Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

Das übergeordnete Ziel dieses Films ist es, zu demonstrieren, wie man die Netzwerkaktivität aus sich entwickelnden kortikalen Hirnschnitten mithilfe eines kalziumempfindlichen fluoreszierenden Indikators misst. DY-Hirnschnitte werden aus dem sich entwickelnden enteralen Kortex einer jungen Maus hergestellt. Sowohl Neuronen als auch Astrozyten werden mit kalziumabhängigen Markern beladen.

Änderungen in der Fluoreszenz kalziumabhängiger Farbstoffe spiegeln Veränderungen in der zellulären Aktivität wider. Nicht-neuronale Zellen, einschließlich Astrozyten, Mikroglia und endotheliale Zellen, können mittels spezifischer Markierungs-Farbstoffe angefärbt werden. Die kortikale Netzwerkaktivität wird mithilfe von zeitraffenden Mehrphotonen-Aufnahmen erfasst; Zellen innerhalb des Netzwerks werden detektiert, indem ein 3D-Stapel von Bildern durch den interessierenden Bereich erstellt wird.

Änderungen der zellulären Fluoreszenz über mehrere Zellen hinweg können anschließend analysiert werden, um die Aktivität des sich entwickelnden kortikalen Netzwerks abzulesen. Ein charakteristisches Aktivitätsmuster im sich entwickelnden Nervensystem ist die spontane, synchronisierte Netzwerkaktivität. Synchronisierte Aktivität wurde bereits in zahlreichen sich entwickelnden neuronalen Regionen beobachtet, einschließlich intakter Rückenmark- und Kortexpräparate sowie dissoziierter neuronaler Kulturen. Während Phasen spontaner Aktivität depolarisieren die Neuronen, feuern einzelne Aktionspotentiale oder Bursts von Aktionspotentialen und aktivieren dabei zahlreiche Ionenkanäle, darunter spannungsabhängige Kalziumkanäle, was zu einem Kalziumeinstrom führt.

Es wurden hoch synchronisierte Aktivitäten in lokalen Netzwerken mittels Feldelektroden oder Multielektroden-Arrays gemessen. Diese ermöglichen hohe zeitliche Abtastraten, liefern jedoch aufgrund der integrierten Erfassung der Zellaktivität eine geringere räumliche Auflösung. Eine Einzelzell-Auflösung der neuronalen Aktivität ist mittels Patch-Clamp-Elektrophysiologie einzelner Neuronen zur Messung der Feuerraten möglich.

Jedoch ist die Fähigkeit, aus einem Netzwerk heraus zu messen, auf die Anzahl gleichzeitig gepatchter Neuronen begrenzt und beträgt typischerweise nur ein oder zwei Neuronen. Die Verwendung kalziumabhängiger fluoreszierender Indikatorfarbstoffe ermöglichte die Erfassung synchronisierter Aktivität über ein Netzwerk von Zellen hinweg. Diese Technik bietet sowohl eine hohe räumliche Auflösung als auch eine ausreichende zeitliche Abtastung, um die spontane Aktivität des sich entwickelnden Netzwerks aufzuzeichnen.

Fluoreszierende kalziumsensitive Indikatoren wie URA 2:00 AM Ester enthalten Carboxylgruppen, die in der Lage sind, Kalziumionen zu binden. Diese fluoreszierenden Farbstoffe werden durch spezifische Lichtwellenlängen aktiviert, und zwar entweder mittels Einphotonen- oder Zweiphotonenmikroskopie. Die Anzahl der von dem Farbstoff emittierten Photonen ändert sich vorübergehend beim Binden von Kalzium.

Diese Änderung der Photonenzahl oder Fluoreszenz wird als Delta-FF-Signal gemeldet und entspricht einer Änderung des Kalziumspiegels innerhalb des Neurons. Die Messung von Veränderungen kalziumsensitiver Indikatoren ist eine nützliche Messgröße für Aktivitätsmuster von Netzwerken in sich entwickelnden Zellen. Hallo, ich bin Rianna Morty, und mein Name ist Julie Abbots.

Wir stammen aus der Abteilung für Interpretative Neurophysiologie und der Universität in Amsterdam. Wir verwenden die Kalzium-Bildgebung, um die funktionelle Aktivität in sich entwickelndem Gewebe der Maus-Hirnrinde mithilfe kalziumsensitiver Indikatoren bei der multifokalen Bildgebung zu untersuchen. Ziel dieses kurzen Films ist es zu zeigen, wie diese Methoden genutzt werden können, um sowohl spontane als auch evozierte Aktivitätsmuster in sich entwickelnden Netzwerken des Nervensystems zu messen.

Entfernen Sie das Gehirn schnell aus dem Schädel einer jungen Maus, um Schäden an der neuronalen Verschaltung zu minimieren. Präparieren Sie das Gehirn in eiskalter Schnittlösung. Die Schnittlösung enthält Cholinchlorid anstelle des in A TSF üblicherweise verwendeten Natriums für neuronale Ableitungen.

In diesen Experimenten stellen wir Gehirnschnitte aus dem enteralen Kortex des sich entwickelnden Mausgehirns her. Legen Sie ein Stück Filterpapier auf eine Petrischale und befeuchten Sie es mit wenigen Millilitern A TSF. Überführen Sie das Gehirn auf das Stück Filterpapier.

Zerteilen Sie die Hemisphären mit einem Einweg-Rasiermesser. Trennen Sie die beiden Hemisphären voneinander. Legen Sie eine zurück in die eisgekühlte Schnittlösung zusammen mit der verbleibenden Hemisphäre.

Entfernen Sie das Kleinhirn mit dem Rasiermesser. Drehen Sie eine Hirnhemisphäre auf ihre Mittellinie und schneiden Sie etwa einen Millimeter von der dorsalen Oberfläche aus mit einem leichten Winkel der Klinge in Richtung des rostralen Endes. Drehen Sie das Gehirn um auf.

Die kürzlich geschnittene Oberfläche mit einem Wattebausch und einem Metallspatel. Überführen Sie das Gehirn auf den metallenen Schneideblock. Schieben Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Wattebausch vom Spatel auf die verklebte Oberfläche.

300 µm dicke Schnitte des Gehirns werden geschnitten; die Schneidegeschwindigkeit und Klingentyp für junges Gewebe sind in der Regel langsamer als die für reiferes Gewebe. Nach dem Schneiden werden die Schnitte mithilfe einer Glaspipette in eine Haltekammer überführt, die oxygeniertes A TSF bei Raumtemperatur enthält. Die A CSF enthält ein höheres Verhältnis von Magnesium zu Calcium als die A CSF-Lösung.

Für die Aufnahme verwendete Schnitte werden eine Stunde lang zur Erholung belassen. Um die Zellen mit einem kalziumabhängigen Indikator oder einem zelltypspezifischen Marker zu beladen, müssen die Schnitte in eine Kammer für das Anfärbeverfahren überführt werden. Obwohl kommerzielle Kammern erhältlich sind, kann man eine solche einfach und kostengünstig aus gängigem Laborzubehör selbst zusammenstellen.

Um eine Färbe-Kammer herzustellen, benötigen Sie die folgenden grundlegenden Laborgeräte: zwei Kunststoff-Petri-Schalen, eine 10-Milliliter-Spritze, ein Stück Silikon-Schlauch, einen Zellkultur-Einsatz mit einer semipermeablen Membran, Sekundenkleber, drei kleine Schlauchverbinder und eine feine Kanüle. Nehmen Sie die große Petri-Schale und bohren Sie mit einem erhitzten Stab ein kleines Loch durch die Seitenwand. Nehmen Sie die kleine Petri-Schale und bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser, der groß genug ist, damit der Silikon-Schlauch hindurchpasst.

Führen Sie ein Stück Silikonschlauch durch das Loch und bilden Sie eine Schleife innerhalb der kleinen Schale. Versiegeln Sie das offene Ende des Schlauchs mit Sekundenkleber. Befestigen Sie anschließend den restlichen Schlauch an der Innenwand der kleinen Petrischale.

Platzieren Sie die kleine Petrischale in die Mitte der großen Schale und kleben Sie sie an Ort und Stelle. Nehmen Sie das verbleibende Ende des Silikonschlauchs und führen Sie es durch das kleine Loch in der Seitenwand der Petrischale. Nehmen Sie eine feine Nadel und stechen Sie kleine Löcher in den Silikonschlauch innerhalb der Petrischale.

Erstellen Sie die Löcher in gleichmäßigen Abständen, um eine gleichmäßige Gaserfusion zu gewährleisten. Nehmen Sie eine Zellkulturmulde mit einer semipermeablen Membran und schneiden Sie mit einem erhitzten Skalpell die oberen einen Zentimeter der Mulde ab, sodass eine flache Schale entsteht, in der die Schnitte während der Inkubation gehalten werden können.

Stellen Sie die flache Schale in die Mitte der kleinen Schale, die von der porösen Silikonschlauchleitung umgeben ist. Bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von etwa einem halben bis einem Zentimeter in den Deckel der großen Schale. Nehmen Sie eine 10-Milliliter-Kunststoffspritze unter Verwendung eines erhitzten Skalpells.

Führen Sie einen schrägen Schnitt durch, um das Ende der Spritze zu entfernen. Tragen Sie Sekundenkleber auf die Schnittfläche des Spritzenrohrs auf. Befestigen Sie dieses direkt über der Öffnung im Deckel der großen Petrischale.

Befestigen Sie einen Schlauchanschluss an der Spitze der Spritze. Stellen Sie die flache Schale in die Mitte der kleinen Petrischale, wobei der poröse Gasschlauch ringsum um die Schale verlegt wird. Dieser Schlauch wird anschließend mit einer Carbogen-Gasversorgung verbunden, um die Schnitte mit Sauerstoff zu versorgen.

Während der Inkubation ersetzen Sie den Deckel der großen Schale, der ebenfalls über die Spritzenkanüle direkt mit der Gasversorgung verbunden ist. Dadurch wird während der Inkubation ein Strom aus Kohlendioxid und Gas über die Schnitte geleitet, um eine Ausbleichung des Farbstoffs zu vermeiden. Alle Schritte werden mit möglichst wenig Licht durchgeführt, und sowohl der Farbstoff als auch die Schnitte werden im Dunkeln aufbewahrt.

Füllen Sie die Färbe-Kammer mit etwa eineinhalb Millilitern A TSF aus dem Schnitt-Halter. Stellen Sie die Interface-Kammer hinein und füllen Sie sie mit einem weiteren Milliliter A TSF auf. Es ist wichtig, eine gute Sauerstoffversorgung aufrechtzuerhalten, um das Gewebe gesund zu halten und eine gute Beladung des Schnitts zu gewährleisten.

Die Färbung erfolgt bei etwa 35 Grad C, um die Aufnahme des Farbstoffs in die Neuronen zu erleichtern, während sich die Färbekammer erwärmt. Bereiten Sie den Indikatorfarbstoff für Fira 2:00 AM Ester vor. Geben Sie neun Mikroliter DMSO mit einem Mikroliter Onigsäure zu einem 50-Mikrogramm-Fläschchen.

DMSO und Onigsäure. Wirken als Permeationsmittel, um die Aufnahme des Farbstoffs durch die Lipidmembran zu ermöglichen. Vortexen Sie das Gefäß 15 Minuten lang, um sicherzustellen, dass der Farbstoff vollständig gelöst ist.

Zum Färben jede Scheibe in die Schnittstelle überführen. In die Färbevorrichtung einsetzen. Die Färbungslösung direkt auf den interessierenden Bereich oberhalb der Schnitte auftragen und den Deckel der Färbevorrichtung schließen.

Lassen Sie die Schnitte je nach Alter der verwendeten Maus 20 bis 40 Minuten im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation überführen Sie die Schnitte zurück in den Schnithalter, um überschüssige Farbstoffe abzuwaschen. Die Färbeprotokolle für die Kalzium-Bildgebung können ebenfalls für älteres Gewebe angepasst werden.

Dies erfordert einen zusätzlichen Vorinkubationsschritt. Überführen Sie die alten Schnitte in eine flache Vorinkubationsschale, die mit drei Milliliter einer CSF und acht Mikroliter einer 0,5 %igen Crema-Vier-Lösung gefüllt ist, und erhitzen Sie drei Minuten lang auf 35 Grad C. Anschließend überführen Sie die Schnitte in die Interface-Kammer, bringen Sie in die Färbevorrichtung ein und führen Sie die üblichen Färbeprotokolle durch.

Es ist auch möglich, diese Schnitte für nicht-neuronale Zellen, nämlich Astrozyten, Mikroglia und endotheliale Zellen, anzufärben. Sulfur-Rhodamin 101 kann verwendet werden, um Astrozyten für Sulfur-Domäne anzufärben. Bereiten Sie eine Lösung von 10 µM vor und pipettieren Sie den violetten Farbstoff über den interessierenden Bereich in den Schnitten.

Ansatz für einen Zeitraum von 15 Minuten inkubieren lassen. Die Schnitte zurück in die Haltekammer überführen, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen. Das FSE-Konjugat von Tomaten-Lektin kann Mikroglia und endotheliale Zellen anfärben.

Für Tomaten-Lektin eine Lösung mit 20 Mikrogramm pro Milliliter herstellen. Den Farbstoff auf dem Bereich der Interesse auf den Schnitten auftragen. Die Schnitte für einen Zeitraum von 45 Minuten inkubieren lassen.

Überführen Sie die Schnitte anschließend erneut in die Haltekammer. Während der Bildgebung müssen die Schnitte unter dem Mikroskop stabil liegen. Üblicherweise wird ein metallenes Harp zur Fixierung des Gewebes verwendet, jedoch kann dieses die Oberfläche des Schnitts ungleichmäßig verzerren, wodurch nur ein begrenztes Sichtfeld scharf abgebildet werden kann, was zu vermeiden ist.

Diese Schnitte werden mit einer POLYETHALEN- oder PEI-Lösung in der Aufzeichnungskammer befestigt. PEI ist ein Polymer, das verwendet wird, um die Anheftung von Zellen an einer Oberfläche für mindestens eine Stunde zu verbessern. Bevor die Schnitte in die Aufzeichnungskammern gegeben werden, füllen Sie diese mit wenigen Millilitern PEI-Lösung, sodass der Boden der Kammer bedeckt ist.

Zunächst spülen Sie PEI mit destilliertem Wasser aus der Kammer, gefolgt von einer CSF-Lösung trans. Übertragen Sie eine Schnittpräparation in die Ablegekammer und entfernen Sie überschüssige A-CSF-Lösung. Positionieren Sie die Schnittpräparation mit einem feinen Pinsel in der Mitte der Kammer.

Entfernen Sie die gesamte verbleibende A CSF unter Verwendung kleiner Stücke saugfähigen Filterpapiers. Achten Sie darauf, dass sich am Rand der Schnittprobe keine A CSF mehr befindet. Geben Sie abschließend vorsichtig ein halbes Milliliter A CSF auf die Schnittprobe, ohne diese aus der Kammer zu lösen.

Stellen Sie die Kammern in einen großen, mit Sauerstoff versorgten Interface-Behälter und lassen Sie sie weitere eine Stunde im Dunkeln stehen. Änderungen in kalziumsensitiven Indikatorfarbstoffen können entweder mit Einphotonen- oder Zweiphotonen-Mikroskopie aufgezeichnet werden. Wir verwenden einen mit einem Olympus-Mikroskop gekoppelten Titan-Saphir-Laser, um die Zweiphotonen-Bildgebung in unseren neuronalen Netzwerken zu ermöglichen.

Außerdem verwenden wir ein L Vision Biotech Trim-Scope-System mit einer EM-CCD-Hammer-MATSU-Kamera, um höhere Bildwiederholraten zu erzielen. Positionieren Sie die Schnittkammer unter dem Mikroskop mit einem stabilen Durchfluss von oxygeniertem A-T-S-F-A-T-S-F, das 1,6 Millimolar Calcium und 1,5 Millimolar Magnesium enthält. Im Aufbau wird die Lösung mit Weißlicht auf etwa 30 Grad C erwärmt.

Suchen Sie den interessierenden Bereich in der Scheibe und fokussieren Sie auf die Oberfläche. Schalten Sie das Licht aus und schließen Sie die Tür des Aufnahmeschrankes. Um die Hintergrundbeleuchtung zu reduzieren.

Es sind viele verschiedene kommerzielle oder Open-Source-Softwarepakete erhältlich, um Bilder aufzuzeichnen und zu analysieren. In unserem Labor verwenden wir die Inspector-Software zur Aufnahme von Lavis Biotech. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, wählen Sie den CCD-Kamera-Modus für die Detektion. Stellen Sie die für Ihren Indikator relevante Wellenlänge ein.

Für FIRA 2:00 AM Ester stellen wir die Anregung in der Trim-Scope-Software auf 820 Nanometer ein. Wählen Sie den 64-B-Scanmodus. Wählen Sie die optimale Bildfeldgröße und Pixelauflösung für Ihren interessierenden Bereich.

Wählen Sie gegebenenfalls eine geeignete Bildrate und Pixelrotation für Ihre Bildaufnahme. Öffnen Sie den Laserverschluss, um die kontinuierliche Bildaufnahme vorzubereiten. Verwenden Sie den Modus für kontinuierliche Bildaufnahme.

Stellen Sie den Verstärkungsfaktor und die Laserintensität ein und fokussieren Sie auf das neuronale Netzwerk, das Sie abbilden möchten. Stoppen Sie das Scannen. Wählen Sie die Einstellungen für die Zeitraffer-Aufnahme bezüglich Bildwiederholrate und Aufnahmedauer.

Nach der Zeitrafferaufnahme erstellen Sie einen Z-Stack aus Bildern, der in Schritten von einem Mikrometer 20 Mikrometer oberhalb und 20 Mikrometer unterhalb markiert. Dieser Z-Stack wird während der Analyse zur Zellendetektion verwendet. Exportieren Sie die aufgezeichneten Dateien als Stapel von TIFF-Bildern.

Zusammenfassend haben wir den Einsatz von Calciumindikatoren zur Messung synchroner, spontaner Netzwerkaktivität im sich entwickelnden Kortex gezeigt. Weitere Einzelheiten zur Methodik und zu den Reagenzien finden Sie in den beiliegenden Datentabellen, die Ihnen helfen, die Technik in Ihrem eigenen Labor einzurichten.