Name: Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Lernen Sie die Präparation einzelner Drosophila-Eikammern für Live-Imaging zur Untersuchung der mRNA-Lokalisierung. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung dynamischer Prozesse in lebendem Gewebe.

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Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Senior Research Fellowship an I. Davis unterstützt.

1. Drosophila Vorbereitung vor für die Dissektion (nach E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Entsorgen Sie die Erwachsenen von einer spärlich gesät Flasche und übertragen Sie die Flasche bis 25 ° C im Vorfeld des Experiments. Sobald neue Erwachsenen begonnen haben, zu entstehen, zwei Tage warten. </li><li> Nehmen Sie ein Fläschchen mit Fliege ca. 10ml von fester Nahrung und fügen 0,5-0,7 Gramm Trockenhefe (siehe Tabelle) auf einem 45 Grad Winkel. Bedecken Sie nicht die ganze Oberfläche der Fliege Essen mit Hefe. </li><li> Fügen Sie einige Tropfen von Wasser auf die Hefe, die ausreicht, um Hydrat (Abbildung 1A). Stellen Sie die Durchstechflasche bei 45 Grad und lassen Sie ca. 3 Minuten für die Hefe, um das Wasser aufzusaugen (Abbildung 1B). </li></ol> Hinweis: Alternativ Vormischung eine Hefe in einem separaten Behälter Paste zermahlen und die Paste in das Fläschchen mit einem Spatel. <ol start="4"><li> Betäuben die Fliegen in der Ampulle durch Injizieren von CO 2-Gas. Wenn sie aufhören zu bewegen, kippen die unbewussten Fliegen auf den CO 2 </sub&gt; Fly-Pad für die Sortierung (Abbildung 1C). </li><li> Isolieren 10-15 Frauen und 5 Männer des gewünschten Genotyps unter einem Binokular mit einer feinen Spitze Pinsel (Abbildung 1D). Männer sind offensichtlich durch die Anwesenheit von claspers, eine dunkle hervorstehenden Struktur, an ihren hinteren. </li><li> Fügen Sie ausgewählt fliegt in die Hefekuchen mit Fläschchen (1E). Platz bei 25 ° C für 24-60 Stunden. Inkubieren Sie für kürzere Zeiträume für eine größere Prozent der jungen bis mittleren Stadium Ei Kammern und längere Zeiträume für Spätstadium Eikammern. </li></ol> 2. Drosophila Ovar Dissektion <ol><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen auf einem Halocarbonöl Nr. 1.5, 22 x 50 mm Deckglas (Abbildung 2A). Stellen Sie die vorbereitete Deckglas der Seite, wo es nicht im Weg sein. </li><li> Betäuben die Fliegen in der Hefekuchen mit abscheulichen durch Injektion von CO 2-Gas und Spitze auf eine CO 2-Pad. </li><li> Scharfe feine Nase Zange zu greifen eine individuelle gemästet am Vorderrand des Bauches weiblich (nicht zwischen the Abdomen und Thorax) (2B-C). </li><li> Halten Sie das Weibchen mit der Zange und sehen unter einem Binokular, etwa 2-3 cm oberhalb der vorbereitete Deckglas. </li><li> Noch Halten auf der vorderen, mit einem zweiten Satz von Zangen, um das Gewebe am äußersten hinteren Ende des weiblichen (2D) zu entfernen. Hinweis: Darmgewebe wird in der Regel ziehen Sie mit dem hinteren Ende. Wischen Sie die entnommene Gewebe aus der Zange. </li><li> Während Sie noch die der weiblichen an der vorderen, verwenden Sie die Zange abgewischt, um sanft drücken oder massieren den Bauch, arbeitet vom vorderen zum hinteren. Massieren das Abdomen in der gleichen Weise wie das Entfernen Zahnpasta aus dem Ende einer Röhre. </li><li> Zwei große opake Strukturen aus dem Bauch und Stick auf dem Ende der Zange (2E-F) geschoben werden kann. Dies sind die gepaarten Eierstöcke. </li><li> Tippen Sie auf die Eierstöcke auf die Halocarbonöl auf der Folie unten. </li><li> Wiederholen Sie die Dissektion 1-2 Mal um insgesamt 6.4 Eierstöcke im Öl auf dem Deckglas geben (Figure 2G). </li></ol> 3. Isolating Ovariolen Hinweis: Jeder Eierstock enthält ca. 16 bis Ovariolen mit 6 bis 10 Eikammern der verschiedenen Stufen, wie Perlen auf einer Schnur 10 angeordnet hat. Hinweis: Vor der Isolierung der Ovariolen, passen Sie die Lichtquelle auf der Seziermikroskop so dass das Licht angestrahlt in einem flachen Winkel auf die Probe. Man erhält Gegensatz zu der Probe und erlaubt die Visualisierung der jungen Stadium Eikammern. <ol><li> In der Öl-, trennen Sie die beiden Eierstöcke durch Entfernen des Bindegewebes am hinteren Ende (alte Stufen) mit geschlossener Zange (Abbildung 3A). </li><li> Orient eine individuelle Eierstock mit der ältesten Bühnen zur linken und jüngste Stufe nach rechts. Die junge Bühne Eikammern im Eierstock sind transparent und bilden die mehr spitze Ende des Eierstocks. </li><li> Mit einer Pinzette in der dominanten Hand, sanft fassen Sie den hinteren eines Eierstocks, vorzugsweise durch den Überresten the Bindegewebe. Halten Sie den Eierstock an Ort und Stelle mit der Zange, verwenden Sie ein Sezieren Sonde (oder Wolfram-Nadel), um herauszuarbeiten, individuelle Ovariolen (3B-D). </li></ol> Hinweis: Einzelne Ovariolen wird zwischen den jungen Stadien (Germarium bis 10-Stadium) zu brechen, wie die älteren Stadien zu groß, um aus der vollständigen Eierstock getrennt werden sollen. Hinweis: Punktieren einer späten Phase Eizelle mit dem Sezieren Sonde wird im Zytoplasma in das auslaufende Öl führen und das Herauslösen einzelner Ovariolen sehr anspruchsvoll. Wenn ein Spätstadium Eizelle punktiert wird, zu einem frischen Eierstock bewegen. <ol start="4"><li> Sobald die Ovariole ist frei von dem Eierstock, verwenden Sie die Sonde sezieren, um es im Zentrum der Öltropfen und Orient in der gewünschten Orientierung für das Experiment ziehen. Hinweis: Ovariolen in Öl absetzen und sich an das Glas. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang (3,3-3,4), bis es 15 bis 25 einzelnen Ovariolen sind. Hinweis: Dies kann die Dissektion der MULTIP erfordernle Eierstöcke. Der ganze Vorgang sollte weniger als 15 Minuten. </li></ol> Hinweis: Es ist ratsam, einen Eierstock jeweils aus mehreren Fliegen anstatt Sezieren beide Eierstöcke von weniger Fliegen, um die n Anzahl der Fliegen für das Experiment zu erhöhen sezieren. Hinweis: Durch eine grobe Behandlung der Ovariole wird in ungesunden Eizellen führen und kann zu Artefakten im Experiment führen. Hinweis: Die Oocyten beginnt phänotypische Veränderungen aufgrund bis 40 Minuten nach dem aus dem Eierstock (vergleiche 7E bis F) seziert betonen anzuzeigen. <ol start="6"><li> Sobald Ovariolen in einer angemessenen Orientierung (Abbildung 3E) sind, verwenden Sie das Sezieren Sonde und geschlossenen Pinzette, um überschüssige Eierstockgewebe um aus dem Öl. Dieses Material kann von der Zange auf ein Papiertuch abgewischt werden. </li></ol> 4. Isolierung einzelner späten Stadium Ei Kammern (Nach E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Mit einer Pinzette in der Dominant der Hand, fassen Sie die hinteren eines isolierten Eierstock, vorzugsweise von den Resten des Bindegewebes. Halten Sie den Eierstock an Ort und Stelle mit der Zange, führen das Sezieren Sonde in das hintere Ende des Eierstocks in der Nähe der Zange (Abbildung 4A). Vermeiden Sie jegliche Punktierung Ei Kammern, die durch Einführen der Sonde zwischen späten Stadium Ei Kammern. </li><li> Ziehen Sie die Nadel durch das Sezieren Eierstock bis zum Austritt in einem frühen Stadium Ei Kammern (Abbildung 4B). Wenn es richtig gemacht, wird die Sonde entfernen Sie das Bindegewebe hält die Ovariolen und Spätstadium Eikammern an Ort und Stelle. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4,2, bis die Ovariolen auf dem Deckglas verteilt sind. Hinweis: Bei der Ei-Kammern nicht mehr auf übereinander gestapelt werden, ist dieser Schritt abgeschlossen. </li><li> Mit dem Sezieren Sonde, trennen Sie die Eizellen zu spät für eine einfache Bildgebung (4C) zu ermöglichen. </li></ol> Hinweis: Eine Punktion eine Eizelle während Sezieren späten Stadium Ei Kammern ist nicht so verurteilen, wie ich mit SezierenNDIVIDUELLE Ovariolen für jüngere Stadien. Hinweis: Bei Stufe 14 Eikammern, verwenden Sie die Zange, um die dorsalen Anhänge zur Orientierung zu erfassen. 5. Injektionspräparat Hinweis: Für die Injektion von Oozyten Mitte der Bühne, orientieren die Ovariolen senkrecht zur Längsachse des Deckglases. <ol><li> Schalten Sie den Imaging-Mikroskop [in unserem Fall eine DeltaVision Core von Applied Precision] und laden Sie die entsprechenden Einstellungen Bildgebung (5A-B). </li><li> Schalten des Injektionsgeräts (5C). </li><li> Laden Sie die Injektionsnadel mit Ladetipp (5D-E). Lösungen, die injiziert werden sollte kurz bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert werden, um Ablagerungen, die die Injektionsnadel blockieren könnten zu vermeiden. </li><li> Bringen Sie den geladenen Injektionsnadel in den Injektor. Achten Sie darauf, um nicht zu unterbrechen Sie die Nadel (5F). </li><li> Um mit dem Mähwerk Nadeln zu unterstützen, setzen Sie ein kleines Stück Glas aus einem 2x10 mm geschnitten oder gebrochen Deckglas einert eine Seite der Öltropfen mit den Ovariolen. Stellen Sie sicher, dieses Glas-Fragment in Öl bedeckt ist. Dieses Glas wird zu rammen die Nadelspitze gegen dienen zum Brechen von dem Mähwerk oder die Nadel. </li></ol> 6. Die Injektion von fluoreszierenden RNA Bevor Sie beginnen: Stellen Sie die Einspritzvorrichtung und Mikro-Manipulator Kontrollen, so dass die Injektionsnadel über der Mitte des Sichtfeldes positioniert ist. <ol><li> Montieren Sie die Probe, um auf dem Mikroskoptisch injiziert werden. </li><li> Wählen Sie das 20x-Objektiv. Höhere oder niedrigere Vergrößerung Ziele können ebenfalls verwendet werden. </li></ol> Hinweis: Bei Verwendung eines automatisierten Bühne mit Punkt Besuch Fähigkeit ist es ratsam, alle von der Bühne 8-9 Oozyten für die Injektion vor Beginn markieren. Dies ermöglicht eine einfache und besuchen Injektion von ausgewählten Oozyten. <ol start="3"><li> Senken Sie die Injektionsnadel bis sie das Öl berührt. Zentrieren Sie die Nadelspitze über dem Objektiv. </li><li> Drehenabseits der Raumbeleuchtung und schalten Sie das Hellfeld-Licht für das Mikroskop. Wählen Sie den ersten Punkt (Eizelle) auf der Liste markierten Punkten. Beim Blick durch die Okulare, auf die Eizelle (Abbildung 6A) zu konzentrieren. </li><li> Senken Sie die Nadel manuell, bis sie in der gleichen Ebene wie der Fokus der Eizelle und sichtbar neben der Eizelle ist. </li><li> Mit den Manipulator, bewegen Sie den Punkt der Injektionsnadel, bis es im Inneren der Eizelle ist. Eine schnelle stechende Bewegung ist oft erfolgreicher als einen langsamen Fortschritt. Einmal drinnen, Auswerfen eines kleinen Volumens von der Nadel und visuell beurteilen die Auswirkungen, je nach Bedarf wiederholen. Wenn die Injektion erfolgreich ist, wird das Zytoplasma der Eizelle im Inneren verdrängt werden, wenn dies nicht offensichtlich, wiederholen. Es ist nicht notwendig, um Bild der Fluoreszenz um festzustellen, ob Material eingespritzt wurde. Nach der Injektion entfernen Sie die Nadel aus dem Inneren der Eizelle (6B-G). </li><li> Die genaue Menge an Flüssigkeit eingespritzt wird, schwierig zu quantifizieren. Um das injizierte Volumen, einstellbar erhöhenst der Druck-oder Zeitpunkt der Injektion Puls, brechen Sie die Nadelspitze, um die Öffnung leicht erhöhen oder benutzen Sie wiederholte Injektion Impulse. </li></ol> Hinweis: Der gesamte Prozess sollte Injektion weniger als 10 Sekunden dauern, wenn richtig ausgeführt. Umfangreiche stechender oder Verweilen mit der Nadel im Inneren zu Eizelle führt zu schweren Schäden an der Ei Kammer führen. <ol start="8"><li> Vor der Auswahl des nächsten markierten Oozyte, erhöhen die Injektionsnadel hoch genug in dem Öl, um nicht anderen Oozyten in dem Transportweg zu kontaktieren. </li><li> Am neuen Eizelle, wiederholen Sie Schritt 6.6. Fahren Sie auf diese Weise, bis alle benötigten Eizellen injiziert werden. </li></ol> Hinweis: Wenn ein Fehler gemacht wird während der Injektion mit dem nächsten markiert Eizelle zu bewegen. Verschwenden Sie keine Zeit auf beschädigten Eizellen. Hinweis: Die Nadel kann verstopft werden während einer Injektion Sitzung. In diesem Fall verschieben Sie die Nadel neben dem zerbrochenen Stück Glas in der Öl-auf dem Deckglas. Witzh das Glas und die Nadel in der gleichen Bildebene, sanft rammen die Nadel in das Glas (Abb. 6H). Testen Sie, dass die Nadel, indem Sie den Injektionsknopf und zu sehen, wenn eine Flüssigkeit verlässt die Spitze der Nadel ist verstopft. <ol start="10"><li> Wenn alle Eizellen injiziert wurden, manuell verschieben Sie die Nadel auf, aus dem Öl und richten Sie ihn aus dem Strahlengang für das Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass es an einem sicheren Orientierung ist, um Augenschäden zu vermeiden. </li></ol> Hinweis: Wenn eine erweiterte Zeitspanne zwischen Eikammer Isolierung und Oocyteninjektion verstrichen ist, wird es schwierig Oozyten zu injizieren und phänotypischen Veränderungen aufweisen mit Stress verbunden. Ähnliche Probleme können bei grober Handhabung der Eizelle oder Injektion von überschüssigen Mengen (vergleiche die Abbildungen 6I, J, K) ergeben. 7. Live-Imaging-experimentelles Design <ol><li> Wählen Sie das erste Eizelle injiziert aus der Liste. Testen Sie, ob die Injektion in die Eizelle war durch bildgebende einem Frame in der Fluoreszenz (eins in 6G). </li><li> Konfigurieren Sie die experimentellen Parameter, unter anderem: Anregungswellenlänge, Emissions-Weg, Zeit Anregung, Z-Stapel und die Zeit zwischen den Sammlungen. Hinweis: Weitere Informationen hierzu finden Sie Parton R., et al. (2010) 2. </li><li> Sammeln Sie die Datenmenge. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse In vitro synthetisiert Alexa-546 GRK-RNA in einer Me31B :: GFP Eikammer (7A) injiziert. Die RNA lokalisiert an der dorsalen vorderen der Eizelle und bildet eine Kappe um den Kern (7B). Weitere Beispiele für RNA Lokalisation siehe MacDougall N., et al. (2003) 11. Mitte und Ende der Etappe exprimierenden Oozyten fluoreszenzmarkierte Protein (Tau-GFP, 7C) oder RNA-Tagging-Systeme (GRK * mCherry, 7D) können ohne Injektion abgebildet werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> Abbildung 1. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> Abbildung 2. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> Abbildung 3. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> Abbildung 4. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> Abbildung 5. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> Abbildung 6. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> Abbildung 7.

<ol><li>Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+and+the+development+of+biology+in+the+20th+century%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century.</a> Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).</li>
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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

<html> Live Cell Imaging ist ein leistungsfähiges Assay zur Untersuchung zellulärer Prozesse in Echtzeit. Neben der einfachen Hellfeld-Beobachtung hat der Zusatz von fluoreszierenden Markierungen an Proteine ​​und RNAs von Interesse führen zu vielen Durchbrüchen. Hier haben wir ein Protokoll für die Bildgebung individuelles Wohnen Eizellen, die in Kombination mit genetischen und biochemischen Assays genutzt werden können umrissen. In diesem Protokoll auch erklären, wie experimentell zu manipulieren lebenden Oozyten durch Injektion. Es gibt viele Möglichkeiten für das Material zu injizieren, einschließlich In-vitro synthetisiert fluoreszenzmarkierten RNA-Assay die Fähigkeit einer sekundären Struktur, um direkte RNA Körperregion (Ball und Davis, unveröffentlicht) und Antikörper, die die Funktion von Proteinen 6 inhibieren. Zukünftige Arbeiten werden wahrscheinlich sehen die Einführung anderer Etikettierung Komponenten und zelluläre Maschinerie zur lebenden Eizellen ermöglichen molekularen Mechanismen zu testen. t &quot;&gt; Die Erhaltung der Rentabilität und Lebensfähigkeit des Gewebes ist von wesentlicher Bedeutung bei der Arbeit mit lebenden Zellen. In diesem Protokoll, weisen wir darauf hin eine Reihe von Schritten, die auf Stress des Eies Kammer führen kann. Zum Beispiel, trotz Öl überlegen for Imaging, erweiterte Kulturbegriff in der Öl kann dazu führen, auf dem Ei Kammer zu betonen. Dies kann leicht unter Hellfeld Belichtung werden durch Untersuchung des Zellkerns und Position, Membran, die Eizelle zu verzerren und wird bleb unter Stress (vgl. Abbildung 7E (unbelasteten) zu Figure7F überwacht werden ( betonte)). Stage 9 Eikammern zeigen RNA Lokalisation und Grenze Zellmigration 12 über mehrere Stunden. jedoch ein Stadium 8.7 Eikammer beginnt zu negativen Auswirkungen in Halo Kohlenstoff Öl nach etwa 40 Minuten von den Eierstöcken entfernt von dem weisen weiblich. Spätstadium Eikammern, Stufe 11 bis 14, kann sich normal entwickeln entweder in Öl oder wässrigen Medien wegen der Sekretion der Eischale von den Follikelzellen in diesen Phasen 13. Es war Reported, dass die Zugabe von Insulin zu wässrigen Medium Insekten-Stufe 9 Oozyten bis zu 6 Stunden 14 und germaria bis zu 14 Stunden 15 aufrechtzuerhalten. In allen Fällen sollten aggressive Manöver des Eies Kammer vermieden werden, da sie die Eizellen betont und reduziert seine Lebensfähigkeit. Imaging weniger Ei Kammern und darauf achten, dass jeder vorsichtig zu behandeln ist der beste Weg, um eine optimale Rentabilität zu gewährleisten.

Werkzeuge in Dissektion verwendet sollte sauber sein, aber müssen nicht autoklaviert werden. Wischen Sie Werkzeuge mit EtOH und es ihnen ermöglichen, vor Beginn trocknen. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Feine Spitzen Pinsel (Künstler Sable, rund, Größe 00 oder 0) </td><td> Von den meisten Verkaufsstellen Malutensilien </td><td></td><td> Eine gute Qualität ist wichtig, Pinsel </td></tr><tr><td> Halocarbon Products Corporation, Baureihe 95 </td><td> Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 </td><td></td><td> Europäische Händler: Solvadis (GMBH) Achten Sie darauf, Oxygenat durch Einblasen von Luft durch das Öl. </td></tr><tr><td> Deckglas-Nr. 1.5, 22 x 50mm </td><td> International-No1-VWR Cat = 631-0137-22-50mm </td><td> Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 - Dumostar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot; Spitze ist auch gut, aber zerbrechlicher </td></tr><tr><td> Dissecting Sonde </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td> Olymp </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> CO2-Pad </td><td> Erhältlich über <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (Ein Geschäftsbereich der Genesee Scientific) </td><td> 59-114 (789060 Dutscher) </td><td> Europäische Händler: www. dutscherscientific. com</a> / Es ist auch relativ einfach benutzerdefinierte bauen eine eigene Fliege Pads </td></tr><tr><td> Kimcare </td><td> Kimbery Clark-Kimcare-Medizinische Reinigungstücher </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop-DeltaVision </td><td> Applied Precision </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulator </td><td> Burleigh Mikromanipulatoren von Lumen Dynamics Group Inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, Kanada L5N 6H7 </td><td> Burleigh PCS-5000-Serie, TS-5000 bis 300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (Formerly Exfo) </td></tr><tr><td> Injektionsvorrichtung </td><td> Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 </td><td> MINJ-1 </td><td> Geändert mit einer Halterung zu nehmen Eppendorf Femptotips </td></tr><tr><td> Injektionsnadel </td><td> Eppendorf Sterile Femtotips I und II </td><td> 930000043 </td><td> Verschiedene Tipps sind besser für unterschiedliche Anwendungen </td></tr><tr><td> Tipps zum Einlegen von 20 &amp;mgr; l </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Trockene aktive Hefe </td><td> Fleischmann Yeast </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

der ausarbeitung der einzelnen drosophila ei chambers für live-imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live Cell Imaging ist eine wichtige Technik angewendet, um eine Reihe von Drosophila Gewebe als Modelle verwendet, um Themen wie Achsen-Spezifikation, die Zelldifferenzierung und Organogenese 1 zu untersuchen. Richtige Vorbereitung der experimentellen Proben ist ein wichtiger, jedoch oft vernachlässigte Schritt. Das Ziel der Vorbereitung ist es, physiologische Relevanz zu gewährleisten und optimale Aufnahmebedingungen zu schaffen. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten, ist es entscheidend zu Dehydratation, Hypoxie, Überhitzung oder Verschlechterung Medium 2 zu vermeiden. Die Drosophila-Ei Kammer ist ein gut etabliertes System zur Prüfung von Fragen im Zusammenhang, aber nicht beschränkt, um Körper Musterung, mRNA Lokalisation und Organisation des Zytoskeletts 3,4. Für Early-und Mid-Stage Ei Kammern, die Montage in Halocarbonöl ist gut für das Überleben, dass es freie Diffusion von Sauerstoff ermöglicht, verhindert das Austrocknen und Hypoxie und verfügt über hervorragende optische Eigenschaften für die Mikroskopie. ImAlterung der fluoreszierenden Proteinen besteht in der Einführung von Transgenen in das Ei Kammer oder physikalische Injektion von markierten RNA-, Protein oder Antikörper 5-7 möglich. Zum Beispiel erlaubt die Aufnahme MS2 Konstrukte in das Genom von Tieren Echtzeit-Beobachtung von mRNAs in der Eizelle 8. Diese Konstrukte können für in vivo-Markierung von mRNA durch Nutzung des MS2-Bakteriophagen-RNA-Stammschleife Interaktion mit dem Hüllprotein 9. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Extraktion von Eierstöcken sowie Isolierung einzelner Ovariolen und Ei Kammern aus der weiblichen Drosophila. Für eine detaillierte Beschreibung von Drosophila Oogenese siehe Allan C. Spradling (1993, neu aufgelegt 2009) 10.

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Ei Kammer ist ein ausgezeichnetes Modell für die Erforschung der Mechanismen der mRNA-Lokalisierung. Um die dynamische Ereignisse, die die Prozesse der Lokalisierung untermauern zu erfassen, ist eine schnelle hochauflösende Bildgebung von lebendem Gewebe erforderlich. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Bildgebung von Live-Proben mit minimalen Unterbrechungen.

Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Die Live-Cell-Imaging-Technik ist ein wichtiges Verfahren, das auf eine Reihe von Drosophila-Geweben angewendet wird, die als Modelle zur Untersuchung von Themen wie der Achsenspezifizierung ...

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, dynamische Prozesse in lebenden Drosophila-U-Stellen aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst intakte Ovarien aus gut genährten zweitägigen weiblichen Fliegen isoliert werden. Als zweiter Schritt werden einzelne Follikel aus den Ovarien gewonnen, um die Eikammern abzubilden.Wenn sie ein geeignetes fluoreszierendes Protein exprimieren, können einzelne Eikammern entweder direkt abgebildet werden oder zusätzlichen Manipulationen unterzogen werden, wie beispielsweise der Mikroinjektion fluoreszierender Marker vor der Bildaufnahme. Letztendlich können durch die Analyse der Filmsequenzen die dynamischen Wechselwirkungen intrazellulärer Komponenten aufgezeigt werden. Diese Methode hat uns geholfen, einige zentrale Fragen auf dem Gebiet des RNA-Transports und der lokalisierten Translation zu beantworten.Beispielsweise, wie wird die Expression von Proteinen, die den Körperplan anlegen, in Zeit und Raum in der lebenden Beobachtung reguliert? Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie erhebliche Schnelligkeit und Geschicklichkeit erfordert. Beide Übung und bessere Ergebnisse werden erreicht.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Handhabung der Eikammern schwer allein durch Text zu vermitteln ist und da technische Erfahrung und sichere Handgriffe erforderlich sind. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einen kleinen Tropfen Halocarbon-Öl auf einen Deckglas geben und beiseitelegen. Anschließend betäuben Sie die vorbereiteten Fliegen mit Kohlendioxid.Verwenden Sie eine scharfe Feinnasenzange, um eine fette weibliche Fliege am vorderen Abdomen zu fassen. Fassen Sie nicht in der Mitte des Abdomens zu. Halten Sie das Weibchen etwa zwei bis drei Zentimeter über die vorbereitete Deckglasplatte.Entfernen Sie mit einem zweiten Paar Pinzetten das Gewebe am äußersten Hinterende des Weibchens. Dies schließt normalerweise Darmgewebe mit sauberen Pinzetten ein. Massieren Sie vorsichtig den Bauch vom vorderen zum hinteren Ende, ähnlich wie man Zahnpasta aus einer Tube drückt.Die Eierst&ouml;cke sehen aus wie gro&szlig;e undurchsichtige Strukturen und bleiben an der Spitze der Pinzette haften. Sammeln Sie die Eierst&ouml;cke, indem Sie sie mit dem Kohlenstoff&ouml;l-Halo auf dem Objekttr&auml;ger ber&uuml;hren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis vier bis sechs Eierst&ouml;cke gesammelt sind.Vor der Isolierung der Antennen. Stellen Sie die Lichtquelle am Mikroskop so ein, dass die Beleuchtung den Objektträger in flachem Winkel trifft und kontrastreiche Schatten auf dem Gewebe erzeugt. Bei der Dissektion der Fliegen ist es sehr wichtig, die richtigen Werkzeuge zu verwenden.Der Zeiger, den wir verwenden, ist nicht zu scharf, sodass er das Gewebe beschädigt, sondern ziemlich stumpf, damit wir die Pinzette, die wir benutzen, greifen können. Auch diese sollte nicht zu scharf sein, um die Gewebe nicht zu beschädigen, aber gerade fein genug, um Dinge manipulieren zu können, ohne das Werkzeug zu verbiegen. Es ist außerdem sehr wichtig, saubere Instrumente zu haben, daher reinigen wir sie während des gesamten Verfahrens regelmäßig mit geschlossenen Pinzetten.Trennen Sie die beiden Ovarien, indem Sie das verbindende Gewebe am hinteren Ende entfernen. Am hinteren Ende befinden sich die am weitesten entwickelten Eikammern. Richten Sie ein Ovarium horizontal aus, wobei die jüngsten Eikammern in Richtung Ihrer dominanten Hand zeigen.Dann greifen Sie vorsichtig das hintere Ende am verbleibenden Bindegewebe und verwenden Sie eine feine Nadel aus Wolfram oder eine Präpariernadel, um einzelne Eikammern vom Jamar-Stadium bis zum Stadium 10 herauszulösen, die sich voneinander trennen; ältere Eikammern bleiben jedoch mit dem Ovar verbunden. Ziehen Sie mit der Nadel vorsichtig 15 bis 25 getrennte Eikammern in die Mitte des Öltropfens. Falls mehr als ein Ovar präpariert werden muss, wählen Sie eines aus einer anderen Fliege.Entfernen Sie überschüssiges Ovarialgewebe und arbeiten Sie schnell, da die Zellen aufgrund von Stress beginnen, phänotypische Veränderungen aufzuweisen. 40 Minuten nach der Dissektion aus dem Eierstock entfernen Sie das überschüssige Ovarialgewebe aus dem Öl. Verwenden Sie saubere Instrumente für die Injektion von Zellen im mittleren Stadium und richten Sie die Arealen senkrecht zur langen Achse des Deckgläschens aus. Um Eikammern im späten Stadium zu isolieren.Eine andere Methode ist erforderlich, um das hintere Ovarabschnitt wie zuvor beschrieben zu fassen. Führen Sie die Präpariernadel in das hintere Ende des Ovars in der Nähe der Pinzette ein. Um zu vermeiden, dass die Eikammern durchstochen werden, bringen Sie die Nadel zwischen den Eikammern im fortgeschrittenen Entwicklungsstadium ein.Ziehen Sie die Dissektionsnadel durch die Ovarien, bis sie an den Ei-Kammern im frühen Stadium austritt. Wenn der Vorgang korrekt durchgeführt wird, löst die Sonde das Bindegewebe, das die Zellhaufen und die Ei-Kammern im späten Stadium fixiert, heraus. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis sich die Zellhaufen auf dem Deckglas ausgebreitet haben.Wenn die Eikammern nicht mehr übereinander gestapelt sind, ist dieser Schritt abgeschlossen. Mit einer Präpariernadel die Eikammern im fortgeschrittenen Stadium trennen, um die Positionierung von Stadium 14 für die Bildgebung zu erleichtern. Bei den Halskammern mit der Pinzette die dorsalen Anhänge erfassen.Bereiten Sie die zu injizierenden Lösungen vor, indem Sie diese kurz mit hoher Geschwindigkeit zentrifugieren. Dadurch werden feste Ablagerungen abgetrennt, die die Injektionsnadel verstopfen könnten. Laden Sie anschließend die Injektionsnadel mit einer Ladespitze und befestigen Sie die geladene Injektionsnadel vorsichtig am Injektor.Platzieren Sie nun ein kleines Glasstück neben den Proben und befestigen Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch. Das Glas dient als Wand, um zu brechen oder zu trennen. Ziehen Sie die Nadel heraus.Bereiten Sie das Mikroskop und die Injektionsvorrichtung für das Experiment vor. Achten Sie darauf, die Nadelspitze nicht zu beschädigen. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen automatisierten Mikroskoptisch mit Punkte-Anfahrfunktion, um alle Zellen vom Stadium acht und Stadium neun für die Injektion zu markieren.Senken Sie nun die Injektionsnadel ab, bis sie das Öl berührt. Wählen Sie den ersten Punkt aus der Liste der markierten Punkte aus und fokussieren Sie auf den Cyten. Senken Sie die Nadel manuell ab, bis sie sich in derselben Fokusebene wie der Cyt befindet.Verwenden Sie die Steuerelemente des Manipulators, um die Spitze der Injektionsnadel so zu bewegen, dass sie sich innerhalb der U-Stelle befindet. Oft ist eine schnelle Stichbewegung erfolgreicher als eine langsame. Sobald die Nadel im Inneren ist, geben Sie ein kleines Volumen aus der Nadel ab und bewerten Sie die Wirkung visuell.Wiederholung ist erforderlich. Wenn die Injektion erfolgreich ist, wird das Cytoplasma innerhalb der Zelle verdrängt. Die genaue Menge der injizierten Flüssigkeit ist schwer zu quantifizieren.Um das injizierte Volumen zu erhöhen, passen Sie entweder den Druck oder die Dauer des Injektionsimpulses an. Brechen Sie die Nadelspitze leicht ab, um die Nadelöffnung geringfügig zu vergrößern, oder verwenden Sie einfach mehrere Injektionsimpulse, bevor Sie den nächsten Cyt auswählen. Heben Sie die Injektionsnadel so weit in das Öl an, dass sie nicht mit anderen Cytos kollidiert.Umfangreiches Einstechen oder längeres Verweilen der Nadel im Cytoplasma schädigt die Eizelle erheblich. Arbeiten Sie daher schnell. Die Injektion sollte weniger als 10 Sekunden dauern.Wenn ein Fehler gemacht wird, bewegen Sie sich zur nächsten Markierung an eine Stelle. Verschwenden Sie keine Zeit an beschädigte Stellen. Wenn die Nadel verstopft ist, bewegen Sie die Nadel zu dem gebrochenen Glasstück.Bringen Sie die Nadel vorsichtig in die gleiche Fokusebene wie das Glas und stoßen Sie die Nadel sanft in das Glas hinein. Prüfen Sie, ob die Nadel frei ist, indem Sie den Injektionsknopf drücken und beobachten, ob Flüssigkeit aus der Nadelspitze austritt. Sobald alle US-Standorte injiziert wurden, bewegen Sie die Nadel manuell aus dem Öl heraus und positionieren Sie sie außerhalb des Strahlengangs des Mikroskops.Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung sicher ist, um Augenschäden zu vermeiden, und schalten Sie die Lichter aus. Um die Geschwindigkeit der Fluoreszenzbildgebung zu erhöhen, ist dies zwingend erforderlich. Wenn zwischen der Isolierung der Eikammer und der Cyteninjektion eine Stunde oder länger vergangen ist, lassen sich die Cyten schwer injizieren und zeigen phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit Stress. Ähnliche Probleme können bei unsachgemäßer Handhabung der Zelle oder Injektion von überschüssigen Volumina auftreten. Eikammern, die transgene fluoreszierende Proteine exprimieren, können ohne Injektion abgebildet werden. Die MS2-Markierung endogener RNA kann mit guten Ergebnissen mithilfe der Gewebegewinnungsverfahren unter Verwendung des vollständigen in vitro synthetisierten Verfahrens abgebildet werden.Alexa, 5 46 kin, RNA wurde in eine ME 31 BGFP Eizelle injiziert, wobei sich die RNA im dorsal-anterioren Bereich der Zelle lokalisierte und einen Kap um den Zellkern bildete. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von etwa 10 Minuten – vom Zeitpunkt der Dissektion bis zum Beginn der Bildaufnahme – durchgeführt werden. Achten Sie beim Durchführen dieses Verfahrens darauf, das Gewebe schnell, aber sorgfältig zu behandeln. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dynamische Prozesse in lebenden Drosophila-Zellen aufgezeichnet werden können.

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