementsequenz zu erhalten. Verwenden Sie dann diese Sequenz für das nachfolgende Primer-Design. Stellen Sie den Produktgrößenbereich zwischen 80 und 150 Basispaaren ein.

Um die eRNA-Transkription zu messen, wird nach der Isolierung der Gesamt-RNA aus behandelten Zellen gemäß dem Textprotokoll reverse transkribierte eRNA durch RTCPR unter Verwendung eines Standardverfahrens nachgewiesen. Messen Sie eine nicht behandlungsabhängige mRNA zur Normalisierung. Wie hier gezeigt, zeigte die bioinformatische Analyse von RXR-Chip-Seq-Daten, die von ES-Zellen erhalten wurden, die mit Retinsäure behandelt wurden, die Anreicherung der nukleären Rezeptorhälfte unter den RXR-besetzten Stellen.

Mit Hilfe eines bioinformatischen Algorithmus wurden die Motivsuchergebnisse für die halbe Stelle auf die RXR-Chip-Seq-Daten zurückgeführt. Diese Analyse identifizierte Chip-Peaks, die sich mit kanonischen Kernrezeptor-Bindungsstellen überlappen. Die Visualisierung der Stellen im IGV deutete auf eine Anreicherung der Transkriptionsfaktoren in der Nähe von Hoxa1 hin.

Ein zuvor charakterisiertes RAR RXR-Ziel. Ein Strafverstärker für eine neuartige RA-Zielkette, PRMT8, wurde ebenfalls identifiziert. Die identifizierten Enhancer-Regionen wurden in einen TK-Luciferase-Reportervektor kloniert, und ES-Zellen wurden mit diesen Konstrukten transfiziert.

Die Luziferase-Aktivität wurde in Abwesenheit und Vorhandensein von RA gemessen. Die Konstrukte, die das RA-Response-Element (RARE) enthielten, zeigten eine erhöhte Luziferase-Signalintensität nach der RA-Behandlung, während das Konstrukt ohne RARE nicht induziert wurde. Um festzustellen, ob die sense- und anti-sense-eRNA-Expression des Hoxa1 RAR RXR-gebundenen Enhancers mit der mRNA-Expression des Gens korreliert, wurde auch der Gehalt an Hoxa1 eRNA gemessen. Die Ergebnisse bestätigten, dass die Enhanceraktivität durch eine kurzfristige RA-Behandlung induziert wird.

Einmal gemeistert, kann diese Arbeitsbelastung in wenigen Tagen erledigt werden, indem das beschriebene Enhancer-Trap-Experiment und die Enhancer-Quantifizierung durchgeführt werden, kann man starke funktionelle Beweise für die Enhancer-Aktivität liefern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Strafverstärker identifiziert und charakterisiert. Sobald ein Enhancer identifiziert und validiert ist, können andere Methoden, wie z. B. Chromosomal Confirmation Capture (CCC), durchgeführt werden, um weitere wichtige Fragen zu beantworten, z. B. welches Gen durch den validierten Enhancer reguliert wird.