Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, einen integrierten Satz von Methoden bereitzustellen, um genomische regulatorische Elemente, sogenannte Enhancer, zu identifizieren und experimentell zu validieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Transkription und Regulation biologischer Vorgänge zu beantworten, einschließlich der Auswahl und Nutzung von Enhancern während der Zell-Differenzierung oder als Reaktion auf externe Stimuli. Der Hauptvorteil des vorgestellten Arbeitsablaufs liegt darin, dass das Protokoll leicht angepasst und in beliebigen zellulären Modellsystemen verwendet werden kann.

Ich werde die Schritte des Verfahrens demonstrieren. Beginnen Sie damit, einen Kandidaten-Enhancer basierend auf einer vorhandenen ChIP-seq-Analyse auszuwählen. Verwenden Sie einen Genombrowser, um die Ergebnisse des gewünschten ChIP-seq-Experiments anzusehen, und identifizieren Sie Bindungsstellen in der Nähe des Gens von Interesse.

Wählen Sie „Region of Interest definieren“, um eine 200–400 Basenpaare lange Sequenz des ausgewählten genomischen Bereichs zu erhalten, und verwenden Sie die Sequenzen für die anschließende Primer-Design. Amplifizieren und klonen Sie den ausgewählten genomischen Bereich mit standardmäßigen Methoden der Molekularbiologie in ein Reporterkonstrukt. Um die Enhancer-Aktivität zu testen, transfizieren Sie die Reporterkonstrukte in massenhaft embryonale Stammzellen, indem Sie pro Well 200 Mikroliter einer 0,1 %igen Gelatinelösung zu 48-Well-Platten hinzufügen.

Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten vor der Aussaat. Am Tag vor der Transfektion säen Sie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) ohne Futterzellen in 250 Mikroliter ES-Medium mit einer Dichte von drei mal 10 hoch vier Zellen pro Vertiefung aus. Bereiten Sie am Tag der Transfektion die Plasmidmischungen vor, wobei für jede Mischung ausreichend für acht Vertiefungen hergestellt wird.

Geben Sie transfektionsfähiges Medium mit reduziertem Serumanteil zu jeder Plasmidmischung, um das Volumen auf 106 Mikroliter aufzufüllen. Fügen Sie anschließend 4,5 Mikroliter transfektionsfähiges Reagenz der ES-Qualität hinzu und mischen Sie vorsichtig durch 15maliges Auf- und Abpipettieren. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation 13 µL pro Vertiefung des Transfektionsgemischs zu den Zellen geben und durch Pipettieren gründlich mischen. Anschließend die Zellen über Nacht zurück in den Inkubator stellen, bevor die Flechtenbehandlung erfolgt. Die Transfektionseffizienz ist ein kritischer Schritt.

Wenn ein anderer Zelltyp verwendet wird, erfordert dieser Schritt eine Optimierung. Verwenden Sie den am besten geeigneten Zelltyp, um Enhancer-Aktivität zu testen, um kontextabhängige Effekte zu minimieren. Am folgenden Tag entfernen Sie vorsichtig das Medium durch Aspiration und geben 250 Mikroliter frisches Medium pro Vertiefung hinzu, das ein Mikromolar all-trans-Retinsäure oder DMSO als Fahrzeug enthält.

Inkubieren Sie die Zellen für 24–48 Stunden. Nachdem Sie den Lysepuffer gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, aspirieren Sie vorsichtig das Medium von den Zellen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS, dann geben Sie 200 Mikroliter 1X Lysepuffer pro Vertiefung hinzu.

Schütteln Sie die Zellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Anschließend frieren Sie die Zelllysate in der Platte zur vollständigen Zelllyse bei 80 Grad Celsius ein. Nach vollständigem Auftauen der Lysate übertragen Sie mithilfe einer elektronischen Mehrkanalpipette 80 Mikroliter des Zelllysats in eine klare 96-Well-Platte für die Beta-Galactosidase-Bestimmung und 40 Mikroliter des Lysats in eine weiße Platte für die Luciferase-Messung.

Um die Beta-Galactosidase-Reaktion durchzuführen, mischen Sie ein Milliliter des Beta-Gal-Substratpuffers mit vier Milligramm OMPG. Geben Sie dann 3,5 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol zur Mischung und fügen Sie unverzüglich 100 Mikroliter des Puffers zu 80 Mikrolitern Zelllysat hinzu. Inkubieren Sie die Ansätze bei 37 Grad Celsius, bis sich eine schwache gelbe Färbung entwickelt.

Lesen Sie die Absorption bei 420 Nanometern mit einem Plattenreader ab, und exportieren Sie die Daten. Um den Luciferase-Assay durchzuführen, erwärmen Sie nach der Herstellung des Substratreagenz gemäß dem Textprotokoll das Luciferase-Substratreagenz auf Raumtemperatur, bevor Sie beginnen. Danach pipettieren Sie 100 µL in jedes Loch der weißen Platte, die 40 µL Zelllysat enthält.

Verwenden Sie unverzüglich eine Luminometer-Maschine, um das Signal zu messen. Bestimmen Sie die Aktivitäten aus mindestens drei unabhängigen Transfektionen und Experimenten. Führen Sie die Berechnungen für beide Assays gemäß dem Textprotokoll durch.

Um die Primer für die eRNA-Detektion mittels RT-PCR zu entwerfen, wählen Sie einen genomischen Bereich, der mindestens 1,5 bis zwei Kilobasen von annotierten Gentranskripten entfernt liegt. Identifizieren Sie die relative Orientierung des Gens und bestimmen Sie die Position der Sinus- und Antisinnus-Transkripte. Um Primer für die Quantifizierung der Enhancer-RNA zu entwerfen, wählen Sie Bereiche 200–1.000 Basenpaare vom Zentrum der Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle entfernt.

Wenn sich das Gen auf dem Minus-Strang befindet, kopieren Sie 200–300 Basenpaare des positiven Strangs und wandeln Sie die Sequenz in die komplementäre Reverse Sequenz um. Verwenden Sie anschließend diese Sequenz für die Primer-Designs. Legen Sie den Produktgrößenbereich zwischen 80 und 150 Basenpaaren fest.

Um die eRNA-Transkription zu messen, nachdem die Gesamt-RNA gemäß dem Textprotokoll aus behandelten Zellen isoliert wurde, detektieren Sie die revers transkribierte eRNA mittels RT-PCR unter Verwendung eines Standardverfahrens. Messen Sie ein nicht behandlungsabhängiges mRNA-Molekül zur Normalisierung. Wie hier gezeigt, offenbarte die Bioinformatik-Analyse von RXR-ChIP-seq-Daten, die aus ES-Zellen gewonnen wurden, die mit Retinsäure behandelt worden waren, eine Anreicherung der Halbstelle des nukleären Rezeptors unter den von RXR besetzten Stellen.

Mithilfe eines Bioinformatik-Algorithmus wurden die Ergebnisse der Motivsuche für die Halbstelle den RXR-Chip-Seq-Daten zugeordnet. Diese Analyse identifizierte Chip-Peaks, die mit kanonischen Bindungsstellen von nukleären Rezeptoren überlappen. Die Visualisierung der Stellen in IGV zeigte eine Anreicherung der Transkriptionsfaktoren in der Nähe von Hoxa1.

Ein zuvor charakterisiertes RAR-RXR-Ziel. Es wurde ebenfalls ein fördernder Enhancer für eine neuartige RA-Zielkette, PRMT8, identifiziert. Die identifizierten Enhancer-Bereiche wurden in einen TK-Luciferase-Reporter-Vektor kloniert, und ES-Zellen wurden mit diesen Konstrukten transfiziert.

Die Luciferase-Aktivität wurde in Abwesenheit und Anwesenheit von RA gemessen. Die Konstrukte, die das RA-Reaktions-Element (RARE) enthielten, zeigten nach RA-Behandlung eine erhöhte Luciferase-Signalintensität, während das Konstrukt ohne RARE nicht induziert wurde. Um festzustellen, ob die Expression der sinn- und antisinnständigen eRNA des Hoxa1 RAR RXR-gebundenen Enhancers mit der mRNA-Expression des Gens korreliert, wurde ebenfalls die Menge der Hoxa1-eRNA gemessen. Die Ergebnisse bestätigten, dass die Enhancer-Aktivität durch eine kurzzeitige RA-Behandlung induziert wird.

Wenn man diese Arbeitsabläufe beherrscht, kann die Arbeit innerhalb weniger Tage erledigt werden; durch die Durchführung des beschriebenen Enhancer-Trap-Experiments und der Enhancer-Quantifizierung lassen sich starke funktionelle Hinweise auf Enhancer-Aktivität liefern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man punitive Enhancer identifizieren und charakterisieren kann. Sobald ein Enhancer identifiziert und validiert ist, können weitere Methoden wie die chromosomale Konformations-Capture- oder CCC-Methode durchgeführt werden, um zusätzliche wichtige Fragen zu beantworten, beispielsweise, welches Gen durch den validierten Enhancer reguliert wird.