Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie die zeitgesteuerte Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) in einem automatisierten Multi-Well-Platten-Arbeitsablauf unter Verwendung von Open-Source-Software und grundlegenden Instrumenten implementiert werden kann. Diese Methodik kann auf FLIM-basierte Auslesungen in einer Reihe von festen oder lebenden Zellen angewendet werden. Und es ist besonders nützlich, um die Signalverarbeitung von Zellen oder Proteininteraktionen auszulesen.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass FLIM robuste quantitative Messwerte liefert und den Interaktionspopulationsanteil in einer einzigen Messung liefern kann. Durch die Anwendung globaler Analysetechniken auf Tausende von Zellen über Hunderte von Sichtfeldern können wir die Energieübertragung von Förderharzen oder FRET-Messwerten nutzen. Und unter Ausnutzung von beispielsweise Lebensdaueränderungen bis hin zu etwa 20 Pikosekunden.

Vorgehen mit Frederik Görlitz wird von Sunil Kumar, unserem wissenschaftlichen Mitarbeiter, und Ian Munro, unserem Softwareentwickler, vorgeführt. Starten Sie zunächst den Mikromanager und öffnen Sie das openFLIM-HCA-Plugin. Wählen Sie auf der Registerkarte FLIM-Steuerung die Option Kalibrierungsdatei für das Verzögerungsfeld aus und öffnen Sie die Kalibrierungsdateien.

Wählen Sie die Kalibrierungsdatei für die spezifische Kombination aus der gewünschten Verzögerungsgeneratoreinheit und der Laserwiederholrate aus. Wählen Sie im Dateimenü die Option Basisordner festlegen und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen. Nachdem Sie bestätigt haben, dass alle entsprechenden Parameter eingestellt wurden, stellen Sie manuell eine Gate-Breite von vier Nanosekunden an der Schaltbox des optischen Verstärkers für das gesamte Experiment ein.

Um Bilddaten der Instrumentenreaktionsfunktion zu erfassen, platzieren Sie manuell einen Strahlblock in der Filterwürfelkassette vor dem Objektiv, um das Entweichen von Laserlicht zu verhindern, und winkeln Sie den Strahlblock so an, dass jegliche Reflexion zurück in den Mikroskoprahmen minimiert wird. Stellen Sie auf der Registerkarte Lichtwegsteuerung die Anregungs-, dichroitischen und Emissionsfilter in der rotierenden Scheibeneinheit so ein, dass der Anteil des von der rotierenden Nipkow-Scheibe gestreuten Anregungslichts abgebildet werden kann, ohne das System für eine Kameraintegrationszeit von mindestens 200 Millisekunden zu sättigen. Verwenden Sie auf der Registerkarte FLIM-Steuerung die Funktion "Max-Punkt suchen" über den gesamten Bereich der Verzögerungen, die von der programmierbaren Schnellverzögerungsbox abgedeckt werden.

Überprüfen Sie dann den angezeigten Ausgabe-Trace. Und stellen Sie die Verzögerungszeiten so ein, dass das vollständige Ansprechverhalten des Instruments innerhalb des Scan-Bereichs der Fast-Delay-Box liegt. Passen Sie die Parameter für die Neutraldichte und die Belichtungszeit an.

Sowie die Bildakkumulation, so dass die Kamera nicht im Helligkeitszeit-Gate gesättigt ist und die effektive Integrationszeit nicht weniger als 200 Millisekunden beträgt. Wählen Sie im FLIM-Steuerungsmenü das Feld für die schnelle Verzögerung aus und stellen Sie 25 Pikosekunden-Verzögerungsschritte über den gesamten Verzögerungsbereich ein. Wählen Sie als Nächstes Verzögerungen ausfüllen und klicken Sie auf FLIM-Bild einrasten, um ein Bild der Instrumentenansprechfunktion zu erhalten.

Und warten Sie, bis die Erfassung abgeschlossen ist. Wählen Sie im Menü zur Lichtgangsteuerung die Option Neutraldichte und klicken Sie auf Blockiert, um den Laser zu blockieren. Öffnen Sie das FLIM-Steuerungsmenü und wählen Sie das Feld für schnelle Verzögerung, um die Anzahl der Verzögerungsschritte zu reduzieren, indem Sie den Wert im Inkrementfeld erhöhen.

Klicken Sie dann auf FLIM-Bild einrasten, um ein Hintergrundkamerabild zu erhalten. Um Referenzmatrizendaten zu erfassen, gehen Sie zur Registerkarte XYZ-Steuerung und geben Sie die H4-Vertiefung in das Dialogfeld Gehe zu Bohrung ein. Gehen Sie als Nächstes zur Registerkarte Lichtwegsteuerung und wählen Sie die entsprechenden Anregungs-, dichroitischen und Emissionsfilter aus, um das türkisfarbene fluoreszierende Protein M mit der Funktion "Max-Punkt finden" über den gesamten Bereich der Fast-Delay-Box abzubilden.

Stellen Sie dann die entsprechenden Parameter für die Erfassung der Referenzmatrizendaten und eines entsprechenden Hintergrundbildes ein, wie gerade gezeigt. Um die FLIM-Daten von einer Multi-Well-Plattenprobe zu erfassen, gehen Sie zum Setup-Menü für die sequenzielle HCA-Erfassung. Wählen Sie die Registerkarte XYZ-Positionen und legen Sie fest, welche Wells abgebildet werden sollen und wie viele Sichtfelder pro Well erfasst werden sollen.

Wählen Sie ein repräsentatives Sichtfeld aus, das die abzubildende Probe enthält, und stellen Sie den optimalen Neutraldichtefilter in der Integrationszeit der Kamera so ein, dass er 75 % des Dynamikbereichs der Auslesekamera erreicht. Wählen Sie auf der Registerkarte XYZ-Steuerung im Dialogfeld Autofokus die Option Rückfokussteuerung und fokussieren Sie das Mikroskop manuell auf die gewünschten Zellen oder Strukturen. Stellen Sie den Suchbereich für den Autofokus auf 2000 Mikrometer ein und drücken Sie die Eingabetaste.

Klicken Sie dann auf AF now, um den Autofokus zu starten. Ein Versatzwert wird im Feld für den Autofokus für den Fokusversatz angezeigt. Geben Sie diesen Versatzwert in das Fenster für den AF-Versatz ein und klicken Sie zweimal auf AF, um den Autofokus zu wiederholen.

Die Offset-Werte sollten nun auf Null gesetzt werden, was auf eine korrekte Funktion des Autofokussystems hinweist. Wählen Sie anschließend auf der Registerkarte FLIM-Steuerung die Autogating-Funktion aus, um eine logarithmische Abtastung der Verzögerungspunkte zu gewährleisten. Legen Sie die Akkumulations-Frames auf einen Wert fest, der die gewünschte Gesamtdatenerfassungszeit ergibt.

Klicken Sie dann im Dialogfeld FLIM-Erfassung auf die Schaltfläche HCA-Sequenz starten, um die FLIM-Multiwell-Plattenerfassung auszuführen und ein Hintergrundkamerabild wie gerade gezeigt zu erfassen. Hier wird ein repräsentativer FLIM-Fret-Assay unter Verwendung des Modellbundsystems gezeigt, das in Cocells und einer Multi-Well-Platte exprimiert wird, mit Beispielen für die automatisch aufgenommenen Fluoreszenzlebensdauerbilder typischer Sichtfelder, die in jedem Well sichtbar sind. In diesem Experiment wiesen die negativen Kontrollbohrungen die längsten Lebensdauern auf, und die Donorlebenszeiten wiesen die geringsten Bundkonstrukte mit den kürzesten Linkerlängen auf.

Insgesamt variierte die mittlere Lebensdauer, gemittelt über alle Sichtfelder in jeder Vertiefung, über die Multi-Well-Platten hinweg. Die Mittelung des Abklingprofils der Donorfluoreszenzintensität über alle Zellen, die in Vertiefung A1 abgebildet wurden, zusammen mit der Anpassung an ein monoexponentielles Zerfallsmodell und der Instrumentenreaktionsfunktion, zeigt, dass das Anpassungsmodell gültig ist. Eine weitere Analyse der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer für jede Säule der Multi-Well-Platte, die aus einer pixelweisen Mono-Exponentialanpassung gewonnen wurde, zeigt die Abnahme der Lebensdauer in den Bundkonstrukten mit kürzeren Linkerlängen und simuliert ein Experiment mit unterschiedlichen Bundeffizienzen.

In diesem Experiment wurden die FLIM-Daten eines Fret-Assays zur Wirkung verschiedener Inhibitoren auf die Proteinoligomerisierung mit einem einzigen exponentiellen Zerfallsmodell angepasst. Die Fluoreszenzlebensdauer-Plattenkarte zeigt die mittlere Lebensdauer pro Vertiefung, gemittelt über acht Sichtfelder. Ein kleiner Satz, der vier Sichtfelder pro Vertiefung abbildet, während unser FLIM-Assay in etwa zweieinhalb Stunden abgeschlossen werden kann, einschließlich der Zeit für die Erfassung der Instrumentenreaktionsfunktion, der Referenz-Die-Daten und der Durchführung der Analyse in FLIM-Fit.

Bei der Durchführung eines FLIM-Assays ist es wichtig, daran zu denken, die Ansprechfunktion des Geräts und die Referenz-Die-Daten zusammen mit ihren Hintergrundbildern zu erfassen, damit Sie alle Informationen haben, die Sie für die Analyse der FLIM-Daten benötigen. Mit unserer Open-Source-Software FLIM fit ist es auch möglich, diese Daten in komplexere Zerfallsmodelle einzupassen. Dies ermöglicht beispielsweise die Bestimmung des Anteils der Bundpopulation.

Unsere FLIM HCA-Technologie hilft Forschern in der Wirkstoffforschung, robuste Messungen des Bunds durchzuführen. Wir hoffen, dass diese Technologie in Zukunft die Messung von Dissoziationskonstanten in zellbasierten Assays ermöglichen wird. Wir hoffen, dass dieses Videopaper, ebenso wie die Informationen in unserem Wiki, anderen Forschern helfen wird, ihre eigenen FLIM HCA-Instrumente zu bauen und sie auf Bünde und andere Assays anzuwenden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern gefährlich sein kann und dass bei der Verwendung solcher Instrumente immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Einschließen aller Laserstrahlen.