Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie die zeitaufgelöste Fluoreszenzlebensdauermikroskopie, oder FLIM, in einem automatisierten Workflow für Mehrfach-Well-Platten unter Verwendung von Open-Source-Software und grundlegender Instrumentierung implementiert werden kann. Diese Methodik kann auf FLIM-basierte Messungen in einer Reihe von fixierten oder lebenden Zellen angewendet werden. Sie ist besonders nützlich zur Erfassung von zellulären Signalverarbeitungsprozessen oder Proteinwechselwirkungen.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die FLIM quantitative, robuste Messwerte liefert und in einer einzigen Messung die Interaktionsanteile der Population ermitteln kann. Durch die Anwendung globaler Analyseverfahren auf Tausende von Zellen über Hunderte von Bildfeldern hinweg können wir die Förster-Resonanzenergieübertragung oder FRET-Messwerte nutzen. Außerdem können wir beispielsweise Veränderungen der Lebensdauer bis hinunter zu etwa 20 Pikosekunden auswerten.

Den Ablauf demonstrieren gemeinsam mit Frederik Gorlitz Sunil Kumar, unser wissenschaftlicher Mitarbeiter, und Ian Munro, unser Softwareentwickler. Starten Sie zunächst Micromanager und öffnen Sie das openFLIM-HCA-Plugin. Wählen Sie im Reiter FLIM-Kontrolle die Verzögerungsbox-Kalibrierungsdatei aus und öffnen Sie die Kalibrierungsdateien.

Wählen Sie die Kalibrierungsdatei für die spezifische Kombination aus Verzögerungsgenerator und gewünschter Laserwiederholungsrate aus. Wählen Sie im Dateimenü „Basisordner festlegen“ und anschließend den Ordner, in dem die Daten gespeichert werden sollen. Nachdem bestätigt wurde, dass alle geeigneten Parameter eingestellt sind, stellen Sie manuell eine Gatterbreite von vier Nanosekunden an der Steuerbox des getakteten optischen Verstärkers für die gesamte Dauer des Experiments ein.

Um die Daten der Instrumenten-Antwortfunktion zu gewinnen, platzieren Sie manuell einen Strahlblock im Filterkassettenhalter vor dem Objektiv, um das Austreten von Laserlicht zu verhindern, und richten Sie den Strahlblock so aus, dass Reflexionen in das Mikroskopgehäuse minimiert werden. Gehen Sie im Lichtpfad-Steuerungsfenster zu den Anregungs-, Dichroic- und Emissionsfiltern in der Drehscheibeneinheit und stellen Sie diese so ein, dass der Anteil des Streulichts der Anregung, der von der rotierenden Nipkow-Scheibe ausgeht, ohne das System zu übersteuern, für eine Mindestbelichtungszeit der Kamera von 200 Millisekunden abgebildet werden kann. Gehen Sie im FLIM-Steuerungsfenster zur Funktion „Maximalpunkt finden“ und wenden Sie sie über den gesamten Bereich der Verzögerungen an, die vom programmierbaren schnellen Verzögerungsmodul abgedeckt werden.

Überprüfen Sie dann die angezeigte Ausgabespur. Stellen Sie die Verzögerungszeiten so ein, dass das vollständige Profil der Instrumenten-Antwortfunktion innerhalb des Abtastbereichs der schnellen Verzögerungseinheit liegt. Passen Sie die Parameter für die Neutrale Dichte und die Belichtungszeit an.

Neben der Frame-Akkumulation muss sichergestellt werden, dass die Kamera im Helligkeitszeitfenster nicht gesättigt ist und die effektive Integrationszeit nicht unter 200 Millisekunden liegt. Wählen Sie im FLIM-Steuerungsmenü das Feld „schnelle Verzögerung“ aus und stellen Sie 25 Pikosekunden große Verzögerungsschritte über den gesamten Verzögerungsbereich ein. Danach wählen Sie „Verzögerungen füllen“ aus und klicken auf „FLIM-Bild aufnehmen“, um ein Instrumenten-Antwortfunktionsbild zu erfassen.

Warten Sie, bis die Aufnahme abgeschlossen ist. Wählen Sie im Menü zur Lichtpfadsteuerung Neutraldichte aus und klicken Sie auf „Gesperrt“, um den Laser zu blockieren. Öffnen Sie das FLIM-Steuerungsmenü und wählen Sie das Feld für schnelle Verzögerung, um die Anzahl der Verzögerungsschritte zu verringern, indem Sie den Wert im Feld „Inkrement“ erhöhen.

Klicken Sie dann auf „Snap FLIM Image“, um ein Hintergrundkamerabild aufzunehmen. Um Referenzdaten des Farbstoffs zu erhalten, wechseln Sie zum XYZ-Steuerungs-Tab und geben Sie die H4-Vertiefung im „Go to Well“-Dialogfeld ein. Gehen Sie anschließend zum Lichtpfad-Steuerungs-Tab und wählen Sie die geeigneten Anregungs-, Dichroic- und Emissionsfilter zur Abbildung des M-Turquoise-Fluoreszenzproteins unter Verwendung der Funktion „Find Max Point“ über den gesamten Bereich des Fast-Delay-Reglers aus.

Danach die geeigneten Parameter zur Erfassung der Referenz-Die-Daten und eines entsprechenden Hintergrundbilds einstellen, wie gerade gezeigt. Um die FLIM-Daten von einer Mehrfach-Well-Plattenprobe zu erfassen, zum Einrichtungsmenü für sequenzielle HCA-Aufnahmen wechseln. Den Reiter XYZ-Positionen auswählen und festlegen, welche Wells abgebildet werden sollen und wie viele Bildfelder pro Well erfasst werden sollen.

Wählen Sie ein repräsentatives Sichtfeld aus, das die zu bildgebende Probe enthält, und stellen Sie den optimalen Neutraldichtefilter sowie die Belichtungszeit der Kamera so ein, dass 75 % des dynamischen Bereichs der Auslesungskamera erreicht werden. Wählen Sie unter der Registerkarte XYZ-Steuerung im Dialogfeld zur Autofokusfunktion die Option „Fokus zurücksetzen“ und fokussieren Sie das Mikroskop manuell auf die Zellen oder Strukturen von Interesse. Stellen Sie den Suchbereich für den Autofokus auf 2000 Mikrometer ein und drücken Sie die Eingabetaste.

Klicken Sie dann auf AF, um den Autofokusvorgang zu starten. Ein Offset-Wert wird im Feld Fokus-Offset-Autofokus angezeigt. Geben Sie diesen Offset-Wert im AF-Offset-Fenster ein und klicken Sie zweimal auf AF, um den Autofokusvorgang zu wiederholen.

Die Offset-Werte sollten nun auf Null gesetzt sein, was auf eine korrekte Funktion des Autofokussystems hinweist. Wählen Sie als Nächstes im FLIM-Steuerungsfenster die Autogating-Funktion aus, um eine logarithmische Abtastung der Verzögerungszeitpunkte sicherzustellen. Stellen Sie die Anzahl der Akkumulationsframes auf einen Wert ein, der die gewünschte Gesamtdauer der Datenaufnahme ergibt.

Danach im FLIM-Aufnahmedialogfeld die Schaltfläche „Start HCA-Sequenz“ klicken, um die FLIM-Mehrfach-Well-Platten-Aufnahme durchzuführen und ein Hintergrundkamerabild aufzunehmen, wie gerade gezeigt. Hier ist ein repräsentativer FLIM-FRET-Assay unter Verwendung des Modell-FRET-Systems dargestellt, das in Co-Zellen und einer Mehrfach-Well-Platte exprimiert wurde, zusammen mit Beispielen der automatisch aufgenommenen Fluoreszenzlebensdauer-Bilder typischer Sichtfelder, die in jedem Well sichtbar sind. In diesem Experiment wiesen die Negativkontroll-Well die längsten Lebensdauern auf, und die Donor-Lebensdauern zeigten die niedrigsten FRET-Konstrukte mit den kürzesten Linkerlängen.

Insgesamt variierte die über alle Beobachtungsfelder in jeder Vertiefung gemittelte mittlere Lebensdauer über die Mehrfach-Vertiefplatten hinweg. Die Mittelung des Donor-Fluoreszenzintensitätsabklingprofils über alle in der Vertiefung A1 abgebildeten Zellen zusammen mit der Anpassung an ein monoexponentielles Abklingmodell und der instrumentellen Antwortfunktion veranschaulicht, dass das Anpassungsmodell gültig ist. Eine weitere Analyse der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer für jede Spalte der Mehrfach-Vertiefplatte, erhalten aus einer pixelweisen monoexponentiellen Anpassung, zeigt, dass die Lebensdauer bei FRET-Konstrukten mit kürzeren Linkerlängen abnimmt, was einem Experiment mit unterschiedlichen FRET-Effizienzen entspricht.

In diesem Experiment wurden die FLIM-Daten eines FRET-Assays zur Wirkung verschiedener Inhibitoren auf die Protein-Oligomerisierung mit einem einfachen exponentiellen Abklingmodell angepasst. Die Fluoreszenzlebensdauern-Plattenkarte veranschaulicht die mittlere Lebensdauer pro Mulde, gemittelt über acht Bildfelder. Eine kleine Versuchsreihe bildet vier Bildfelder pro Mulde ab, während unser FLIM-Assay in etwa zweieinhalb Stunden abgeschlossen sein kann, einschließlich der Zeit zur Aufnahme der Instrumenten-Antwortfunktion, der Referenz-Dye-Daten und der Durchführung der Analyse in FLIM fit.

Bei der Durchführung eines FLIM-Assays ist es wichtig, die Instrumentenantwortfunktion und die Referenzdie-Daten zusammen mit ihren Hintergrundbildern aufzunehmen, um alle notwendigen Informationen zur Analyse der FLIM-Daten zu besitzen. Mithilfe unserer Open-Source-Software FLIM fit ist es außerdem möglich, diese Daten an komplexere Abklingmodelle anzupassen. Beispielsweise kann dadurch der FRET-Populationsanteil bestimmt werden.

Unsere FLIM-HCA-Technologie hilft Forschern in der Arzneimittelforschung, robuste Messungen von FRET durchzuführen. In Zukunft hoffen wir, dass diese Technologie es ermöglichen wird, Dissoziationskonstanten in zellbasierten Assays zu messen. Wir hoffen auch, dass dieses Video-Paper sowie die Informationen in unserem Wiki anderen Forschern helfen werden, ihre eigene FLIM-HCA-Ausrüstung aufzubauen und sie für FRET sowie andere Assays anzuwenden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Abschirmung aller Laserstrahlen getroffen werden sollten, wenn solche Geräte verwendet werden.