Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

Das übergeordnete Ziel dieses Films ist es, zu demonstrieren, wie die Netzwerkaktivität von sich entwickelnden kortikalen Hirnschnitten mit Hilfe eines kalziumempfindlichen Fluoreszenzindikators gemessen werden kann. DY-Hirnschnitte werden aus der sich entwickelnden enteralen Rinde einer jungen Maus hergestellt. Sowohl Neuronen als auch Astrozyten sind mit kalziumabhängigen Markern beladen.

Veränderungen in der Fluoreszenz von kalziumabhängigen Farbstoffen spiegeln Veränderungen der zellulären Aktivität wider. Nicht-neuronale Zellen, einschließlich Astrozyten, Mikroglia und Endothelzellen, können mit spezifischen Markerfarbstoffen gefärbt werden. Die Aktivität des kortikalen Netzwerks wird im Zeitraffer aufgezeichnet. Multiphotonen-Bildgebungszellen werden innerhalb des Netzwerks detektiert, indem ein 3D-Bildstapel durch den interessierenden Bereich erstellt wird.

Veränderungen der zellulären Fluoreszenz über mehrere Zellen hinweg können dann analysiert werden, um die Aktivität des sich entwickelnden kortikalen Netzwerks auszulesen. Ein charakteristisches Aktivitätsmuster im sich entwickelnden Nervensystem ist die spontane synchronisierte Netzwerkaktivität. Synchronisierte Aktivität wurde in vielen verschiedenen sich entwickelnden neuronalen Regionen beobachtet, einschließlich intakter Rückenmarksrinde und dissoziierter neuronaler Kulturpräparate während Perioden spontaner Aktivität, Neuronen, die zu Feuer depolarisiert waren, einzelne Spikes oder Ausbrüche von Aktionspotentialen, die viele Eisenkanäle aktivierten, einschließlich spannungsgesteuerter Kalziumkanäle, die zu Kalziumeinstrom führten.

Hochsynchronisierte Aktivität wurde aus lokalen Netzwerken mit Feldelektroden oder Mehrelektrodenarrays gemessen. Diese ermöglichen hohe zeitliche Abtastraten, ergeben aber aufgrund der integrierten Auslesung der Zellaktivität eine geringere räumliche Auflösung. Die Auflösung der neuronalen Aktivität in einzelnen Zellen ist mit Hilfe der Patch-Clamp-Elektrophysiologie einzelner Neuronen möglich, um die Feuerraten zu messen.

Die Fähigkeit, von einem Netzwerk aus zu messen, ist jedoch auf die Anzahl der gleichzeitig gepatchten Neuronen beschränkt und beträgt in der Regel nur ein oder zwei Neuronen. Die Verwendung von kalziumabhängigen Fluoreszenz-Indikatorfarbstoffen hat die Messung der synchronisierten Aktivität in einem Netzwerk von Zellen ermöglicht. Diese Technik bietet sowohl eine hohe räumliche Auflösung als auch eine ausreichende zeitliche Abtastung, um die spontane Aktivität des sich entwickelnden Netzwerks aufzuzeichnen.

Fluoreszierende Calcium-empfindliche Indikatoren wie URA 2:00 AM Ester enthalten Carbonsäuregruppen, die in der Lage sind, Calciumminen zu binden. Diese Fluoreszenzfarbstoffe werden durch bestimmte Lichtwellenlängen aktiviert, entweder mit Hilfe der Ein-Photonen- oder der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die Anzahl der vom Farbstoff emittierten Photonen wird bei der Bindung von Kalzium vorübergehend verändert.

Diese Änderung der Photonenzahl oder Fluoreszenz wird als Delta-FF-Signal berichtet und entspricht einer Änderung des Kalziumspiegels innerhalb des Neurons. Die Messung von Veränderungen in kalziumempfindlichen Indikatoren ist ein nützliches Maß für die Netzwerkaktivitätsmuster in sich entwickelnden Zellen. Hallo, ich bin Rianna Morty und mein Name ist Julie Abbots.

Wir kommen von der Abteilung für interpretative Neurophysiologie und der Universität in Amsterdam. Wir haben die Kalzium-Bildgebung verwendet, um die funktionelle Aktivität bei der Entwicklung von Gewebe in der Mausrinde unter Verwendung von Kalzium-sensitiven Indikatoren in der multifokalen Bildgebung zu untersuchen. Das Ziel dieses kurzen Films ist es, zu zeigen, wie diese Methoden verwendet werden können, um sowohl spontane als auch evoke Aktivitätsmuster bei der Entwicklung von Netzwerken im Nervensystem zu messen.

Entfernen Sie das Gehirn schnell aus dem Schädel einer jungen Maus, um Schäden an den neuronalen Schaltkreisen zu reduzieren. Präparieren Sie das Gehirn in eiskalter Schnittlösung. Die Schnittlösung enthält Colinchlorid anstelle des Natriums, das üblicherweise in A TSF für neuronale Aufzeichnungen verwendet wird.

In diesen Experimenten machen wir Hirnschnitte aus der enteralen Rinde des sich entwickelnden Mäusegehirns. Lege ein Stück Filterpapier auf eine Petroschale und befeuchte es mit ein paar Millilitern A TSF. Übertragen Sie das Gehirn auf das Stück Filterpapier.

die Halbkugeln mit einer einschneidigen Rasierklinge. Trennen Sie die beiden Hemisphären. Legen Sie eine Scheibe mit der restlichen Halbkugel zurück in die eisige Scheibenlösung.

Entferne das Kleinhirn mit der Rasierklinge. Drehen Sie eine Hemisphäre auf ihre Mittellinie und machen Sie einen Schnitt von etwa einem Millimeter von der dorsalen Oberfläche mit einem leichten Winkel der Klinge zum rostralen Ende. Schalte das Gehirn ein.

Die kürzlich geschnittene Oberfläche mit einem Baumwollvogel und einem Metallspatel. Übertragen Sie das Gehirn auf den Metallschneidblock. Schieben Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Wattevogel vom Spachtel auf die geklebte Oberfläche.

300-Mikrometer-Scheiben des Gehirns werden für junges Gewebe geschnitten, und die Klingenfrequenz ist in der Regel langsamer als bei reiferem Gewebe. Nach dem Schneiden wird jede Scheibe mit einer Glaspipette übertragen. Die Scheiben werden in die Haltekammer überführt, die sauerstoffreiches A TSF bei Raumtemperatur enthält. Der A-Liquor enthält ein höheres Verhältnis von Magnesium zu Kalzium als die A-Liquor-Lösung.

Wird zum Aufzeichnen verwendet: Slices werden eine Stunde lang zur Wiederherstellung belassen. Um die Zellen mit einem kalziumabhängigen Indikator oder zellspezifischen Markerschnitt zu bestücken, müssen Scheiben für das Färbeverfahren in eine Kammer überführt werden. Obwohl kommerzielle Kammern verfügbar sind, kann eine Kammer problemlos und zu sehr geringen Kosten aus Standard-Laborgeräten zusammengebaut werden.

Um eine Färbekammer herzustellen, benötigen Sie die folgende grundlegende Laborausrüstung: zwei Petrischalen aus Kunststoff, eine 10-Milliliter-Spritze, ein Stück Quarzglasschlauch, einen Zellkultureinsatz mit einem semipermeablen Membran-Sekundenkleber, drei kleine Schlauchverbinder und eine feintragende Nadel. Nehmen Sie die große Petrischale und bohren Sie mit einem beheizten Stab ein kleines Loch durch die Seitenwand. Nehmen Sie die kleine Petrischale und bohren Sie ein Loch mit ähnlichem Durchmesser, das groß genug ist, damit der Silikonschlauch hindurchpasst.

Führen Sie ein Stück Silikonschlauch durch das Loch und formen Sie eine Schlaufe in der kleinen Schale. Verwende Sekundenkleber, um das offene Ende des Schlauchs abzudichten. Kleben Sie dann den Rest des Schlauchs an die Innenwand der kleinen Petrischale.

Lege die kleine Petrischale in die Mitte der großen und klebe sie fest. Nehmen Sie das restliche Ende des Silikonschlauchs und führen Sie es durch das kleine Loch in der Seitenwand der Petrischale. Nehmen Sie eine feine Nadel und bohren Sie kleine Löcher in den Silikonschlauch in der Petrischale.

Machen Sie die Löcher in gleichmäßigen Abständen, um eine gleichmäßige Gasper-Fusion zu erzielen. Entnehmen Sie eine Zellkulturvertiefung mit einer semipermeablen Membran mit einem erhitzten Skalpell. Schneiden Sie den oberen Zentimeter der Vertiefung ab, um eine flache Schale zu erhalten, in der die Scheiben während der Inkubation aufbewahrt werden.

Stellen Sie die flache Schale in die Mitte der kleinen Schale, umgeben von den porösen Silikonschläuchen. Mache ein Loch mit einem Durchmesser von etwa einem halben bis einem Zentimeter in den Deckel der großen Schale. Nehmen Sie eine 10-Milliliter-Plastikspritze mit einem erhitzten Skalpell.

Machen Sie einen schrägen Schnitt, um das Ende der Spritze zu entfernen. Tragen Sie Sekundenkleber auf die Schnittfläche des Spritzenrohrs auf. Kleben Sie diesen direkt über das Loch am großen Petrischalendeckel.

Befestigen Sie einen Schlauchanschluss am Ende der Spritzenspitze. Stellen Sie die flache Schale in die Mitte der kleinen Petrischale und achten Sie darauf, dass der poröse Gasschlauch um die Schale herum liegt. Dieses Rohr wird dann an eine Carbogen-Gasversorgung angeschlossen, um die Scheiben mit Sauerstoff zu versorgen.

Setzen Sie während der Inkubation den Deckel der großen Schale wieder auf, die ebenfalls über die Spritzenspitze direkt mit der Gaszufuhr verbunden ist. Dadurch wird während der Inkubation ein Vorrat an Auto und Gas über die Scheiben gebracht, um ein Ausbleichen des Farbstoffs zu vermeiden. Alle Verfahren werden bei so wenig Licht wie möglich durchgeführt, und sowohl die Farbe als auch die Scheiben werden im Dunkeln aufbewahrt.

Füllen Sie die Färbekammer mit etwa eineinhalb Millilitern A TSF aus dem Scheibenhalter. Setzen Sie die Grenzflächenkammer ein und füllen Sie sie mit einem weiteren Milliliter A TSF. Es ist wichtig, eine gute Sauerstoffversorgung aufrechtzuerhalten, um das Gewebe gesund zu halten und die Scheibe gut zu belasten.

Die Färbung erfolgt bei etwa 35 Grad C, um die Aufnahme des Farbstoffs in die Neuronen zu erleichtern, während sich die Färbekammer erwärmt. Bereiten Sie den Indikatorfarbstoff für fira 2:00 AM Ester vor. Geben Sie neun Mikroliter DMSO mit einem Mikroliter Onsäure in eine 50-Mikrogramm-Durchstechflasche.

DMSO und Onsäure. Wirken als Perme-Mittel, damit der Farbstoff durch die Lipidmembran aufgenommen werden kann. Wirbeln Sie das Fläschchen 15 Minuten lang ein, um sicherzustellen, dass sich der Farbstoff vollständig aufgelöst hat.

Übertragen Sie zum Färben jede Scheibe in die Schnittstelle. In die Färbekammer einsetzen. Streicheln Sie den Farbstoff direkt auf den interessierenden Bereich über den Scheiben und schließen Sie den Deckel der Färbekammer.

Lassen Sie die Scheiben je nach Alter der verwendeten Maus 20 bis 40 Minuten im Dunkeln inkubieren. Übertragen Sie die Scheiben nach der Inkubation zurück in den Scheibenhalter, um überschüssige Farbe abzuwaschen. Die Färbeprotokolle für die Calcium-Bildgebung können auch für älteres Gewebe angepasst werden.

Dies erfordert einen zusätzlichen Schritt der Vorinkubation. Übertragen Sie die alten Scheiben in eine flache Vorinkubationsschale, die mit drei Millilitern Liquor und acht Mikrolitern Crema-Vier-Lösung bei 0,5 % gefüllt ist. Erhitzen Sie sie drei Minuten lang auf 35 Grad C. Übertragen Sie dann die Scheiben in die Schnittstelle, setzen Sie sie in die Färbekammer ein und befolgen Sie die normalen Färbeverfahren.

Es ist auch möglich, diese Schnitte für nicht-neuronale Zellen zu färben, nämlich Astrozyten, Mikroglia und Endothelzellen. Schwefel-Pansen 1 0 1 kann verwendet werden, um Astrozyten auf Schwefeldominanz zu färben. Machen Sie eine Lösung aus 10 mikromolaren Pipetten, dem violetten Farbstoff, über den interessierenden Bereich in den Scheiben

15 Minuten inkubieren lassen. Übertragen Sie die Scheiben zurück in die Haltekammer, um überschüssige Farbe zu entfernen. Das FSE-Konjugat von Tomatenlektin kann Mikroglia- und Endothelzellen färben.

Für Tomatenlektin stellen Sie eine Lösung von 20 Mikrogramm pro Milliliter her. Streicheln Sie den Farbstoff über den interessierenden Bereich in den Scheiben. Lassen Sie die Scheiben 45 Minuten lang inkubieren.

Übertragen Sie die Scheiben dann wieder zurück in die Haltekammer. Während der Bildgebung müssen die Schichten unter dem Mikroskop stabil sein. Normalerweise wird eine Metallharfe platziert, um das Gewebe festzuhalten, aber sie kann die Oberfläche der Scheibe ungleichmäßig verformen, so dass nur ein begrenztes Sichtfeld im Fokus vorhanden ist, das die Bildgebung vermeiden kann.

Diese Scheiben werden mit POLYETHALIN oder PEI-Lösung auf die Aufnahmekammer geklebt. PEI ist ein Polymer, das verwendet wird, um die Anhaftung von Zellen an eine Oberfläche mindestens eine Stunde lang zu verbessern. Bevor Sie die Scheiben in die Aufnahmekammern legen, füllen Sie diese Kammern mit einigen Millilitern PEI-Lösung, um den Boden der Kammer zu bedecken.

Spülen Sie zuerst PEI mit destilliertem Wasser aus der Kammer ab, gefolgt von einer Liquorlösung. Übertragen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer und entfernen Sie überschüssige A-Liquorlösung. Positionieren Sie die Scheibe mit einem feinen Pinsel in der Mitte der Kammer.

Entfernen Sie alle weiteren A CSF mit kleinen Stücken saugfähigem Filterpapier. Achten Sie darauf, dass die Scheibe an den Rändern kein A-Liquor mehr aufweist. Zum Schluss einen halben Milliliter A CSF vorsichtig auf die Scheibe geben, ohne sie aus der Kammer zu lösen.

Legen Sie die Kammern in einen großen Behälter mit sauerstoffreicher Grenzfläche und lassen Sie sie eine weitere Stunde im Dunkeln stehen. Veränderungen der calciumsensitiven Indikatorfarbstoffe können entweder mit einer Ein- oder Zwei-Photonen-Mikroskopie erfasst werden. Wir verwenden einen Titan-Saphir-Laser, der mit einem Olympus-Mikroskop gekoppelt ist, um die Zwei-Photonen-Bildgebung in unseren neuronalen Netzwerken zu ermöglichen.

Darüber hinaus verwenden wir ein L Vision Biotech-Trimmrohrsystem mit einer EM CCD-Hammer MATSU-Kamera für höhere Bildabtastraten. Positionieren Sie die Schnittkammer unter dem Mikroskop mit einem stabilen Fluss von sauerstoffhaltigem A-T-S-F-A-T-S-F, das 1,6 Millimolar Calcium und 1,5 Millimolar enthält. Magnesium wird in der Anlage mit weißem Licht auf ca. 30 Grad Celsius erhitzt.

Lokalisieren Sie den interessierenden Bereich im Ausschnitt, und fokussieren Sie sich auf die Oberfläche. Schalten Sie das Licht aus und schließen Sie die Tür des Aufnahmeschranks. Um die Hintergrundbeleuchtung zu reduzieren.

Viele verschiedene kommerzielle oder offene Softwarepakete stehen zur Verfügung, um Bilder aufzuzeichnen und zu analysieren. In unserem Labor verwenden wir für die Erfassung eine Inspektorsoftware von Lavis Biotech. Um mit der Bildgebung zu beginnen, wählen Sie den CCD-Kameramodus für die Erkennung. Stellen Sie die für Ihren Indikator relevante Wellenlänge ein.

Für fira 2:00 AM Ester haben wir die Anregung in der Trimmrohr-Software auf 820 Nanometer eingestellt. Wählen Sie den Scanmodus 64 B. Wählen Sie die optimale Größe, das optimale Sichtfeld und die optimale Pixelauflösung für Ihren Interessenbereich.

Wählen Sie eine geeignete Bildrate und Pixeldrehung aus, falls dies für die Bildabtastung erforderlich ist. Öffnen Sie den Laserverschluss für die kontinuierliche Bildgebung. Verwenden des kontinuierlichen Bildgebungsmodus.

Passen Sie die Verstärkung und die Laserintensität an und fokussieren Sie sich auf das neuronale Netzwerk, das Sie abbilden möchten. Stoppen Sie den Scanvorgang. Wählen Sie die Zeitraffereinstellungen für die Bildrate und die Sequenzdauer aus.

Erstellen Sie nach der Zeitrafferaufnahme einen Z-Stapel von Bildern, der 20 Mikrometer oben und 20 Mikrometer unten in Ein-Mikron-Schritten markiert. Dieser Z-Stapel wird für die Zelldetektion während der Analyse verwendet. Exportieren Sie die aufgezeichneten Dateien als Stapel von TIFF-Bildern.

Zusammenfassend haben wir die Verwendung von Kalziumindikatoren zur Messung der synchronen spontanen Netzwerkaktivität im sich entwickelnden Kortex gezeigt. Weitere Details zur Methodik und den Reagenzien finden Sie in den Datenblättern, die diesem Film beiliegen, damit Sie die Technik in Ihrem eigenen Labor einrichten können.