Name: Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Lernen Sie die Isolierung extrazellulärer Flüssigkeit aus Caenorhabditis elegans für Studien zu RNAi-Signalwegen und Pseudocoelom-Flüssigkeit. Diese Methode ermöglicht direkte Analysen systemischer Gen-Silencing-Prozesse.

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Wir möchten den kooperativen Charakter der Hunter-Labor bestätigen, und danke ihnen für die hilfreiche Diskussionen und Unterstützung, die Entwicklung dieser Technik möglich und Spaß gemacht. Wir möchten Nigel Delaney und Caenorhabditis Genetics Center for Wurm und Bakterienstämme danken. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health GM089795 Zuschuss CPH unterstützt.

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li>
<li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li>
<li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li>
<li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mec-3%2C+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li>
<li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben hier ein neuartiges Verfahren, das die Isolierung und Charakterisierung der extrazellulären Flüssigkeit von der ermöglicht Modellorganismus C. vorgestellt elegans. Die Technik beginnt mit der genetischen oder physikalische Manipulation von Spender Würmer ihr Gesamtvolumen der extrazellulären Flüssigkeit zu erhöhen. Extrazellulären Flüssigkeit wird dann isoliert unter Verwendung eines modifizierten Mikroinjektionstechnik. Die Würmer sind für die Mikroinjektion mit trockener Agarose-Pads, um di...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Day</strong</td&gt;<td<strong&gt; Worm Prep</strong</td&gt;<td<strong&gt; Material Prep</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 Oder Standes</td&gt;<td&gt; Pflegen sauber, gut gefüttert<em&gt; Clr-1 (e1745)</em&gt; N2 und Würmern</td&gt;<td&gt; Make Injektion Pads, NGM-Platten, NGM + Carb / IPTG Platten, OP50 LB Lager</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Streak von RNAi Essen auf LB + Carb</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Impfen 3 mL Übernachtung mit RNAi Lebensmitteln</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&gt; Bewegen Embryonen RNAi Platte</td&gt;<td&gt; Seed RNAi Platte</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; Umschalttaste Würmern bis 25 für 4 Stunden</td&gt;<td&gt; Make Testplatten</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Bewegen Würmer NGM-Platten reinigen</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Vampiric Transfer</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Wiederherstellen Empfänger</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +1</td&gt;<td&gt; Entfernen Übertragungsbehältnis</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +2</td&gt;<td&gt; Score Progeny</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabelle 1.</strong&gt; Material Vorbereitung Timeline.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Ausrüstung</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picoliter Druck Injector</td&gt;<td&gt; Warner Instruments</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung</td&gt;<td&gt; Sutter Instruments</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; Reagenzien</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mineral Oil</td&gt;<td&gt; EM Science</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50 no 1 ½ Deckglas</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE Agarose</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borosilikatglas Kapillaren</td&gt;<td&gt; World Precisions Instruments</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Natriumhypochlorit-Lösung (5% verfügbares Chlor)</td&gt;<td&gt; JT Baker</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; C. elegans</em&gt; Und Bakterienstämme</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Clr-1 (e1745) II</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; Die Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; GLP-1</em&gt; RNAi-Vektor<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Source Bioscience (Ahringer Feeding Library)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; PAL-1</em&gt; RNAi-Vektor<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; PHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Die Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; E. coli</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabelle 2.</strong&gt; Spezifische Reagenzien und Geräte.</p

vampiric isolation der extrazellulären flüssigkeit aus<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Die genetisch gefügig Modellorganismus C. elegans hat Einblicke in eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen vorgesehen, aktiviert durch seine kurze Generationszeit, einfache Wachstum und geringe Größe. Diese geringe Größe, aber hat lehnten eine Reihe von technischen Ansätzen in anderen Modellsystemen gefunden. Zum Beispiel ermöglichen Bluttransfusionen in Säugetier-Systemen und Transplantation Techniken in Anlagen Fragen des Kreislaufsystems Zusammensetzung und Signalisierung. Das Kreislaufsystem der Schnecke, der pseudocoelom, war bis vor kurzem nicht möglich direkt Assay. Um Fragen der interzellulären Signaltransduktion und Kreislaufsystem Zusammensetzung C. beantworten elegans Forscher haben traditionell genetische Analyse, Zelle / Gewebe-spezifische Rettung und Mosaik-Analyse eingeschaltet. Diese Techniken stellen ein Mittel zu folgern, was zwischen Zellen geschieht, sind jedoch nicht universell in Identifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Moleküle. Hier präsentieren wir eine neWLY entwickelten Technik direkt Assay die pseudocoelomic Flüssigkeit C. elegans. Die Technik beginnt entweder genetisch oder physikalische Manipulation um das Volumen des extrazellulären Fluids zu erhöhen. Danach werden die Tiere mit einem vampirischen umgekehrter Mikroinjektionstechnik mit einer Mikroinjektion rig, die feine Balance Druckregelung ermöglicht unterzogen. Nach Isolierung der extrazellulären Flüssigkeit, kann die aufgefangene Flüssigkeit durch Überführung in anderen Tieren oder durch molekulare Methoden untersucht werden. Um die Wirksamkeit dieser Technik zu demonstrieren wir eine detaillierte Konzept für Assay ein spezifisches Beispiel der extrazellulären Signalmolekülen, lange dsRNA während einer systemischen RNAi-Antwort. Obwohl Charakterisierung der systemischen RNAi ist ein proof of principle Beispiel sehen wir diese Technik als anpassungsfähig an eine Vielzahl von Fragen des Kreislaufsystems Zusammensetzung und Signalisierung beantworten.

Die Modell-Organismus<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendet pseudocoelomic Fluid als passives Kreislaufsystems. Direkter Assay dieser Flüssigkeit wurde zuvor nicht möglich. Hier präsentieren wir eine neuartige Technik direkt Assay den extrazellulären Raum, und verwenden systemischen Silencing-Signale während einer RNAi-Antwort als proof of principle Beispiel.

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Der genetisch handhabbare Modellorganismus C. elegans hat Einblicke in eine Vielzahl biologischer Fragestellungen ermöglicht, begünstigt durch seine kurze Generationszeit, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, extrazelluläre Flüssigkeit zu isolieren, um Fragen bezüglich ihrer Pseudo-Flüssigkeit, Zusammensetzung und Funktion zu beantworten, beispielsweise solche, die RNA-Signalübertragung im Auge betreffen. Dies wird erreicht, indem man zunächst Würmer mit Bakterien füttert, die dsRNA exprimieren, was zu einem leicht erfassbaren RNAi-Phänotyp führt. Anschließend werden die Würmer so belassen, dass sie RNAi-Silencing-Signale im gesamten Körper verbreiten können.Dann wird das Gesamtvolumen der verfügbaren extrazellulären Flüssigkeit erhöht. Schließlich wird mit einer Mikroinjektionsnadel die extrazelluläre Flüssigkeit entnommen und in einen RNAi-naiven Wurm injiziert. Letztendlich kann das Vorhandensein von RNAi-Silencing-Signalen durch die Auswertung der Nachkommen der injizierten Würmer nachgewiesen werden.Mithilfe dieser Methode können wir die Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit analysieren, um Einblicke nicht nur in das systemische RNAi, sondern auch in eine Vielzahl von interzellulären Signalwegen zu erhalten. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da man sehr schnell arbeiten m

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Forschung

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Dieses Video beschreibt eine Methode, um ganze Würmer in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren, die für FACS oder Immunpräzipitation intakter Zellen geeignet ist.

Einzelzelldissoziation von Caenorhabditis elegans: Eine Methode zur Isolierung lebender Zellen

Quelle: Petersen, C. et al., Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Isolierung und Kultivierung von Bakterienarten, die mit Caenorhabditis elegans assoziiert sind. Eine perlenbasierte Lyse von C. elegans, gefolgt von selektiver Kultivierung, ermöglicht die Isolierung verschiedener mikrobieller Stämme für weitere Analysen.

Isolierung und Kultivierung von Caenorhabditis elegans-assoziierten Bakterien

Dieses Video zeigt die Isolierung von fluoreszenzmarkierten Neuronen aus Caenorhabditis elegans. Eine Zellsuspension wird aus transgenen Würmern gewonnen, die so konstruiert wurden, dass sie fluoreszierende proteinfusionierte vesikuläre Transmembrantransporter in cholinergen Neuronen exprimieren. Die fluoreszenzmarkierten Neuronen werden dann mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert und in Kultur aufbewahrt.

Isolierung von Neuronen aus Caenorhabditis elegans durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

Hier stellen wir ein Protokoll zur einfachen Isolierung bestimmter Gruppen lebender neuronaler Zellen vor, die grünes fluoreszierendes Protein aus transgenen Caenorhabditis elegans-Linien exdrücken. Diese Methode ermöglicht eine Vielzahl von Ex-vivo-Studien, die sich auf bestimmte Neuronen konzentrieren und hat die Fähigkeit, Zellen für eine weitere kurzfristige Kultivierung zu isolieren.

Isolierung spezifischer Neuronenpopulationen von Roundworm Caenorhabditis elegans

Dieser Artikel stellt Methoden zur Erzeugung, Reinigung und Quantifizierung von Caenorhabditis elegans extrazellulären Vesikeln vor.

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

Das Protokoll beschreibt ein einfaches mikrofluidisches Chipdesign und eine Mikrofabrikationsmethodik, die verwendet wird, um C. elegans in Gegenwart einer kontinuierlichen Nahrungszufuhr für bis zu 36 h zu züchten. Das Wachstums- und Bildgebungsgerät ermöglicht auch eine intermittierende langfristige hochauflösende Bildgebung von zellulären und subzellulären Prozessen während der Entwicklung für mehrere Tage.

Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den mikrosporidianen Parasiten Nematocida parisii ermöglicht es den Würmern, Nachkommen zu produzieren, die gegen denselben Erreger sehr resistent sind. Dies ist ein Beispiel für vererbte Immunität, ein wenig verstandenes epigenetisches Phänomen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der vererbten Immunität in einem genetisch handhabbaren Wurmmodell.

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

Hier wird eine Beschreibung der einfachen und relativ schnellen Isolierung der genomischen DNA von Caenorhabditis elegans aus einem oder wenigen Tieren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gewebekits vorgestellt. Die resultierende gDNA-Präparation ist eine geeignete Vorlage für die PCR.

Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA

Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay zur Quantifizierung der Fütterungsrate von Caenorhabditis elegans , der auf der Messung der Clearance von Bakterien in Flüssigkulturen basiert.

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Lernen Sie die Isolierung extrazellulärer Flüssigkeit aus Caenorhabditis elegans für Studien zu RNAi-Signalwegen und Pseudocoelom-Flüssigkeit. Diese Methode ermöglicht direkte Analysen systemischer Gen-Silencing-Prozesse.

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus

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