Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Metaphase zur Anaphase Übergang durch Anaphase-promoting complex (APC / C)-abhängige Ubiquitinierung und anschließende Zerstörung von Cyclin B. Hier haben wir ein System, das Pulse-Chase-Kennzeichnung nach, ermöglicht die Überwachung Cyclin B Proteolyse im gesamten Zellpopulationen und wird ausgelöst, erleichtert den Nachweis von Störungen durch den mitotischen Checkpoint.

Ziel dieses Verfahrens ist es, zu überwachen, wie die Proteolyse von Zyklus B den Beginn der Anaphase und den Mitoseaustritt steuert. Dies wird erreicht, indem zunächst der Aussaatzyklus von B-Snap-Reporterzellen auf Mikroskopie-Objektträgern durchgeführt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das chimäre Cyclin-B-Snap-Reportermolekül mit dem fluoreszierenden Substrat TMR-Stern zu markieren.

Anschließend werden die Bildserien an einer Mikroskopiestation aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, Zellen zu analysieren und die Fluoreszenzintensität des TMR-Sterns über die Zeit zu berechnen, die die zyklische B-Proteolyse widerspiegelt. Letztendlich zeigt die Immunfluoreszenzmikroskopie von lebenden Reporterzellen die Kinetik der zyklischen B-Proteolyse, die während der Mitose stattfindet.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Überwachung von Zyklon-BGFP besteht darin, dass Zyklon B SNAP die Überwachung des Zyklon-B-Abbaus und nicht die Expression des gesamten Proteins ermöglicht. Die Snap-Reporterzellen für dieses Experiment dürfen zunächst mindestens 48 Stunden lang asynchron in der logarithmischen Phase wachsen. Zu Beginn besteht das Verfahren zur Aussaat von Trypsin in den Subkonfluenz-Snap-Reporterzellen für die Aussaat von Zellen in acht Vertiefungsmikroskopkammern bei einer konstanten Verteilung über die gesamte Oberfläche der Kammerzentrifuge.

10.000 Zellen und Resus geben in 350 Mikrolitern ein phenolrotfreies normales Wachstumsmedium aus. Übertragen Sie die Zellsuspension in die Mikroskopkammer, um die Zellen auf acht Well-Mikroskopkammern mit einer maximalen Zelldichte in der Mitte der Kammer auszusäen. Beladen Sie zuerst die Kammer mit 300 Mikrolitern phänorotfreiem normalem Wachstumsmedium.

Als nächstes fügen Sie vorsichtig 5.000 Zellen in die Mitte der Mikroskopkammer hinzu, um die Zellen auf 96 zu säen. Spezielle Optikplatten mit einer konstanten Verteilung über die gesamte Oberfläche der Vertiefung zentrifugieren 5.000 Zellen und resuspendieren in 300 Mikrolitern phenolrotfreiem Normalwachstumsmedium, abhängig von der Gesamtzahl der benötigten Zelle, die Wells enthält. Passen Sie die Zellenzahl und das Gesamtvolumen des Suspensionsmediums an.

Übertragen Sie dann die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte, um die Zellen auf 96 zu säen. Well: spezielle Optikplatten mit maximaler Zelldichte in der Mitte des Wells. Geben Sie vorsichtig 1.500 Zellen in 15 Mikroliter phenolrotfreies normales Wachstumsmedium in einem kleinen Tropfen in die Mitte jeder Vertiefung.

Dadurch wird das Zellwachstum auf die Mitte der Vertiefung beschränkt. Lassen Sie alle ausgesäten Zellen mindestens 18 Stunden lang unter Standard-Zellkulturbedingungen wachsen, 30 Minuten vor Beginn des Färbevorgangs. Warmup-Quats aus phenolrotfreiem normalem Wachstumsmedium auf 37 Grad Celsius.

Das Snap-Substrat in dieser Demonstration ist ein TMR-Stern für die einfache Handhabung des in DMSO gelösten TMR-Sterns, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 400 Mikromolar zu erhalten, die 0,5 Mikroliter der TMR-Stern-Stammlösung verdünnt. In 200 Mikrolitern warmem Phenolrot freies normales Wachstumsmedium, um eine endgültige Markierungskonzentration von einem Mikromolar zu erhalten. Entfernen Sie anschließend das normale Wachstumsmedium aus den asynchron wachsenden Zellen und ersetzen Sie es durch Markierungsmedium, inkubieren Sie die Zellen 25 Minuten lang unter Standardkulturbedingungen in Markierungsmedium.

Entfernen Sie nach 25 Minuten das Markierungsmedium und waschen Sie die Zellen viermal mit warmem, phenolrotfreiem normalem Wachstumsmedium. Nach der letzten Wäsche inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in 300 Mikrolitern warmem, phenolrotfreiem normalem Wachstumsmedium, bevor Sie sie zum Mikroskop transportieren. Ersetzen Sie das Medium durch frisches, warmes, phenolrotfreies, normales Wachstumsmedium, um Reste von ungebundenen Substratzellen zu entfernen, die in einer Styroporbox auf einem vorgewärmten 37 Grad Celsius warmen Wärmeblock zum Mikroskop transportiert werden.

Minimierung von Temperaturschwankungen zwei Stunden vor der Messung der Fluoreszenzintensität. Stellen Sie die Lufttemperatur der Klimakammer im Trockenmodus auf 37 Grad Celsius ein, um das Mikroskop und alle seine Komponenten auf die gewünschte Temperatur zu bringen. Um Kondensation und nachträgliche Beschädigung des Mikroskops zu vermeiden, ist es wichtig, vor dem Einstellen der Luftfeuchtigkeit vorzuheizen.

Wenn das gesamte Mikroskopsystem 37 Grad Celsius erreicht hat, stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 60 % und Kohlendioxid auf 5 % einStarten Sie die Scan- oder Aufnahmesoftware und legen Sie die Standardeinstellungen fest. Definieren Sie die Positionen der zu analysierenden Vertiefungen. Definieren Sie das Delta T oder die Erfassungszykluszeit und die absolute Anzahl der Erfassungszyklen.

In dieser Demonstration. Der Hardware-Autofokus ist für die Analyse einer höheren Anzahl von Wells vorausgewählt. Starten Sie die Akquisition und betreuen Sie die ersten beiden Akquisitionszyklen.

Das Mikroskop fokussiert sich auf das Histon H zwei GFP-Signal mit anschließender Aufnahme eines ersten Bildes in diesem Kanal, bevor der Filter gewechselt und das entsprechende TMR-Sternbild aufgenommen wird. Dies sind sie, die für alle Positionen innerhalb einer Vertiefung und für jede der zu untersuchenden Vertiefungen wiederholt werden, bevor der nächste Zyklus wiederholt wird. Wieder. Um proteolytische Profile zu analysieren, starten Sie die Scan-R-Analysesoftware.

Analysieren Sie die Bilder mit den Zellkernen, wie sie durch Histon H zwei GFP visualisiert werden, das als Hauptobjekt definiert ist, indem ein Schwellenwert basierend auf der Signalintensität und ein Watershed-Algorithmus verwendet werden, um die Trennung benachbarter Zellen zu unterstützen. Für die TMR-Sternanalyse sollte ein Unterobjekt bestehend aus einem Zellkern mit Zytoplasma erstellt werden. Wichtige Eigenschaften des Hauptobjekts sind X- und Y-Positionen, Zeit und Maximum sowie mittlere Intensitäten von GFP für das Hauptobjekt und die Gesamtintensität dividiert durch die Fläche.

Wechseln Sie für das TMR-Stern-Unterobjekt in den Trace-Modus, um die mittlere Fluoreszenzintensität des Unterobjekts des TMR-Sterns über die Zeit oder die Zellspuren zu visualisieren, die den analysierten Hauptobjekten zugewiesen sind. Die Betrachtung einer größeren Anzahl von Zellen ermöglicht eine erste repräsentative und objektive Sichtweise, aber die Anzahl der zu untersuchenden Zellen kann eingegrenzt werden, indem man auf diejenigen Messungen abzielt, die mindestens 140 Zyklen dauern und eine große maximale Histon-H-2-GFP-Intensität enthalten. Wählen Sie eine Zellspur von Interesse aus, um Histon-H-, zwei GFP- und TMR-Sternfluoreszenzen gleichzeitig auf Einzelzellebene zu visualisieren.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine gewünschte Zelle und generieren Sie ein exportierbares Bild. Galerie zur Veranschaulichung von Histon H zwei GFP und Cycling B schnappen TMR-Stern für jedes einzelne Mal. Wechseln Sie auf den Populationsmodus der Scanner-Analysesoftware und begrenzen Sie den Bereich, in dem die interessierende Zelle auf dem Dot-Blot dargestellt wird.

Wenden Sie ein neues Punktdiagrammfenster auf den Gated-Bereich an, und visualisieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität von TMR-Sternen im Zeitverlauf. Exportieren Sie Daten für weitere Berechnungen nach Microsoft Excel. Die Abbildungen hier zeigen die Cyclin-B-Kinetik, dargestellt durch eine TMR-Stern-Fluoreszenzintensitätskurve einer Zelle, die nach der Verdichtung des Zytoplasmas nach dem Zusammenbruch der Kernhülle oder NEBD, wie durch das rote Dreieck angezeigt, eine regelmäßige Mitose ohne Anzeichen einer chromosomalen Fehlausrichtung durchläuft. Die Fluoreszenzintensität der TMR-Staphylokokken zeigt einen abrupten Anstieg, bis das isomorphe Fenster erreicht ist.

Wenn die Zelle in die Prometaphase eintritt, bleibt die Fluoreszenzintensität auf einem stabilen Niveau, solange die Zelle die Prophase und die Metaphase durchläuft, und beginnt dann schnell zu abfallen. Sobald alle Chromosomen eine stabile Metaphasenplatte gebildet haben, geht dieser Tropfen der Chromosomentrennung voraus. Während der Anaphase, die durch den blauen Punkt auf der Kurve in der späten Mitose angezeigt wird, beginnt das Chromatin zu dekondensieren und die Zelle geht in die Phasenmorphologie über.

Während sich die Fluoreszenzintensitätskurve dem Plateau nähert, das niedriger ist als das Plateau vor der Mitose Nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mitose, um das enge Gleichgewicht zwischen Kreislauf, Be-Abbau und Synthese zu erforschen, das die mitotische Progression reguliert.