Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Ziel des folgenden Experiments ist es, dynamische Prozesse in lebenden Drosophila-U-Standorten zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst intakte Eierstöcke von gut genährten, zwei Tage alten weiblichen Fliegen isoliert werden. In einem zweiten Schritt werden einzelne Antennen aus den Eierstöcken entnommen, um die Eikammern abzubilden.

Wenn sie dann ein geeignetes fluoreszierendes Protein exprimieren, können einzelne Eikammern direkt abgebildet werden oder weiteren Manipulationen unterzogen werden, wie z. B. der Mikroinjektion von fluoreszierenden Markern vor der Bildgebung. Letztlich kann durch die Analyse der Filmsequenzen das dynamische Zusammenspiel der intrazellulären Komponenten aufgedeckt werden. Diese Methode hat uns geholfen, einige Schlüsselfragen im Bereich des RNA-Transports und der lokalisierten Translation zu beantworten.

Wie wird zum Beispiel die Expression von Proteinen, die den Körperplan in Zeit und Raum aufstellen, in der lebenden Aufsicht reguliert? Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie erhebliche Geschwindigkeit und Geschicklichkeit erfordert. Beide üben bessere Ergebnisse, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Manipulationen an den Eikammern schwierig zu vermitteln sind und da das technische Know-how und die sicheren Hände der Patientin erforderlich sind. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie einen kleinen Tropfen Halo-Kohlenstofföl auf ein Deckglas geben und beiseite legen. Anschließend werden die präparierten Fliegen mit Kohlendioxid betäubt.

Greife mit einer scharfen, feinen Nasenzange eine fette weibliche Fliege am vorderen Ende des Bauches. Greifen Sie nicht in die Mitte des Bauches. Halten Sie das Weibchen etwa zwei bis drei Zentimeter über das vorbereitete Deckglas.

Entfernen Sie mit einer zweiten Pinzette das Gewebe am äußersten Hinterteil des Weibchens. Dazu gehört in der Regel Darmgewebe mit sauberer Pinzette. Massieren Sie den Bauch sanft vom vorderen zum hinteren Ende, wie Sie Zahnpasta aus einer Tube drücken.

Die Eierstöcke sehen aus wie große, undurchsichtige Strukturen und kleben am Ende der Pinzette. Sammeln Sie die Eierstöcke, indem Sie sie mit dem Halo-Kohlenstofföl auf dem Objektträger berühren. Wiederholen Sie dann den Vorgang, bis vier bis sechs Eierstöcke entnommen sind.

Vor der Isolierung der Antennen. Stellen Sie die Lichtquelle am Mikroskop so ein, dass die Beleuchtung in einem flachen Winkel auf den Objektträger trifft und kontrastreiche Schatten auf dem Gewebe erzeugt. Beim Sezieren der Fliegen ist es sehr wichtig, die richtigen Werkzeuge zu verwenden.

Der Zeiger, den wir verwenden, ist nicht zu scharf, um das Gewebe zu beschädigen, aber ziemlich stumpf, damit wir die Pinzette, die wir verwenden, erfassen können. Auch hier gilt: Nicht zu scharf, damit sie das Gewebe beschädigen, aber gerade fein genug, damit wir Dinge manipulieren können, ohne das Werkzeug zu verbiegen. Es ist auch sehr wichtig, saubere Werkzeuge zu haben, daher reinigen wir sie regelmäßig während des gesamten Eingriffs mit geschlossenen Pinzetten.

Trennen Sie die beiden Eierstöcke, indem Sie das Bindegewebe am hinteren Ende entfernen. Das hintere Ende hat die reifsten Eikammern. Richten Sie einen Eierstock horizontal mit den jüngsten Eikammern in Richtung Ihrer dominanten Hand aus.

Fassen Sie dann vorsichtig das hintere Ende am restlichen Bindegewebe und verwenden Sie ein Präparierprofi oder eine Wolframnadel, um einzelne Antennen herauszukitzeln. Einzelne Eikammern vom Jamar-Stadium bis zum Stadium 10 trennen sich voneinander, ältere Eikammern bleiben jedoch mit dem Eierstock verbunden. Ziehen Sie mit der Sonde vorsichtig 15 bis 25 getrennte Antennen zur Mitte des Öltropfens. Wenn mehr als ein Eierstock präpariert werden muss, wählen Sie einen aus einer anderen Fliege.

Entsorgen Sie überschüssiges Eierstockgewebe und arbeiten Sie schnell, da die Zyten aufgrund von Stress phänotypische Veränderungen aufweisen. Entfernen Sie nach 40 Minuten nach der Präparierung des Eierstocks das überschüssige Eierstockgewebe aus dem Öl. Richten Sie die Antennen mit sauberen Instrumenten für die Injektion von Zyten im mittleren Stadium senkrecht zur Längsachse des Deckglases aus. Zur Isolierung von Eikammern im späten Stadium.

Eine andere Methode ist für den hinteren Teil des Eierstockgriffs erforderlich, wie zuvor beschrieben. Führen Sie die Präpariersonde in das hintere Ende des Eierstocks in der Nähe der Pinzette ein. Um ein Durchstechen der Eikammern zu vermeiden, führen Sie die Sonde zwischen die Eikammern im späten Stadium ein.

Ziehen Sie die Präpariernadel durch den Eierstock, bis sie in den frühen Eikammern austritt. Wenn es richtig gemacht wird, entfernt die Sonde das Bindegewebe, das die Antennen und die Eikammern im Spätstadium an Ort und Stelle hält. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Antennen auf dem Deckglas ausgebreitet sind.

Wenn die Eierkammern nicht mehr übereinander gestapelt sind, ist dieser Schritt abgeschlossen. Trennen Sie mit einer Präpariersonde die Eikammern im späten Stadium, um die Bildgebung bis zur Position von Stufe 14 zu erleichtern. Halskammern verwenden eine Zange, um ihre dorsalen Anhänge zu greifen.

Bereiten Sie die zu injizierenden Lösungen vor, indem Sie den Mutt mit hoher Geschwindigkeit kurz zentrifugieren. Dadurch werden alle festen Ablagerungen entfernt, die die Injektionsnadel blockieren könnten. Laden Sie dann die Injektionsnadel mit einer Ladespitze und befestigen Sie die geladene Injektionsnadel vorsichtig am Injektor.

Platzieren Sie nun ein kleines Stück Glas neben den Proben und montieren Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch. Das Glas dient als Wand, um es zu zerbrechen oder zu lösen. Ziehen Sie den Stecker aus der Steckdose.

Bereiten Sie das Mikroskop und die Injektionsapparatur für das Experiment vor. Achten Sie darauf, dass die Nadelspitze nicht bricht. Wenn möglich, verwenden Sie ein automatisiertes Stadium, das über die Möglichkeit eines Punktbesuchs verfügt, um alle Zyten der Stadien acht und neun für die Injektion zu markieren.

Senken Sie nun die Injektionsnadel ab, bis sie das Öl berührt. Wählen Sie den ersten Punkt in der Liste der markierten Punkte aus und fokussieren Sie sich auf den Zyten. Senken Sie die Nadel manuell ab, bis sie sich in der gleichen Fokusebene wie der Zyt befindet.

Bewegen Sie mit den Bedienelementen des Manipulators die Spitze der Injektionsnadel, bis sie sich innerhalb der U-Stelle befindet. Eine schnelle Stichbewegung ist oft erfolgreicher als eine langsame. Sobald Sie sich im Inneren befinden, werfen Sie ein kleines Volumen aus der Nadel aus und beurteilen Sie die Wirkung visuell.

Eine Wiederholung ist erforderlich. Wenn die Injektion erfolgreich ist, wird das Zytoplasma im Inneren des Zyten verdrängt. Die genaue Menge der eingespritzten Flüssigkeit ist schwer zu quantifizieren.

Um das eingespritzte Volumen zu erhöhen, passen Sie entweder den Druck oder die Dauer des Einspritzimpulses an. Brechen Sie die Nadelspitze, um die Nadelöffnung leicht zu vergrößern, oder verwenden Sie einfach mehrere Injektionsimpulse, bevor Sie die nächste Markierung auswählen. Cyte. Heben Sie die Injektionsnadel hoch genug in das Öl, damit sie nicht gegen andere Zyten stößt.

Ausgedehntes Stechen oder Verweilen mit der Nadel im Inneren des Zyten schädigt die Eikammer schwer. Seien Sie also schnell. Die Injektion sollte weniger als 10 Sekunden dauern.

Wenn ein Fehler gemacht wird, wechseln Sie zur nächsten Markierung einer Site. Verschwenden Sie keine Zeit mit Sehschäden. Wenn die Nadel verstopft ist, bewege die Nadel zu dem zerbrochenen Glasstück.

Wenn sich das Glas und die Nadel in derselben Fokusebene befinden, rammen Sie die Nadel vorsichtig in das Glas. Testen Sie, ob die Nadel nicht verstopft ist, indem Sie den Injektionsknopf drücken und prüfen, ob Flüssigkeit aus der Nadelspitze austritt. Wenn alle US-Stellen injiziert wurden, bewegen Sie die Nadel manuell aus dem Öl heraus und richten Sie sie für das Mikroskop aus dem Strahlengang aus.

Stellen Sie sicher, dass es sich in einer sicheren Ausrichtung befindet, um Augenschäden zu vermeiden, das Licht ist ausgeschaltet. Um die Fluoreszenzbildgebung zu erleichtern, ist die Geschwindigkeit ein Muss. Wenn eine Stunde oder mehr zwischen der Isolierung der Eikammer und der Zyteninjektion vergangen ist, sind die Zyten schwer zu injizieren und zeigen phänotypische Veränderungen, die mit Stress verbunden sind.

Ähnliche Probleme können bei der groben Handhabung des Zyten oder der Injektion von überschüssigem Volumen auftreten. Eikammern, die trenchgene fluoreszierende Proteine exprimieren, können ohne Injektion abgebildet werden. Die MS-Two-Markierung von endogener RNA kann mit den Gewebeisolationsverfahren unter Verwendung des vollständigen Verfahrens in vitro mit guten Ergebnissen abgebildet werden.

Alexa, 5 46 kin, RNA wurde in eine ME 31 BGFP-Eikammer injiziert, die RNA lokalisierte sich im dorsalen anterioren Bereich des Zyten und bildete eine Kappe um den Zellkern. Diese Technik kann in etwa 10 Minuten vom Zeitpunkt der Dissektion bis zum Beginn der Bildgebung durchgeführt werden. Achten Sie bei diesem Verfahren auf das Gewebe, indem Sie schnell, aber vorsichtig arbeiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dynamische Prozesse in lebenden Drosophila-Zyten aufzeichnet.