Beurteilung der GFP Expression und Lebensfähigkeit Mit der Tali Image-Based Cytometer

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Bestimmung der Zellviabilität in Zellen, die GFP exprimieren, unter Verwendung des bildbasierten Tally-Zytometers. GFP-transduzierte Zellen werden mit dem Tally-Viabilitätskit Dead Cell Red gefärbt, das alle toten Zellen mit Propidiumiodid rot färbt, die Zellen werden in einen Tally-Zellanalyseobjektträger pipettiert und in das Zytometer geladen, das Hellfeld-, Rot- und Grünfluoreszenzbilder aufnimmt und analysiert. Anschließend werden Histogramme erstellt, um die Zellzahl, die Zellgröße, die PI-Fluoreszenzintensität und die GFP-Fluoreszenzintensität im Vergleich zur herkömmlichen Durchflusszytometrie anzuzeigen.

Tali kann ähnliche Daten zur Zellviabilität und -expression liefern. Diese bildbasierte Zytometrie liefert jedoch zusätzliche visuelle Informationen über die untersuchte Zellpopulation. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Durchflusszytometrie oder der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass das auf Tally-Bildern basierende Zytometer sowohl quantitative als auch visuelle Informationen über Ihre Zellprobe gleichzeitig liefert.

Darüber hinaus ist das Tally-Instrument einfacher zu bedienen, kostengünstiger und hat einen geringeren Platzbedarf als ein Durchflusszytometer oder ein Fluoreszenzmikroskop. Dies ermöglicht es Forschern, schnell quantitative Assays wie die Lebensfähigkeit in GFP-exprimierenden Zellen auf dem Labortisch durchzuführen. Bei diesem Verfahren wurden U2-OS-Zellen in einer Konzentration von eins mal 10 bis zu sechs Zellen pro Milliliter mit einem nuklearen Zielzelllicht GFP-Viruskonstrukt transduziert, um tote Zellen mit Propidiumiodid zu erhalten, die 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen übertrugen.

Beachten Sie, dass für den Assay eine Konzentration von eins mal 10 bis 10 bis sieben Zellen pro Milliliter empfohlen wird, obwohl die Konzentration nicht genau sein muss. Fügen Sie als Nächstes einen Mikroliter Tally Dead Cell Red Reagenz hinzu. Dann zum Mischen kurz vortexen, das Färbereagenz und die Zellmischung bei Raumtemperatur im Dunkeln ein bis fünf Minuten lang inkubieren.

Fahren Sie nach der Inkubation sofort mit der Analyse auf dem bildbasierten Zählzytometer fort. Für die Zählung werden Einweg-Zellanalyseobjektträger aus Kunststoff verwendet, die speziell für das Instrument entwickelt wurden. Achten Sie immer darauf, die Folie an den Rändern festzuhalten, um die Folie zu laden.

Pipettieren Sie 25 Mikroliter Probe langsam in einen der halbmondförmigen Probenladebereiche. Hier werden ungefärbte, nicht t-transduzierte Kontrollzellen in Kammer A geladen und die gefärbten GFP-exprimierenden Zellen werden in die Kammer geladen, B.To einen Viabilitätsassay in GFP-exprimierenden Zellen durchzuführen, berühren Sie G-F-P-R-F-P auf dem Startbildschirm des Zytometers. Die Assay-Optionen werden dann auf der rechten Seite angezeigt: GFP plus Viabilität.

Das Gerät fragt dann, ob die Probenreihe benannt werden soll, um die Probenreihe zu benennen. Drücken Sie jetzt auf Name. Geben Sie dann über den Touchscreen den Namen der Probenserie ein und drücken Sie auf Speichern, das Tally-Zytometer wechselt automatisch zum Messbildschirm.

Um als Nächstes die Hintergrundfluoreszenz zu messen, drücken Sie auf die Registerkarte Hintergrund in der unteren rechten Hälfte des Messbildschirms, wie hier zu sehen ist. Die Standardeinstellung gibt an, dass neun Felder von Zellen abgebildet werden. Halten Sie nun die Kontrollprobe vom Gerät weg und führen Sie den Objektträger bis zum Anschlag in die Ladeöffnung ein.

Wenden Sie keine Kraft auf den Hintergrundbildschirm an, berühren Sie die Tastenkombination, um ein neues, nicht fleckiges Zellensteuerelement einzufügen. Der Objektträger wird automatisch in das Gerät gezogen und ein Live-Bild der Zellen wird auf dem Bildschirm angezeigt. Bringen Sie die Zellen mit dem Fokusknopf während des Fokussierens in die richtige Ansichtsebene.

Schieben Sie die rote Zoom-Taste auf vier x oder 16 x. Um die Zellpopulation besser sehen zu können, sollten die Zellen gleichmäßig dunkel sein und jeweils von einem hellen Halo umgeben. Wie hier gezeigt, können Zellen unterzählt werden, wenn der Übergang zwischen dem Hintergrund und den Rändern der Zellen unscharf ist, sodass die Zellgrenzen nicht gut definiert sind.

Zellen können übergezählt werden, wenn sie helle Mittelpunkte und dunkle Ränder aufweisen. Sobald die Zellen in den Fokus gebracht wurden, berühren Sie und drücken Sie, um die ungefärbte Zellkontrolle auszuführen. Um die Hintergrundfluoreszenz zu messen, nimmt das Zytometer automatisch Bilder auf und zeigt Miniaturansichten jedes Sichtfelds an.

Der Fortschrittsbalken bietet eine fortlaufende Aktualisierung der Analyse. Nachdem die Bildaufnahme abgeschlossen ist, wirft das Zytometer den Objektträger automatisch aus und liefert die Daten aus der Analyse der aufgenommenen Bilder. Gespeicherte Daten werden im Dropdown-Menü des Hintergrund-Tabs angezeigt.

Der Hintergrundkontrollstichprobe wird derselbe Name zugewiesen, den sie dem Experiment zugewiesen hat. Um die PI-gefärbte GFP-transduzierte Probe zu verwenden, entfernen Sie den Objektträger aus dem Gerät, drehen Sie ihn um und setzen Sie ihn wieder ein, wobei die transduzierte Probe vom Gerät weg zeigt. Drücken Sie auf die Registerkarte "Sample" und berühren Sie dann "Drücken", um ein neues Sample einzufügen.

Wenn das Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird, verwenden Sie den Fokusknopf, um die Zellen scharf zu stellen. Berühren Sie dann wie zuvor Drücken Sie, um das Muster auszuführen. Nachdem die Bildaufnahme abgeschlossen ist, werden die Daten aus der Analyse auf der Registerkarte "Probe" angezeigt, und das Zytometer wirft den Objektträger automatisch entsprechend aus.

Entsorgen Sie den Objektträger für die Tally-Zellanalyse. Als biologisch gefährlicher Abfall können diese Objektträger nicht wiederverwendet werden. Sobald die Stichprobe ausgeführt wurde, können Schwellenwerte auf die Stichprobe angewendet werden.

Um hier bestimmte Zellpopulationen zu analysieren, passen wir die Schwellenwerte an, um den Prozentsatz lebender und toter Zellen zu bestimmen. Bei GFP-exprimierenden Zellen unter der Probenregisterkarte die Anzahl und der Prozentsatz der Zellen, die GFP exprimieren, lebende und tote Zellen, die GFP exprimieren, die Gesamtlebensfähigkeit. Die durchschnittliche Zellgröße, die Anzahl der gezählten Zellen und die Zellkonzentration werden angezeigt.

Darüber hinaus werden am unteren Bildschirmrand Histogrammdiagramme angezeigt, die die Zellgröße, die grüne Fluoreszenz und die rote Fluoreszenz anzeigen. Um das Zellengrößen-Gate festzulegen, berühren Sie die Miniaturansicht der Zellengröße, um das Histogramm der Zellengröße zu öffnen und Partikel auszuschließen. Verschieben Sie die blauen Schieberegler, um sowohl große als auch kleine Events auszuschließen.

Tippen Sie auf Anwenden, um die Zellen in die Gates einzuschließen. Um die GFP-Fluoreszenz zur Analyse hinzuzufügen, berühren Sie die Miniaturansicht des GFP-Histogramms. Um es zu öffnen.

Verschieben Sie den blauen Schieberegler, um den Schwellenwert direkt rechts neben dem schwächsten Peak festzulegen. Verwenden Sie das Kontrollbeispiel als Richtlinie. Dies ermöglicht es, die GFP-positiven Zellen in die Analyse einzubeziehen, aber autofluoreszierende Zellen auszuschließen.

Autofluoreszenz wird häufig beobachtet, wenn biologische Moleküle in Zellen excel touch angewendet werden, um zu bestätigen und zum vorherigen Bildschirm zurückzukehren. Die Daten, die auf der Registerkarte "Sample" angezeigt werden, sollten nun die Gates und den Schwellenwert widerspiegeln, die für beide Fluoreszenzkanäle festgelegt wurden. Um die PI-Färbezellen von der Autofluoreszenz oder einem in der Probe vorhandenen Hintergrund zu trennen, drücken Sie auf die Miniaturansicht des PI-Histogramms, um sie wieder zu öffnen.

Der Peak der Kontrollprobe wird als grauer Peak im Histogramm angezeigt. Der rote Peak ist die Fluoreszenz der Probe. Die Hintergrundfluoreszenz wird bei diesem Instrument als Peak angezeigt, der dem RFU-Wert von Null am nächsten liegt.

Um die Hintergrundfluoreszenz im PI-Kanal zu eliminieren, verschieben Sie den blauen Schieberegler, um den Schwellenwert anzupassen. Um diesen Peak auszuschließen, verwenden Sie den grauen Peak aus dem Kontrollsample als Referenz. Wenn der Schwellenwert im PI-Kanal richtig eingestellt ist, berühren Sie Anwenden, um zu bestätigen und zum vorherigen Bildschirm zurückzukehren, das Tally-Instrument analysiert die Daten erneut automatisch und aktualisiert die Ergebnisse auf der Registerkarte "Sample".

Um visuell zu bestätigen, dass jede Zelle richtig zugewiesen ist, drücken Sie auf die Registerkarte Zoom und wählen Sie dann ein erfasstes Sichtfeld zur Überprüfung aus, indem Sie auf die Miniaturansicht des Bildes drücken. Drücken Sie dann auf die Registerkarte Ebenen. Drücken Sie anschließend die GFP- oder PI-Taste, um das über diesen Kanal aufgenommene Bild anzuzeigen.

Drücken Sie dieselbe Taste erneut, um die Ebene aus der Anzeige zu entfernen oder um Ebenen zu überlagern, berühren Sie die Tasten, die jedem Kanal entsprechen, um zu identifizieren, wie die Zellen durch einen bestimmten Kanal gezählt werden. Touch-Kreise Die Zellen, die nur durch den Hellfeldkanal gezählt wurden und keine Fluoreszenz exprimieren, werden blau eingekreist. Dies bedeutet, dass es sich bei einer bestimmten Zelle um lebende Zellen handelt, die im grünen Kanal exprimieren.

GFP wird in grünen Zellen eingekreist, die im roten Kanal exprimieren. Mit Pi gefärbte Zellen werden rot eingekreist und sind tote Zellen, die in beiden gezählt werden. Der rote und der grüne Kanal werden gelb eingekreist.

Dies deutet darauf hin, dass die Zelle GFP exprimiert, aber auch mit Pi gefärbt ist und daher tot ist. Gelegentlich erscheint ein schwarzer Kreis auf dem Bildschirm. Dabei handelt es sich um Objekte, die zwar identifiziert, aber aufgrund der Zellgröße von der Analyse ausgeschlossen wurden.

Fahren Sie mit der Feinabstimmung des Schwellenwerts im Fluoreszenzhistogramm mit den gerade beschriebenen Schritten fort, bis jede Zelle, die Fluoreszenz exprimiert, mit der entsprechenden Farbe eingekreist ist. Alle Analyseparameter werden automatisch auf dem Gerät gespeichert. Unter dem Datenhahn.

Die Zählung kann Datendateien aus 500 Beispielläufen speichern. Jede Datei, die auf der Registerkarte "Daten" gespeichert ist, steht für eine erneute Analyse zur Verfügung. Wenn Sie die Datei auf der Registerkarte Daten auswählen, wird sie erneut geöffnet und alle Histogramme und Layer werden aktiv, um Daten zu archivieren und Berichte zu erstellen.

Die im Gerät gespeicherten Daten können mit einem USB-Laufwerk auf einen Computer übertragen werden. Vier repräsentative Zelltypen wurden mit einem GFP-Viruskonstrukt transduziert, das mit einem Tally-Viabilitätskit unter Verwendung eines roten Reagenzes für tote Zellen gefärbt und durch die Zählung in einem Durchflusszytometer analysiert wurde, wie hier gezeigt. Beide Methoden berichteten ungefähr den gleichen Prozentsatz der Population für jeden Zelltyp, der GFP exprimierte, zusammen mit dem Prozentsatz der Gesamtpopulation, der sowohl lebensfähig war als auch GFP exprimierte.

Diese Daten zeigen, dass das Tali-Zytometer in der Lage ist, zwischen der Gesamt-GFP-Expression in einer Population und der GFP-Expression in der lebenden Population zu unterscheiden. Wir haben gerade gezeigt, wie Sie das bildbasierte Tally-Zytometer zur Beurteilung der Fluoreszenzexpression und -viabilität in Ihrer Zellprobe verwenden können. Diese Technologie schließt die Lücke zwischen individuellen und populationsbasierten Zellstudien.

Mit dem bildbasierten Tally-Zytometer können Sie quantitative und qualitative visuelle Informationen über einzelne Zellen sowie größere Zellpopulationen sammeln. Unter Verwendung des gleichen Verfahrens können mehrere andere Assays durchgeführt werden, einschließlich Apoptose, RFP-Expression und Zellviabilität Für nicht exprimierende Zellen umfassen die potenziellen Anwendungen die Bewertung der Genexpression bis hin zu Studien zur Wirksamkeit von Arzneimitteln.