Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, dynamische Prozesse in lebenden Drosophila-U-Stellen aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst intakte Ovarien aus gut genährten zweitägigen weiblichen Fliegen isoliert werden. Als zweiter Schritt werden einzelne Follikel aus den Ovarien entnommen, um die Eikammern abzubilden.

Wenn sie ein geeignetes fluoreszierendes Protein exprimieren, können einzelne Eikammern entweder direkt abgebildet oder weiteren Manipulationen unterzogen werden, wie beispielsweise der Mikroinjektion fluoreszierender Marker vor der Bildaufnahme. Letztendlich können durch die Analyse der Filmsequenzen die dynamischen Wechselwirkungen intrazellulärer Komponenten aufgezeigt werden. Diese Methode hat uns geholfen, einige zentrale Fragen auf dem Gebiet des RNA-Transports und der lokalisierten Translation zu beantworten.

Beispielsweise, wie wird die Expression von Proteinen, die den Körperplan anlegen, in Zeit und Raum in der lebenden Beobachtung reguliert? Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie erhebliche Schnelligkeit und Geschicklichkeit erfordert. Beide Übung, bessere Ergebnisse werden erzielt.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Handhabung der Eikammern schwer allein durch Text zu vermitteln ist und da technische Erfahrung und sichere Handgriffe erforderlich sind. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einen kleinen Tropfen Halocarbon-Öl auf einen Deckglas geben und beiseitelegen. Anschließend betäuben Sie die vorbereiteten Fliegen mit Kohlendioxid.

Verwenden Sie eine scharfe Feinnasenzange, um eine fette weibliche Fliege am vorderen Abdomen zu fassen. Fassen Sie nicht in der Mitte des Abdomens zu. Halten Sie das Weibchen etwa zwei bis drei Zentimeter über die vorbereitete Deckglasplatte.

Entfernen Sie mit einem zweiten Paar Pinzetten das Gewebe am äußersten Hinterende des Weibchens. Dies beinhaltet normalerweise Darmgewebe, das mit sauberen Pinzetten entfernt wird. Massieren Sie vorsichtig den Hinterleib vom vorderen zum hinteren Ende, ähnlich wie man Zahnpasta aus einer Tube drückt.

Die Eierstöcke sehen aus wie große undurchsichtige Strukturen und bleiben an der Spitze der Pinzette haften. Sammeln Sie die Eierstöcke, indem Sie sie mit dem Kohlenstofföl-Halo auf dem Objektträger berühren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis vier bis sechs Eierstöcke gesammelt sind.

Vor der Isolierung der Antennen. Stellen Sie die Lichtquelle am Mikroskop so ein, dass die Beleuchtung den Objektträger in flachem Winkel trifft und kontrastreiche Schatten auf dem Gewebe erzeugt. Bei der Dissektion der Fliegen ist es sehr wichtig, die richtigen Werkzeuge zu verwenden.

Der Zeiger, den wir verwenden, ist nicht zu scharf, sodass er das Gewebe beschädigt, sondern ziemlich stumpf, damit wir die Pinzette, die wir benutzen, greifen können. Auch diese sollte nicht zu scharf sein, um das Gewebe nicht zu verletzen, aber gerade scharf genug, um Objekte manipulieren zu können, ohne das Werkzeug zu verbiegen. Es ist außerdem sehr wichtig, saubere Instrumente zu haben, weshalb wir sie während des gesamten Verfahrens regelmäßig mit geschlossenen Pinzetten reinigen.

Trennen Sie die beiden Ovarien, indem Sie das verbindende Gewebe am hinteren Ende entfernen. Am hinteren Ende befinden sich die am weitesten entwickelten Eikammern. Richten Sie ein Ovarium horizontal aus, wobei die jüngsten Eikammern in Richtung Ihrer dominanten Hand zeigen.

Dann greifen Sie vorsichtig das hintere Ende am verbleibenden Bindegewebe und verwenden Sie eine feine Nadel aus Platin oder Wolfram, um einzelne Ovarialläppchen von Stadium Jamar bis Stadium 10 herauszulösen, die sich voneinander trennen lassen; ältere Ovarialläppchen verbleiben jedoch mit dem Eierstock verbunden. Ziehen Sie mit der Nadel vorsichtig 15 bis 25 getrennte Ovarialläppchen in die Mitte des Öltropfens. Falls mehr als ein Eierstock disseziert werden muss, wählen Sie einen von einer anderen Fliege.

Entfernen Sie überschüssiges Ovarialgewebe und arbeiten Sie schnell, da die Zellen aufgrund von Stress beginnen, phänotypische Veränderungen aufzuweisen. Nach 40 Minuten, seitdem sie aus dem Eierstock isoliert wurden, entfernen Sie das überschüssige Ovarialgewebe aus dem Öl. Verwenden Sie saubere Instrumente für die Injektion von Zellen im mittleren Stadium und richten Sie die Arealen senkrecht zur langen Achse des Deckgläschens aus, um Eikammern im späten Stadium zu isolieren.

Eine andere Methode ist erforderlich, um das hintere Ende des Ovars, wie zuvor beschrieben, zu fassen. Führen Sie die Präpariernadel in das hintere Ende des Ovars in der Nähe der Pinzette ein. Um zu vermeiden, dass die Eikammern durchstochen werden, führen Sie die Nadel zwischen den Eikammern im späten Entwicklungsstadium ein.

Ziehen Sie die Präpariernadel durch die Ovarien, bis sie an den Eiern früher Entwicklungsstadien austritt. Wenn der Vorgang korrekt durchgeführt wird, löst die Sonde das Bindegewebe, das die Zellen früher Stadien und die Eiern später Stadien fixiert. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Zellen früher Stadien auf dem Deckglas verteilt sind.

Wenn die Eikammern nicht mehr übereinander gestapelt sind, ist dieser Schritt abgeschlossen. Trennen Sie mit einer Präpariernadel die Eikammern des späten Stadiums, um die Bildgebung der Positionierung der Stadien 14 zu erleichtern. Bei den Halskammern verwenden Sie Pinzetten, um ihre dorsalen Anhänge zu fassen.

Bereiten Sie die zu injizierenden Lösungen vor, indem Sie die Mutt kurz mit hoher Geschwindigkeit zentrifugieren. Dadurch werden feste Ablagerungen als Pellet abgetrennt, die die Injektionsnadel verstopfen könnten. Laden Sie anschließend die Injektionsnadel mit einer Ladespitze und befestigen Sie die geladene Injektionsnadel vorsichtig am Injektor.

Platzieren Sie nun ein kleines Glasstück neben die Proben und befestigen Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch. Das Glas dient als Wand, um zu brechen oder zu entkoppeln. Ziehen Sie die Nadel heraus.

Bereiten Sie das Mikroskop und die Injektionsvorrichtung für das Experiment vor. Achten Sie darauf, die Nadelspitze nicht zu beschädigen. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen automatisierten Probentisch mit Punkteanfahrfunktion, um alle Zellen des achten und neunten Stadiums für die Injektion zu markieren.

Senken Sie nun die Injektionsnadel ab, bis sie das Öl berührt. Wählen Sie den ersten Punkt aus der Liste der markierten Punkte aus und fokussieren Sie auf den Cyten. Senken Sie die Nadel manuell ab, bis sie sich in derselben Fokusebene wie der Cyt befindet.

Verwenden Sie die Steuerelemente des Manipulators, um die Spitze der Injektionsnadel so zu bewegen, dass sie sich innerhalb der U-Stelle befindet. Oft ist eine schnelle Stichbewegung erfolgreicher als eine langsame. Sobald die Nadel im Inneren ist, spritzen Sie ein kleines Volumen aus der Nadel aus und bewerten Sie die Auswirkungen visuell.

Wiederholung ist erforderlich. Wenn die Injektion erfolgreich ist, wird das Cytoplasma innerhalb der Zelle verdrängt. Die genaue Menge der injizierten Flüssigkeit ist schwer zu quantifizieren.

Um das injizierte Volumen zu erhöhen, passen Sie entweder den Druck oder die Dauer des Injektionsimpulses an. Brechen Sie die Nadelspitze leicht ab, um die Nadelöffnung geringfügig zu vergrößern, oder verwenden Sie einfach mehrere Injektionsimpulse, bevor Sie den nächsten Cyt auswählen. Heben Sie die Injektionsnadel so weit in das Öl an, dass sie nicht mit anderen Cyten kollidiert.

Umfangreiches Einstechen oder längeres Verweilen der Nadel im Cytoplasma schädigt die Eizelle erheblich. Arbeiten Sie daher schnell. Die Injektion sollte weniger als 10 Sekunden dauern.

Wenn ein Fehler gemacht wird, bewegen Sie sich zur nächsten Markierung an eine Stelle. Verschwenden Sie keine Zeit an beschädigten Stellen. Wenn die Nadel verstopft ist, bewegen Sie die Nadel zu dem gebrochenen Glasstück.

Bringen Sie die Nadel vorsichtig in die gleiche Fokusebene wie das Glas und stoßen Sie sie sanft in das Glas hinein. Prüfen Sie, ob die Nadel frei ist, indem Sie den Injektionsknopf drücken und beobachten, ob Flüssigkeit aus der Nadelspitze austritt. Sobald alle US-Standorte injiziert wurden, bewegen Sie die Nadel manuell aus dem Öl heraus und positionieren Sie sie außerhalb des Strahlengangs des Mikroskops.

Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung sicher ist, um Augenschäden zu vermeiden, und schalten Sie die Lichter aus. Um die Geschwindigkeit der Fluoreszenzbildgebung zu erhöhen, ist dies zwingend erforderlich. Wenn zwischen der Isolierung der Eikammer und der Cyteninjektion eine Stunde oder länger vergangen ist, lassen sich die Cyten schwer injizieren und zeigen phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit Stress.

Ähnliche Probleme können bei unsachgemäßer Handhabung der Zelle oder Injektion von überschüssigen Volumina auftreten. Eikammern, die transgene fluoreszierende Proteine exprimieren, können ohne Injektion abgebildet werden. Die MS2-Markierung endogener RNA kann mit guten Ergebnissen mithilfe der Gewebegewinnungsverfahren unter Verwendung des vollständigen in vitro synthetisierten Verfahrens abgebildet werden.

Alexa, 5 46 kin, RNA wurde in eine ME 31 BGFP Eizelle injiziert, wobei sich die RNA im dorsal-anterioren Bereich der Zelle lokalisierte und eine Kappe um den Zellkern bildete. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von etwa 10 Minuten – von der Präparation bis zum Beginn der Bildaufnahme – durchgeführt werden. Achten Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens darauf, das Gewebe schnell, aber sorgfältig zu behandeln. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dynamische Prozesse in lebenden Drosophila-Zellen aufgezeichnet werden können.