Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu untersuchen, wie die Proteolyse von Cyclin B den Beginn der Anaphase und den Übergang aus der Mitose steuert. Dies wird erreicht, indem zunächst Cyclin-B-SNAP-Reporterzellen auf Mikroskopieobjektträger ausgesät werden. Im zweiten Schritt wird das chimäre Cyclin-B-SNAP-Reporter-Molekül mit dem fluoreszierenden Substrat TMR Star markiert.

Anschließend werden die Bildserien an einer Mikroskopie-Station aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen zu analysieren und die Fluoreszenzintensität des TMR-Sterns über die Zeit zu berechnen, was dem Proteolyseprozess von Cyclin B entspricht. Letztendlich zeigt die Immunfluoreszenzmikroskopie lebender Reportorzellen die Kinetik der während der Mitose stattfindenden Cyclin-B-Proteolyse auf.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Überwachung von Cyclon BGFP besteht darin, dass Cyclon B SNAP die Beobachtung des Abbaus von Cyclon B ermöglicht, anstatt der Gesamtproteinsynthese. Die SNAP-Berichterzellen für dieses Experiment werden zunächst mindestens 48 Stunden lang unabhängig voneinander in der exponentiellen Wachstumsphase wachsen gelassen. Um zu beginnen, besteht das Verfahren zum Ansäen von Trypsin darin, die subkonfluenten SNAP-Berichterzellen gleichmäßig auf acht-Well-Mikroskopkammern zu säen, wobei eine konstante Verteilung über die gesamte Oberfläche der Kammerzentrifuge gewährleistet ist.

10.000 Zellen und Resus in 350 Mikrolitern eines phenolrotfreien normalen Wachstumsmediums. Überführen Sie die Zellsuspension in die Mikroskopkammer, um die Zellen auf achtlochigen Mikroskopkammern mit maximaler Zelldichte in der Mitte der Kammer auszusäen. Befüllen Sie die Kammer zunächst mit 300 Mikrolitern phenolrotfreiem normalem Wachstumsmedium.

Fügen Sie anschließend vorsichtig 5.000 Zellen in die Mitte der Mikroskopkammer hinzu, um Zellen auf 96-Well-Sonderoptikplatten mit gleichmäßiger Verteilung über die gesamte Oberfläche der Vertiefung auszusäen. Zentrifugieren Sie 5.000 Zellen und resuspendieren Sie sie in 300 Mikrolitern phenolrotfreiem normalem Wachstumsmedium, abhängig von der Gesamtanzahl der Zellen enthaltenden Vertiefungen, die benötigt werden. Passen Sie die Zellanzahl und das Gesamtvolumen des Suspensionsmediums an.

Überführen Sie dann die Zellsuspension in eine 96-Well-Platte, um die Zellen auf 96-Well-Spezialoptikplatten mit maximaler Zelldichte in der Mitte des Wells zu säen. Geben Sie vorsichtig 1.500 Zellen in 15 Mikroliter phenolrotfreiem normalem Wachstumsmedium als kleinen Tropfen in die Mitte jedes Wells.

Dadurch wird das Zellwachstum auf die Mitte der Vertiefung beschränkt. Lassen Sie alle ausgesäten Zellen mindestens 18 Stunden unter standardmäßigen Zellkulturbedingungen wachsen, 30 Minuten vor Beginn der Färbe-Prozedur. Erwärmen Sie Mengen des phenolrotfreien normalen Wachstumsmediums auf 37 Grad Celsius.

Das Schnapp-Substrat in dieser Demonstration ist TMR star, um eine einfache Handhabung zu ermöglichen. Lösen Sie TMR star in DMSO, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 400 µM zu erhalten. Verdünnen Sie 0,5 µL der TMR star-Stammlösung in 200 µL warmem, phenolrotfreien Normalkulturmedium, um eine endgültige Markierungskonzentration von 1 µM zu erreichen. Entfernen Sie anschließend das Normalkulturmedium von den asynchron wachsenden Zellen und ersetzen Sie es durch das Markierungsmedium. Inkubieren Sie die Zellen 25 Minuten lang unter standardmäßigen Kulturbedingungen im Markierungsmedium.

Nach 25 Minuten das Markierungsmedium entfernen und die Zellen viermal mit warmem, phenolrotfreiem normalem Wachstumsmedium waschen. Nach dem letzten Waschschritt die Zellen 30 Minuten in 300 Mikrolitern warmem, phenolrotfreiem normalem Wachstumsmedium inkubieren, bevor sie zum Mikroskop transportiert werden. Das Medium durch frisches, warmes, phenolrotfreies, normales Wachstumsmedium ersetzen, um überschüssiges, nicht gebundenes SNAP-Substrat zu entfernen, und die Zellen zum Mikroskop in einer Styroporschachtel auf einem vorgewärmten Wärmeblock bei 37 Grad Celsius transportieren.

Um Temperaturschwankungen zwei Stunden vor der Messung der Fluoreszenzintensität zu minimieren, stellen Sie die Lufttemperatur der Klimakammer auf 37 Grad Celsius im Trockenmodus ein, um das Mikroskop und alle seine Komponenten auf die gewünschte Temperatur zu bringen. Um Kondensation und daraus resultierende Schäden am Mikroskop zu vermeiden, ist es wichtig, vor dem Einstellen der Luftfeuchtigkeit vorzuheizen.

Wenn das gesamte Mikroskopsystem 37 Grad Celsius erreicht hat, stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 60 % und den Kohlendioxidgehalt auf 5 % ein. Starten Sie die Scan- oder Aufnahmesoftware und definieren Sie die Standardeinstellungen. Legen Sie die Positionen der zu analysierenden Vertiefungen fest. Definieren Sie den Delta-T- oder Akquisitionszykluszeit und die absolute Anzahl der Akquisitionszyklen.

In dieser Demonstration ist die hardwarebasierte Autofokusfunktion für die Analyse einer größeren Anzahl von Vertiefungen vorausgewählt. Starten Sie die Aufnahme und überwachen Sie die ersten beiden Aufnahmeyklen.

Das Mikroskop fokussiert auf das Histon H2-GFP-Signal und nimmt anschließend ein erstes Bild in diesem Kanal auf, bevor der Filter gewechselt wird und das entsprechende TMR-Star-Bild aufgenommen wird. Dies wird dann für alle Positionen innerhalb einer Vertiefung und für jede der zu untersuchenden Vertiefungen wiederholt, bevor der nächste Zyklus erneut durchlaufen wird. Um proteolytische Profile zu analysieren, starten Sie die ScanR-Analyse-Software.

Analysieren Sie die Bilder mit den Zellkernen, die durch Histone H zwei GFP sichtbar gemacht wurden und als Hauptobjekt mithilfe eines Schwellenwerts basierend auf der Signalintensität sowie eines Watershed-Algorithmus zur Unterstützung der Trennung benachbarter Zellen definiert wurden. Für die TMR-Stern-Analyse sollte ein Unterobjekt bestehend aus Kern und Zytoplasma erstellt werden. Wichtige Eigenschaften des Hauptobjekts sind die X- und Y-Positionen, die Zeit sowie die maximale und mittlere Intensität von GFP für das Hauptobjekt und die Gesamtintensität geteilt durch die Fläche.

Ändern Sie für das TMR-Stern-Subobjekt in den Spurmodus, um die mittlere TMR-Stern-Fluoreszenzintensität im Verlauf der Zeit oder Zellspuren, die den analysierten Hauptobjekten zugeordnet sind, zu visualisieren. Die Betrachtung einer größeren Anzahl von Zellen ermöglicht einen ersten repräsentativen und objektiven Überblick; die Anzahl der zu untersuchenden Zellen kann jedoch eingeschränkt werden, indem nur Messungen berücksichtigt werden, die mindestens 140 Zyklen dauern und eine hohe maximale Histon-H2-GFP-Intensität aufweisen. Wählen Sie eine Zellspur von Interesse aus, um auf Einzelzellniveau gleichzeitig die Fluoreszenz von Histon H2-GFP und TMR-Stern zu visualisieren.

Rechtsklicken Sie mit der Maus auf eine Zelle von Interesse und erzeugen Sie ein exportierbares Bild. Galerie zur Veranschaulichung von Histon H zwei GFP und Cyclin B Snap TMR Stern für jeden einzelnen Zeitpunkt. Wechseln Sie in den Populationsmodus der Scanner-Analysesoftware und markieren Sie den Bereich, in dem die Zelle von Interesse im Dotblot dargestellt ist.

Wenden Sie ein neues Punktdiagramm-Fenster auf den ausgewählten Bereich an und visualisieren Sie die mittlere TMR-Stern-Fluoreszenzintensität über die Zeit. Exportieren Sie die Daten nach Microsoft Excel für weitere Berechnungen. Die hier gezeigten Abbildungen stellen die Cyclin-B-Kinetik dar, dargestellt durch eine TMR-Stern-Fluoreszenzintensitätskurve einer Zelle, die eine reguläre Mitose durchläuft, ohne Anzeichen einer chromosomalen Fehlausrichtung nach der Zytoplasma-Verringerung im Anschluss an den Zerfall der Kernhülle oder NEBD, wie durch das rote Dreieck angegeben. Die TMR-Staph-Fluoreszenzintensität zeigt einen plötzlichen Anstieg, bis das isomorphe Fenster erreicht ist.

Wenn die Zelle in die Prometaphase eintritt, bleibt die Fluoreszenzintensität auf einem stabilen Niveau, solange die Zelle die Prophase und Metaphase durchläuft, und beginnt dann schnell abzufallen. Sobald alle Chromosomen eine stabile Metaphasenplatte gebildet haben, geht dieses Absinken der Intensität der Chromosomen-Trennung voraus. Während der Anaphase, gekennzeichnet durch den blauen Punkt auf der Kurve in der späten Mitose, beginnt das Chromatin, sich zu entfalten, und die Zelle nimmt eine Phasen-Morphologie an.

Während die Fluoreszenzintensitätskurve sich einem Plateau nähert, das niedriger ist als das Plateau vor der Mitose nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Mitose den Weg, um das enge Gleichgewicht zwischen Zellzyklus, Proteindegradation und -synthese zu untersuchen, das die Mitoseprogression reguliert.