Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, embryonale Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu differenzieren. Erste Kultur Maus, embryonale Stammzellen auf primären embryonalen Fibroblasten der Maus und Ergänzung mit Leukämie-Hemmfaktor. Verbessern Sie dann den Normalisierungsprozess durch Zugabe von Noggin BFG F und FGF 8 und induzieren die Motoneuronenspezifikation durch Inkubation mit Retinsäure und geglättetem Agonisten, gefolgt von einer Axonverlängerung und Motoneuronenreifung.

Schließlich können Sie die Immunfluoreszenzmikroskopie verwenden, um differenzierte MES-Zellen zu untersuchen, die eine starke GFP-Fluoreszenz exprimieren. Die Generierung großer Mengen an Motoneuronen erleichterte die Erforschung von Motoneuronenerkrankungen im Vergleich zu den derzeit bestehenden Protokollen. Dieser Ansatz, embryonale Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu differenzieren, ist effizienter. Diese Methode kann Aufschluss über die spinale Muskelatrophie geben.

Es kann auch bei anderen Erkrankungen der Motoneuronen wie der amyotrophen Lateralsklerose angewendet werden. Um primäre embryonale Mausfibroblasten zu plattieren, beschichten Sie vier 100-Millimeter-Gewebekulturschalen mit acht Millilitern 0,1%iger Gelatinelösung. Entsorgen Sie nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die überschüssige Flüssigkeit. Verdünnen Sie nun eine Durchstechflasche mit Mitomycin C in aktiviertem PMEF in 40 Millilitern PMEF-Medienplatte auf die vier Platten und kultivieren Sie sie bis zu einer Woche lang.

Tauen Sie anschließend ein Fläschchen mit MES-Zellen in einem 37 Grad heißen Wasserbad auf. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern E-ES-Medien in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Zentrifugieren bei 800 U/min für fünf Minuten.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie MES-Zellen in 20 Millilitern ES-Medien mit frisch zugesetztem Leukämie-Hemmfaktor. Fahren Sie fort, 10 Milliliter Medium aus den PMEF-Kulturen zu entfernen und durch 10 Milliliter der HBG-Drei-ES-Zellsuspension zu ersetzen. Überwachen Sie die Entwicklung von MES-Zellen im Laufe der Zeit von kleinen Kolonien nach 24 Stunden zu Kolonien mit einem Durchmesser von etwa 100 Mikrometern 72 Stunden nach der Plattierung.

Tauschen Sie das Medium täglich aus, um die Proliferation der Zellen für die Induktion von MES-Zellen aufrechtzuerhalten. Differenzierung in Motoneuronen. Die embryonalen Stammzellen der Maus müssen zunächst von den PMEF-Feederzellen getrennt und dann am Tag der Induktion in einer Suspensionsumgebung kultiviert werden.

Für jede 100-Millimeter-ES-Kultur wird ein T one 50-Kolben hergestellt, der mit 0,1 % Gelatine beschichtet ist. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird die überschüssige Gelatine entfernt und dreimal mit PBS gewaschen. Saugen Sie weiterhin vorsichtig die Medien aus der ES-Kultur ab und achten Sie darauf, dass lose anhaftende Kolonien nicht verdrängt werden. Anschließend einmal mit 10 Milliliter PBS waschen.

Um nun MES-Zellen von PMEF zu trennen, fügen Sie drei Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie drei bis fünf Minuten lang. Vergewissern Sie sich, dass sich die Stammzellen und das PMEF bei 37 Grad Celsius von der Platte gelöst haben. Fügen Sie dann 15 Milliliter frisches ES-Medium hinzu und spalten Sie die Kolonien durch Pipettieren auf.

Die Zellsuspension wird in den vorbereiteten, mit Gelatine überzogenen T one 50 Kolben überführt und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, damit sich das PFS an der gelatinierten Oberfläche anlagern kann. Ernten Sie nun die schwimmenden MES-Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie durch Zentrierung. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern neuronaler Differenzierung.

Das Medium wird mit einem Hämozytometer aufgezählt und dann zur Differenzierung auf eine 100-Millimeter-Suspensionskulturschale aufgetragen. Am ersten Tag wird durch Mikroskopie überprüft, ob die MES-Zellen kleine schwebende Aggregate gebildet haben, die als Embryonalkörper bezeichnet werden. Da kein PMEF an der Schale haftet, die ES-Suspensionszellen und -Medien in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen und dann drei Minuten lang bei 500 U/min zentrifugieren.

Um die embryonalen Körper zu ernten, aspirieren Sie das Medium vorsichtig und fügen Sie 10 Milliliter frische neuronale Differenzierung hinzu, Medium zu den pelletierten Ebs, und plattieren Sie dann die Zellen für 24 Stunden in einer neuen Bakterienschalenkultur für die Differenzierung. Am zweiten Tag schwenken Sie die Kulturschale und geben das Medium und das EBS in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie EBS durch die Schwerkraft absetzen, saugen Sie dann das Medium vorsichtig ab und reanimieren Sie EBS und 10 Milliliter Motoneuronendifferenzierung.

Medienkultur EBS in einer neuen Bakterienschale für fünf Tage zur Differenzierung. Am siebten Tag stellen Sie sicher, dass EBS einen Durchmesser von etwa 150 bis 200 Mikrometern haben und bei der Differenzierung starke GFP-Signale exprimieren. Am fünften Tag, zwei Tage vor der Dissoziation von EBS, legen Sie 12 Millimeter runde Deckgläser auf den Boden einer 24-Well-Platte.

Fügen Sie dann 0,5 Milliliter von 100 Mikrogramm pro Milliliter, Poly-DL-Ornithin hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie die Poly DL Ornithin Air Dry Platten und Deckgläser in einer Gewebekulturhaube. Spülen Sie die Tellermulden dreimal mit doppelt destilliertem Wasser aus.

An der Luft trocknen lassen, um die Deckgläser zu beschichten. Machen Sie eine frische Verdünnung von zwei Mikrogramm pro Milliliter Mauslaminin in fünf Milliliter eiskaltes XPBS. 0,5 Milliliter pro Vertiefung zugeben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.

Bei der Unterscheidung zweimal mit PBS waschen. Am siebten Tag sammeln Sie das EBS in einem 15-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie das EBS durch die Schwerkraft absetzen. Geben Sie nach vier Wäschen mit PBS einen Milliliter ACU max in das EBS, mischen Sie es vorsichtig und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, dann aspirieren Sie überschüssiges ACU max, das das EBS bedeckt.

Fügen Sie nun drei Milliliter MND-Medium hinzu und dissoziieren Sie EBS, indem Sie etwa 20 Mal mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette pipettieren, dann zwei Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren und die Zellsuspension durch eine Zelltrainerkappe in ein 12 x 75 Millimeter großes Röhrchen leiten. Dieser Dissoziationsschritt wird mit den verbleibenden Klumpen und Zellen, die vom Filter zurückgehalten werden, wiederholt, um die Ausbeute an Einzelzellen in einer abschließenden Einzelzellsuspension von sechs Millilitern anzureichern. Mischen Sie vorsichtig die Einzelzellsuspension und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, verdünnen Sie die Zellen zu vollständigem MND-Medium auf eine Dichte von zweimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliterplatte.

0,5 Milliliter Zellsuspension pro Vertiefung der vorbereiteten 24-Well-Platten, die mit Poly-DL-Ornithin-Laminin beschichtete Deckgläser enthalten. Die differenzierten Zellen verlängern nach zwei Tagen lange Neuriten. In Kultur ist HBG drei eine ES-Zelllinie, die von einer transgenen Maus abgeleitet ist, die EGFP unter der Kontrolle eines Motoneuronen-spezifischen Promotors HB nine mit einem definierten Differenzierungsprotokoll exprimiert.

MES-Zellen können verwendet werden, um Motoneuronen abzuleiten. Die undifferenzierten MES-Zellen bilden runde Kolonien auf der Oberseite einer Fiberblast-Feeder-Schicht. Sie haben eine schwache GFP-Expression.

Diese MES-Zellen wurden von Feeder-Schichten getrennt und auf schalenförmigen Schalen mit geringer Bindung kultiviert, um embryonale Körper zu bilden. Differenzierte MES-Zellen exprimierten nach dem siebten Tag eine starke GFP-Fluoreszenz. Differenzierung EBS wurden dissoziiert und auf Poly-DL-Ornithin-Laminin-beschichteten Platten plattiert.

Die differenzierten Zellen verlängern lange Neuriten aus den Zellkörpern der plattierten Zellen nach zwei Tagen in Kultur, die aus MES-Zellen stammenden Motoneuronen können durch Immunfluoreszenzfärbung charakterisiert werden. Diese GFP-positiven Zellen exprimieren den panneuronalen Marker Neurofilament und die beiden Motoneuronen-spezifischen Marker. Augenlid eins und Cholinacetyltransferase DPI färbt die Zellkerne zusammen.

Unser zweistufiges Differenzierungsprotokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, MES-Zellen in spinale Motoneuronen zu differenzieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie embryonale Stammzellen von Mäusen effizient in Motoneuronen differenziert werden können. Zusammenfassend lässt sich daran denken, dass die hohe Qualität der embryonalen Stammzellen der Maus der wichtigste Parameter für die effiziente Erzeugung von Motoneuronen ist.