Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, extrazelluläre Flüssigkeit zu isolieren, um Fragen der Pseudoflüssigkeit, des Aufbaus und der Funktion zu beantworten, wie z. B. Fragen zur RNA-Augensignalisierung. Dies wird erreicht, indem zuerst Würmer, Bakterien, die DS-RNA exprimieren, gefüttert werden, was zu einem leicht zu bewertenden RNAi-Phänotyp führt. Als nächstes wird den Würmern erlaubt, RNAi-Silencing-Signale im ganzen Körper zu verbreiten.

Dann wird das Gesamtvolumen der verfügbaren extrazellulären Flüssigkeit erhöht. Schließlich wird eine Mikroinjektionsnadel verwendet, um die extrazelluläre Flüssigkeit zu entfernen, und in einen RNAi-naiven Wurm injiziert. Letztendlich kann das Vorhandensein von RNAi-Silencing-Signalen durch die Bewertung der Nachkommen von injizierten Würmern nachgewiesen werden.

Mit dieser Methode können wir die Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit analysieren, um nicht nur Einblicke in die systemische RNAi, sondern auch in eine Vielzahl interzellulärer Signalwege zu erhalten. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Technik sind, aufgrund der Geschwindigkeit, mit der man arbeiten muss, Schwierigkeiten haben. Zur Präparation von Spenderwürmern mit klarem E 1745 Streifenbakterium, das DS-RNA für einzelne Kolonien auf LB plus CARIL-Platten exprimiert, werden für diese Demonstration PAL one DS RNA-produzierende Bakterien verwendet.

Inkubieren Sie die Platten am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus, um eine drei Milliliter Übernachtkultur in lb zu impfen, ergänzt mit einer Kohlenstoff-Penicillin-Pipette, 15 Mikroliter Übernachtkultur auf 35-Millimeter-NGM-Platten. Ergänzt mit 25 Mikrogramm pro Milliliter Kohlensäure und einem Millimolar IPTG.

Achte darauf, dass die Bakterien nicht in der Mitte der Platte liegen. Lassen Sie die Kultur trocknen. Pipettieren Sie anschließend 10 Mikroliter frisch hergestellte Bleichlösung auf die Sitzplatte.

Achten Sie darauf, das Bleichtröpfchen von der Bakterienstelle entfernt zu platzieren, um eine kleine, saubere, synchronisierte Population von klarem Material zu erhalten. Ein E 1745 Tier für die umgekehrte Mikroinjektion. Wählen Sie zwei bis 10 erwachsene Tiere aus und legen Sie sie in den Bleichtropfen.

Die erwachsenen Embryonen lösen sich auf und hinterlassen saubere, teilweise entwicklungsbedingte Embryonen. Diese Embryonen schlüpfen dann und die Larven kriechen zum Futter. Inkubieren Sie die Embryonen vier Tage lang bei 20 Grad Celsius.

Schieben Sie dann die Platten vier Stunden lang auf 25 Grad Celsius, um eine Schwellung zu induzieren. Pflücken Sie Würmer und geben Sie sie auf eine unbesetzte NGM-Platte und lassen Sie ihnen Zeit, um Bakterien von der Nagelhaut zu entfernen. Schieben Sie dann L vier junge erwachsene Empfängerwürmer auf eine unbesetzte NGM-Platte und lassen Sie Zeit, um Bakterien von der Kutikula zu entfernen.

Nach der Vorbereitung einer Flüssigkultur von OP 50 N lb über Nacht pipettieren Sie 15 Mikroliter auf 35-Millimeter-NGM-Platten. Achte darauf, dass die Bakterien nicht in der Mitte der Platte liegen. Lassen Sie sie trocknen und pipettieren Sie 10 Mikroliter frisch zubereitete Bleichlösung auf der ausgesäten Platte, weg von der Bakterienstelle.

Nehmen Sie zwei bis 10 GR N zwei Erwachsene und geben Sie sie in das Bleichtröpfchen, inkubieren Sie es drei Tage lang bei 20 Grad Celsius. Bringen Sie die Würmer auf eine saubere, nicht sitzende NGM-Platte und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Schalten Sie das inverse Mikroskop, das Dissektionsmikroskop und den Pico-Injektor ein.

Drehen Sie den Wahlknopf des Pico-Injektors auf p und prüfen Sie, ob die Strommessung in PSI erfolgt. Dieser eindeutige Druckwert ist der Eingangsdruck und sollte ungefähr null PSI betragen. Überprüfen Sie das Primärventil am Stickstofftankregler, um sicherzustellen, dass der Ausgang geschlossen ist.

Öffnen Sie das Hauptventil des Stickstofftanks, die Regleranzeige, die dem Stickstofftank am nächsten liegt. Sollte nun der Innendruck des Tanks abgelesen werden. Erhöhen Sie langsam den Ausgangsdruck, indem Sie das primäre Regelventil im Uhrzeigersinn drehen, während Sie den steigenden Druck auf den Pico-Injektor überwachen.

Erhöhen Sie den Druck langsam auf 100 PSI, wenn 100 PSI erreicht sind. Schalten Sie den Wahlschalter auf p inject und stellen Sie den Einspritzdruck auf 30 PSI ein. Schalten Sie mit dem Injektionsknopf p den Wahlknopf auf P balance um.

Geben Sie einen 15-Mikroliter-Tropfen Mineralöl auf saubere Spender- und Empfängerplatten. Decken Sie ein 2%iges Agros-Injektionskissen mit Mineralöl ab. Legen Sie die gezogene Mikropipettennadel in den Halter und richten Sie sie unter einem Präpariermikroskop aus, montieren Sie einen Donor- und einen Empfängerwurm nahe beieinander auf dem aros pad.

Positionieren Sie die Würmer mit geringer Vergrößerung und bringen Sie die Nadel in das Mineralöl in der Nähe des Spenders. Schalten Sie auf hohe Leistung um und positionieren Sie die Nadel in der Nähe eines Pseudo-Hohlraums. Erhöhen Sie den Ausgleichsdruck auf ca. 10 PSI.

An der Spitze der Nadel ist ein Mineralölstopfen zu sehen. Schieben Sie die Schnecke in die Nadel, um die Nadelspitze in der Pseudokavität zu positionieren, indem Sie den Tisch bewegen. Beachten Sie einen Sprung in der Position des Mineralöls in der Spitze der Nadel.

Reduzieren Sie den Gleichgewichtsdruck, damit die Kapillarwirkung die Nadel nach dem Auffangen der Flüssigkeit füllen kann. Schiebe den Wurm von der Nadel weg. Sobald die Nadel im Empfängerwurm positioniert ist, verwenden Sie die Injektionsfunktion, um die vom Spender gesammelte Pseudoflüssigkeit zu injizieren.

Entfernen Sie die Nadel aus dem Empfängerwurm, indem Sie den Mikroskoptisch in die entgegengesetzte Richtung schieben, wie es beim Eindringen der Nadel aus dem Wurm in den Empfänger verwendet wurde. Hebe die Nadel vom Injektionspad weg. Entfernen Sie das Injektionskissen und geben Sie ein Tröpfchen M neun auf die Würmer, um sich zu erholen.

Geben Sie ein 10-Mikroliter-Tröpfchen M neun auf eine Assay-Platte. Nehmen Sie den Empfängerwurm in das M neun auf der Assay-Platte, um den phänotypischen RNAI-Transfer zu untersuchen. Lassen Sie die wiedergefundenen Würmer 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius wachsen.

Entnehmen Sie die erwachsenen Empfänger, lassen Sie die Embryonen und geschlüpften Nachkommen auf der Platte zurück, inkubieren Sie die Platte für weitere 24 Stunden bei 20 Grad Celsius. Schließlich ist die Nachkommenschaft als nicht geschlüpft, sondern phänotypisch eine Mutante oder Wildtyp-Larven zu bewerten. Hier sind die Ergebnisse für den experimentellen Transfer von extrazellulärer Flüssigkeit aus klar.

Bei einem E 1745-Würmer, der auf Bakterien gezüchtet wurde, die DSR exprimierten und auf PAL abzielten, starben die Nachkommen der Spendertiere ab und/oder wiesen posteriore Musterungsdefekte auf. Nach dem Transfer von extrazellulärer Flüssigkeit von diesen Tieren auf die Pseudo-RNAi-naiven Wildtyp-Würmer zeigte ein Teil der nachfolgenden Nachkommen des Empfängertieres die erwarteten PAL-1-Mutanten-Phänotypen. Dies steht im Gegensatz zu den Nachkommen von Empfängertieren, die extrazelluläre Flüssigkeit von Spendertieren erhielten, die entweder mit bakteriellem Standardfutter oder unter Kontrolle gezüchtet wurden.

RNAi-Vektorbakterien, die nur Hintergrund-Letalitätsniveaus aufwiesen, während Nachkommen von Empfängern extrazellulärer Flüssigkeit von Spendertieren, die sich RNAi unterzogen, einen signifikanten Anstieg der Häufigkeit von DS-RNA-induzierten Phänotypen zeigten. Die Buße ist nicht so stark wie bei den Nachkommen der Spendertiere, wo fast 100% der Nachkommen als ungeschlüpfte Embryonen sterben und nur seltene, stark deformierte Tiere schlüpfen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie extrazelluläre Flüssigkeit isolieren und Transfers von inneren Tieren durchführen können, um Fragen zur Zusammensetzung und Funktion von Pseudoflüssigkeiten zu beantworten.