Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr In Vivo Die Elektroporation

Jane wurde von in vivo, Elektroporation Ling Wang, Han Jang und John Burgandy, Oregon Hearing Research Center, Oregon Health and Science University, auf das Innenohr der sich entwickelnden Maus übertragen. Mein Name ist John Burgandy. Mein Labor befindet sich im Oregon Hearing Research Center an der Oregon Health and Science University.

Mein Name ist Ang. Ich bin ein Poster in Johns Labor. Ich bin Ang auch im Johns-Labor als Forschungsassistent

Unsere Präsentation gliedert sich in vier Teile. Die erste ist die ventrale Laparotomie. Wir demonstrieren den Natriumstift, die Anästhesie auf Barbitalbasis, den Test auf die Angemessenheit der Anästhesie, den Hornhautschutz, die Vorbereitung der Operationsstelle, das Datenblatt zur Desinfektion der Mausüberlebenschirurgie, den ventralen Mittellinienschnitt des Operationssaales durch die Haut und die Bauchdecke und die Externalisierung der Gebärmutterhörner.

Teil zwei ist die transuterine Mikroinjektion. Wir demonstrieren die Transillumination des Embryos, des Embryos, der Neuorientierung, der Mikroinjektion, der Pipette, der Herstellung und der Mikroinjektion in den Otis am embryonalen Tag 11.5 und am embryonalen Tag 12.5. Teil drei befasst sich mit der In-vivo-Elektroporation.

Wir demonstrieren die Platzierung der Paddel-Elektrode und die Elektroporation der embryonalen Tag 11.5 Maus O Assist. Der vierte Teil besteht aus repräsentativen Ergebnissen. Wir zeigen die Expression von GFP in spätembryonalen und frühen postnatalen Cochleas.

Dies resultierte aus der in vivo Elektroporation des Otis mit Expressionsplasmid am embryonalen Tag 11.5 Teil eins der ventralen Laparotomie. Das Muttertier wird sicher gehalten, indem die Haut hinter dem Hals, der Schwanz und die linke Hintergliedmaße gegriffen werden. Eine intraperitoneale Injektion eines Anästhetikums auf Natrium-Pentobarbital-Basis wird nach dem Abstrich des Bauches mit 70% Ethanol verabreicht.

Die Maus wird für vier bis fünf Minuten in ihren Heimatkäfig gelegt, damit das Anästhetikum wirken kann. Fuß- und Schwanzkneifungen werden verwendet, um die Angemessenheit der Anästhesie zu beurteilen. Dieser Damm schließt sich als Reaktion auf das Einklemmen des Schwanzes und braucht noch zwei Minuten, bevor er nicht mehr auf schädliche Reize reagiert.

Eine sterile Augensalbe wird auf die Augen aufgetragen, um die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen. Wir bereiten das Operationsfeld in einem chemischen Abzug vor, um die Ausbreitung von Fell und Hautschuppen zu minimieren. Das Fell wird mit einer feinen Klinge rasiert, um die Haut freizulegen, die die Bauchdecke bedeckt.

Die vollständige Fellentfernung erleichtert die Heilung des Schnittes nach der Operation. Die Desinfektion der Bauchhaut wird durch abwechselnde Durchgänge von 70 % Ethanol, Betadin und 70 % Ethanol erreicht. Wischen Sie immer von rostral zu coddle und verwenden Sie einen frischen chirurgischen Wattebausch oder einen Applikator mit Wattespitze.

Bei jedem Durchgang beurteilen wir die Tiefe und Qualität der Atmung während der Desinfektion, um sicherzustellen, dass der Damm nicht ansprechbar ist. Nach dem zweiten 70%igen Ethanoldurchgang legten wir sofort die verdammte Bauchfläche auf ein steriles Abdecktuch und legten sie für zwei bis drei Minuten auf ein beheiztes Pad, um sie zu wärmen. Dies ist ein geeigneter Zeitpunkt, um präoperative Daten auf dem Protokollblatt für das Überleben der Maus aufzuzeichnen. Als ergänzende Information haben wir unser Datenblatt zur Überlebenschirurgie von Mäusen angehängt.

Erwägen Sie, das Datenblatt und Ihr Tierpflegeprotokoll beizufügen, damit Ihr institutioneller Ausschuss für Tierpflege und -verwendung sehen kann, wie Sie präoperative und postoperative Daten überwachen. Wir füllen für jeden chirurgischen Proband ein Protokollblatt aus. Wir bevorzugen es, Operationen in einer sterilen Umgebung durchzuführen, obwohl dies für Nagetiere in der Regel nicht erforderlich ist.

Die Arbeitsfläche ist vom Gebläsemotor und dem Plenumgehäuse getrennt, so dass keine Vibrationen auf den Benutzer übertragen werden. Während der Mikroinjektion haben wir als zusätzliche Information ein Schema der Änderungen beigefügt, die wir an unserer Laminar-Flow-Haube vorgenommen haben, um den In-utero-Gentransfer zu erleichtern. Die wesentlichen Änderungen sind geringe Wasser- und Schienenbeleuchtungsausschnitte und versteckte Buchsen für Netzkabel des Instruments sowie ein Routing-Pfad für elektrische Schaltkreise von Zubehör. Der Operationssaal besteht aus dem Infusionsbeutel für elektrische Laktationsringer, einem Warmbad, einem XY-, Z-Manipulator, einem Stereofluoreszenzmikroskop, einem Präpariermikroskop, einer faseroptischen Lichtquelle und chirurgischen Instrumenten.

Über die Fußpedale wird der Mikroinjektor ausgelöst, der Elektroperter geht in den Fokus. Die chirurgischen Instrumente des Endoskops werden in einem Autoklaven sterilisiert. Die Instrumente müssen zwischen Mäusen mit einem Glasperlensterilisator oder durch erneutes Autoklavieren des Nadeltreibers erneut sterilisiert werden.

Balli Schere, Ringzange und Gefäßzange sind die unverzichtbaren Werkzeuge. Ventraler Mittellinienschnitt, mit einer Gefäßzange die Haut fassen und das Integument mit der Kugelschere herausschneiden, den Schnitt um 10 bis 14 Millimeter verlängern. Identifizieren Sie das weiße avaskuläre Band aus verbundenem Gewebe, die Linea alba, und die ventrale Mittellinie des Abdomens, schneiden Sie die lineare Alba mit der Kugelschere ein.

Achten Sie darauf, dass Sie den Darm oder die Leistenfettpolster nicht einschneiden. Spülen Sie den Bauch sofort mit steriler Prewarm-Laktat-Ringerlösung. Beurteilen Sie die Schnittstellen in der Haut und der Bauchdecke auf Blutungen.

Direkter Druck mit einer stumpfen Pinzette stoppt kleinere Blutungen, falls vorhanden, und verlagert das rechte und linke Gebärmutterhorn mit einer Ringzange. Fassen Sie das rechte Gebärmutterhorn vorsichtig mit einem ringförmigen Ende der Pinzette auf und ziehen Sie die Gebärmutter in Richtung des Mittellinienschnitts. Bewege mit der freien Hand sanft die seitliche Seite des Damms, um das Einhaken der Gebärmutter zu erleichtern.

Die Pinzette wird niemals verwendet, um die Gebärmutter zu komprimieren und herauszuziehen. Da dies das Gefäßsystem der Gebärmutter oder die Embryonen schädigen könnte, wiederholen Sie den Externalisierungsvorgang für das linke Gebärmutterhorn. Spülen Sie die neu externalisierten Gebärmutterhörner sofort mit vorwarmer Laktationsringerlösung, führen Sie die Inalfettpolster oder den Darm vorsichtig wieder ein, falls sie mit der Gebärmutter nach außen gelangen.

Das ist nicht oft anzutreffen. Teil zwei: Mikroinjektion in die Gebärmutter. Der Damm ist unter dem Objektiv mit großem Arbeitsabstand angeordnet und ein weiches Kabelfaserlicht wird gegen die Gebärmutterwand gesetzt.

Die Gebärmutter wird mit einem Finger der freien Hand sanft gedrückt. Um die Identifizierung der Ausrichtung des Embryos zu erleichtern. Das Licht des Glasfaserkabels sollte die geringste Intensität haben, die erforderlich ist, um die Embryonenorientierung genau zu beurteilen.

Intensives Licht kann Wärme an die Gebärmutter übertragen, was zu Komplikationen führen kann. Wir halten das faseroptische Licht und die Gebärmutter in einer Hand und verwenden einen Finger an unserer freien Hand, um den Embryo durch sanftes Abtasten neu zu positionieren. Im Folgenden zeigen wir drei Videos mit dem Mikroskop EC-Clips und die gängigen Embryonenorientierungen, die von der Gebärmutter beobachtet werden.

Der Betrachter sieht die mikroskopische Ansicht, die wir während der Trans-Beleuchtung sehen, obwohl die Trans-Beleuchtung der Gebärmutter in Schwarz-Weiß die Erkennung der Orientierung des Embryos in vivo ermöglicht. In diesem Beispiel befindet sich der Embryo in einer Kopfstandposition, wobei die Bauchfläche dem Betrachter zugewandt ist. Indem wir die Gebärmutter hin und her bewegen, können wir die rechten und linken Hintergliedmaßen, den Schwanz und das Kopffell des linken Auges erkennen.

In diesem Beispiel befindet sich der Embryo wieder in der Kopfstandposition, aber um etwa 90 Grad zur vorderen hinteren Achse gedreht. Wenn wir die Gebärmutter sanft hin und her bewegen, können wir die Paddelformen sehen, die die linke Hintergliedmaße und die linke für die Gliedmaßen definieren. Das Hinterhirn ist ebenfalls sichtbar.

Der Embryo befindet sich in einer aufrechten Position mit der linken Seite zum Betrachter. Der entstehende vierte Ventrikel ist als heller Fleck im Hinterhirn erkennbar. Das Cephalon des linken Auges, die linken vier Gliedmaßen und die linken Hintergliedmaßen sind ebenfalls sichtbar.

Durch sanften Druck auf die Gebärmutter werden die Embryonen leicht neu ausgerichtet, um den Hauptstamm der primären Kopfvene und ihre vorderen und hinteren Äste, die mit einem weißen bzw. schwarzen Sternchen gekennzeichnet sind, erkennen zu können. Wie wir sehen werden, befindet sich der Otis auf halbem Weg zwischen dem vorderen und hinteren Ast der primären Kopfvene. Der Otis selbst kann durch die Gebärmutter nicht durch Durchleuchtung gesehen werden.

Wir zeigen in zwei aufeinanderfolgenden Videomikroskopie-Clips, wie man den Embryo für die Mikroinjektion in den Otis-Assist neu ausrichtet. Ziel ist es, die embryonalen Landmarken zu identifizieren, die eine Interpolation der Position des Otis im lateralen Kopf ermöglichen. Unser Ziel ist es, den Embryo von der dorsalen in die laterale Position neu auszurichten, damit wir die primäre Kopfvene identifizieren können.

Das Mesencephalon, der vierte Ventrikel und der linke Ventrikel für die Gliedmaßen sind in dorsaler Position sichtbar. Sanfter Druck auf die Gebärmutter verschiebt die Ausrichtung des Embryos von dorsal nach später. Das Cephalon, das Mesencephalon und der vierte Ventrikel des linken Auges sind leicht zu erkennen.

Die primäre Kopfvene und ihr hinterer Ast, der durch das Sternchen gekennzeichnet ist, sind ebenfalls sichtbar. Der vordere Ast der primären Kopfvene ist nicht eindeutig zu erkennen. Unser Ziel ist es wiederum, den Embryo so auszurichten, dass er die primäre Kopfvene identifizieren kann, jedoch unter einer höheren Vergrößerung, die für die Mikroinjektion der Gebärmutter geeignet ist.

In dieser lateralen Perspektive sind die Gebärmuttergefäße, das Dezidualband und das linke Auge zu sehen. Sanfter Druck auf die Gebärmutter verschiebt die Position des Embryos, so dass wir das linke Auge des vierten Ventrikels erkennen können. Die primäre Kopfvene und ihr hinterer Ast, der durch das Sternchen gekennzeichnet ist, die primäre Kopfvene und ihre Äste bilden die Form von American-Football-Pfosten.

Das Vesikel oticus ist nicht durch die Gebärmutter zu sehen, befindet sich aber in der Mitte der Pfosten. Lynn hat eine Injektionssequenz für einen Embryo eingeleitet. Sie beleuchtet die Gebärmutter, richtet den Embryo für eine Mikroinjektion neu aus und bringt die mit Fast Green gefüllte Mikroinjektionspipette ins Feld.

Die Mikroinjektionspipette ist an einem Pipettenhalter befestigt, der von einem X-, Y-, Z-Mikrom-Manipulator gehalten wird. Das Magnetstativ des Manipulators ist an einer Stahlplatte mit Teflonbasis befestigt, die eine mühelose grobe Positionierung der Mikroinjektionspipette ermöglicht. Die Nadel wird mit dem vorderen Mikrometer-Drehknopf am Manipulator entsprechend vorgeschoben.

Hergestellte Pipetten sind für eine traumatische Mikroinjektion in den Mausembryo im frühen Otis-Stadium unerlässlich. Wir ziehen dickwandige Kapillarrohre aus Borosilglas mit einem horizontalen Pipettenabzieher. Die resultierende Pipette, die in A gezeigt wird, wird manuell mit einer Pinzette in etwa der Position mit einem Außendurchmesser von 14 bis 16 μm gebrochen, die durch die Pfeilspitze in B angezeigt wird. Der grobe Bruch der Pipette in C ist gezackt und zerbrechlich.

Wir schrägen die Pipette um etwa 20 Grad ab, um die Pipettenspitze zu schärfen, wie in Panel D zu sehen ist, die Parameter für das Ziehen und Anfasen von Mikroinjektionspipetten sind im Begleittext angegeben. In den nächsten beiden Videomikroskopie-Clips zeigen wir die Mikroinjektion in die Maus an den embryonalen Tagen 11,5 und 12,5. Unser Ziel ist es, die Mikroinjektion der Gebärmutter in den embryonalen Tag zu demonstrieren, 11,5 Maus-Otik.

Zuerst injizieren wir die Okaden ohne vorhandene Gebärmutter, um eindeutig zu zeigen, wie eine zielgerichtete Injektion aussieht. Dann demonstrieren wir eine authentische transuterine Mikroinjektion. Für diese erste Injektion wurde der Uterus fally eingeschnitten, damit der viszerale Sack extrudieren konnte, das Dezidualband über dem viszeralen Dottersack wurde entfernt.

Die Plazenta bleibt mit der Gebärmutter verbunden und der Embryo lebt. Nachdem die Gebärmutter fokal entfernt wurde, sehen wir den vierten Ventrikel, die primäre Kopfvene und ihre vorderen und hinteren Äste, die Pipette und die ungefähre Position der Zyste in weiß. Zu Beginn dieser Injektionssequenz wird der Blutfluss im viszeralen Dottersack-Gefäßsystem festgestellt.

Die Pipette wird durch den viszeralen Dottersack vorgeschoben und Dai wird in die Osisnote, den Endo-Lymphgang dorsal und die Position der Otics in der Mitte der Pfosten injiziert. Die Okaden befinden sich auf halbem Weg zwischen dem vorderen und hinteren Ast der primären Kopfvene, Gebärmutter-Mikroinjektion in den Embryonaltag. 11.5 Die Otik der Maus erfordert die Detektion der primären Kopfvene und mindestens eines ihrer Äste, um die Lokalisation der otischen Unterstützung abzuschätzen.

Unser Ziel in diesem diagrammatischen Beispiel ist, dass sowohl der vordere als auch der hintere Ast der primären Kopfvene detektiert werden, wobei das OUC-Territorium weiß markiert ist. Eine realistischere Darstellung des Embryos ist eine, bei der der Hauptstamm der primären Kopfvene zusammen mit nur einem ihrer Äste erkannt wird und das gezeigte Beispiel nur den hinteren Ast der primären Kopfvene zeigt, aber das reicht aus, um die Lage der Otics zu interpretieren. Die PT wird durch die Gebärmutter vorgeschoben und der Farbstoff wird in die Ottics injiziert.

Wir warten 30 Sekunden, damit der Farbstoff aus der Fruchthöhle austreten kann, dann können wir den Endo-Lymphgang dorsal und das Vestibulum sehen. Wir schließen mit einer Ansicht des Embryos mit geringer Vergrößerung, dessen Zyste wir gerade injiziert haben, um eine anatomische Perspektive zu bieten. In dieser Ansicht sind der vierte Ventrikel, das linke Auge und das Uterusgefäßsystem zu sehen. Wir zeigen Trans- und Mikroinjektion in die embryonale Tag-12-Maus-Zyste und Mikroinjektion in den entstehenden vierten Ventrikel des Hinterhirns.

Die Durchleuchtung ermöglicht es uns, sowohl die primäre Kopfvene in dieser linken Seitenansicht als auch das Auge zu erkennen. Die Pipette wird durch die Gebärmutter in das otische Vesikel vorgeschoben und stirbt durch Injektion, um das Lumen zu füllen. Um den vierten Ventrikel zu injizieren, drehen wir den Embryo um 90 Grad, um eine dorsale Ansicht des Hinterhirns zu erhalten.

Die injizierte linke Zyste befindet sich nun auf der linken Seite. Die Pipette wird durch die Gebärmutter geschoben und schnell grün mit lor vermischt. Konjugiertes Dextran wird in den vierten Ventrikel injiziert.

Es ist zu beachten, dass die Menge des injizierten Farbstoffs in vivo nicht in das Mittelhirn gelangt. Die Fluoreszenz wird nach der Injektion beurteilt, um die Lokalisation des Dextrans im vierten Ventrikel zu validieren. Der Embryo wird dann von der dorsalen in die laterale Position umorientiert.

Der Endo-Lymphgang befindet sich in dieser Seitenansicht nur ventral zum vierten Ventrikel. In vivo validiert die Fluoreszenz die Lokalisation des Dextrans im vierten Ventrikel. Bei der Geburt untersuchen wir die Jungtiere mit Hilfe einer Epi-Fluoreszenz auf grüne Fluoreszenz im vierten Ventrikel.

Präparierende Mikroskop-Welpen mit grüner Fluoreszenz im Hinterhirn besitzen ein Innenohr, das während der Embryogenese, Teil drei, der In-vivo-Elektroporation, manipuliert wurde. Nach dem Füllen der Zyste mit Expressionsplasmid wird die Gebärmutter frisch mit vorwarmer Laktationslösung gespült. Die Durchleuchtung erleichtert die Zentrierung der ODU-Zyste im Elektrodenfeld.

Der Metallkopf der faseroptischen Leuchte wird von der Gebärmutteroberfläche zurückgezogen. Bevor wir die Rechteckpulsfolge initiieren, zeigen wir im nächsten Videomikroskopie-Clip einen kompletten Elektroporationszyklus in vivo. Die Elektroporation des embryonalen Tages, 11,5 Maus otische Zyste erfordert eine sanfte Platzierung der Paddelelektroden an der Gebärmutter.

In diesem Beispiel wurde die linke otische Zyste mit Expressionsplasmid gefüllt und die Gebärmutter wurde frisch mit Laktationsringern gespült. Die Kathode ist lateral in Bezug auf die gefüllte Otokenzyste positioniert und die Kathode ist medial am Anfang der Ationssequenz positioniert, die Otozyste ist im Paddelfeld zentriert. Die Gebärmutter wird sanft zusammengedrückt und die Rechteckpulsfolge wird mit einem Fußpedalschalter eingeleitet.

Im Idealfall werden 60 bis hundert Milliampere Strom pro Impuls abgegeben. Anschließend wird die Gebärmutter freigegeben und sofort gespült. Die frisch gespülte Gebärmutter wird durch sanften Druck mit der Ringzange wieder in die Bauchhöhle zurückgeführt.

Sobald die Gebärmutter internalisiert ist, wird die Bauchhöhle mit etwa vier mil laktierten Ringern gespült, wobei etwa eine mil laktierte Ringer in der Bauchhöhle verbleiben, um die Hydratation der Hündin aufrechtzuerhalten, die unmittelbar nach der Bauchoperation weniger Wasser als üblich trinkt. Die Bauchdecke und anschließend die Haut werden mit resorbierbarem Naht mit einem Nadeltreiber verschlossen. Unser Nadeltreiber verfügt über eine eingebaute Schere, die das Schließen erleichtert.

Wir bevorzugen einen Laufstich sowohl für die Bauchdecke als auch für die Haut. Wir verriegeln jeden zweiten Stich, um zusätzliche Unterstützung an der Inzisionsstelle zu bieten. Wir verabreichen ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament subkutan, bevor wir das Muttertier in den Auffangkäfig legen.

Beraten Sie sich mit Ihrem Tierarztpersonal, welche prophylaktischen Analgetika von Ihrem institutionellen Tierpflege- und -verwendungsausschuss bevorzugt werden. Der Damm ist in ein steriles Tuch eingebettet und wird auf den Boden des beheizten Auffangkäfigs gelegt. Der Auffangkäfig enthält Nistmaterial, ein rotes Rohr als Abdeckung, Laborfutter und eine Wasserflasche.

Der Käfig wird am Morgen nach der Operation wieder mit einer Filterhaube auf der Oberseite zusammengebaut. Die Mutter ist wunderschön gepflegt, gehfähig und in der Lage, auf ihren Hinterbeinen zu balancieren, um sich nach dem offenen Käfig zu erkundigen. Die Nahtlinie im Bauch ist sauber, trocken und zeigt keine Anzeichen von Trennung, Rötung oder Schwellung.

Wir haben ein Dokument beigefügt, in dem die Entwicklung von Tierpflegeprotokollen für den In-utero-Gentransfer erörtert wird. Das Dokument enthält Formulierungen, die nützlich sein können, wenn Sie in Absprache mit Ihrem Ausschuss für Tierpflege und -verwendung ein institutionsspezifisches Protokoll entwerfen. Vierter Teil, repräsentative Ergebnisse.

Die repräsentativen Ergebnisse der Tafeln A und B zeigen eine repräsentative Cochlea eines postnatalen Welpen am sechsten Tag, dessen Otis am embryonalen Tag 11,5 mit einem verstärkten grün fluoreszierenden Proteinexpressionsplasmid und dann mit Elektro injiziert wurde. Die Cochlea-Seitenwand wurde von der Mittel- und Spitze entfernt. Nur die GFP-Expression ist von der Basis bis zur Mitte der Cochlea vorhanden und folgt der Verteilung des Haarzellmarkers Myosin sieben A, die in Panel B gezeigt ist. Panel C zeigt eine konfokale Projektion des embryonalen Tages mit geringer Vergrößerung.

18.5 Maus Organ der Corde Immun gefärbt mit einem Myosin Seven A Antikörper transfizierte Zellen sind im gesamten Organ der Corde verteilt. Bild D zeigt eine konfokale Projektion des embryonalen Tages mit hoher Vergrößerung. 18.5 Mausorgan der Corde, gefärbt mit Cin Sieben.

Eine GFP-Expression wird in inneren und äußeren Haarzellen, Interphalangealzellen, Säulenzellen und TER-Zellen nachgewiesen. Elektroporationsvermittelter Gentransfer zu den Otis am embryonalen Tag 11.5 Transfect Vorläuferzellen, aus denen alle Komponentenzelltypen innerhalb des Organs der Corde hervorgehen.