Name: Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Differenzierung von embryonalen Mausstammzellen in Motoneuronen. Dieses Protokoll nutzt Retinsäure und spezifische Wachstumsfaktoren zur Generierung großer Zellmengen für die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen.

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Dieses Manuskript ist dem Andenken von Dr. Wenlan Wang, der am 26. Mai 2011 verabschiedet gewidmet. Wir danken Dr. Douglas A. Kerr für die großzügige Bereitstellung der HBG3 mES Zellen in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde von Nemours finanziert wird, ein Zuschuss (2 RR016472-10) unter der INBRE Programm des National Center for Research Resources (NCRR) und einem Cobre Gewährung von Finanzhilfen aus dem NCRR (5 RR020173 P20-05) an das Zentrum für Unterstützung Pädiatrische Forschung an der Alfred I. DuPont Hospital for Children, Wilmington, Delaware, USA.

1. Schritt 1: embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Cell Culture (Timing: 3 Tage) 1. Ausplattieren primäre embryonale Maus-Fibroblasten (PMEF) <ol><li> Coat vier 100-mm Zellkulturschalen mit Gelatine für PMEF Haftung. 8 ml von 0,1% Gelatine-Lösung (StemCell Technologies) zu jeder Schale und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Gelatine von Gerichten. Nicht spülen das Geschirr. </li><li> Verdünnen Sie ein Fläschchen mit Mitomycin C-inaktivierten PMEF (Millipore), die ca. enthält. 5 x 10 6 Zellen in 40 ml PMEF Medien (siehe Rezept in Tabelle 1) und Platte auf vier 100-mm Zellkulturschalen. Die PMEF eine Feeder-Schicht für MES-Zellen. </li><li> PMEF sollte mindestens einen Tag vor der Zugabe mES Zellkulturen plattiert werden. PMEF kann bis zu 1 Woche nach der Beschichtung verwendet werden. </li></ol> 2. Plating mES Cells Um die Effizienz von MES-Zell-Differenzierung in Motoneuronen zu überwachen, Verwendeten wir HBG3 kann eine ES-Zelllinie, die von einer transgenen Maus exprimiert eGFP unter der Kontrolle des Promotors Motoneuronen Hb9 abgeleitet. <ol><li> Defrost 1 Fläschchen HBG3 mES Zellen (ca. 1 x 10 7, beigetragen von Dr. Douglas Kerr, Johns Hopkins University) in einem 37 ° C warmes Wasserbad. 5 ml ES Medien (siehe Rezept in Tabelle 1) in einem 15 ml-Tube und Spin-down-Zellen bei 800 rpm für 5 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand und resuspendieren mES Zellen in 20 ml ES Medien mit frisch zugegebenem Leukämiehemmfaktor (LIF) bei einer Endkonzentration von 10 ng / ml. HINWEIS: LIF sollte am Tag der Verwendung hinzugefügt werden und wird benötigt, um die MES-Zellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten. </li><li> Nehmen Sie 10 ml PMEF Medien aus dem PMEF in jeder Schale und mit 10 ml des HBG3 ES Zell-Suspension zu jedem Gericht. </li><li> 24 h nach der Beschichtung, bilden mES Zellen kleine Kolonien, ähnlich groß wie der Kolonie durch die Pfeilspitze in 1b dargestellt. 72 h nach dem Ausplattieren, coloniES Zunahme der Größe, da viele etwa 100 um im Durchmesser (Abbildung 1B, durch Pfeile angedeutet). Diese Zellen sind bereit für Differenzierung. Die Medien sollten täglich ausgetauscht werden, um die Proliferation von Zellen aufrecht zu erhalten. </li></ol> 2. Schritt 2: neurale Induktion (Timing: 2 Tage) Zur Differenzierung von MES-Zellen in motorischen Neuronen zu induzieren, müssen mES Zellen aus PMEF getrennt werden und kultiviert in einer Suspension Umwelt. Gelatine beschichtete Kolben werden verwendet, um PMEF von MES-Zellen zu trennen. <ol><li> Wenn mES Kolonien bereit sind für neurale Induktion (definiert als Differenzierung Tag 0), Mantel 2 T150 Flaschen mit 0,1% Gelatine (18 ml / Kolben) für 30 min bei Raumtemperatur und anschließend zu entfernen überschüssige Gelatine und waschen mit 1x PBS dreimal. HINWEIS: Jeder 100-mm-Schale Kultur wird ein T150-Gelatine beschichtete Kolben müssen PMEF trennen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Medien durch Aspiration darauf achten, nicht zu lose befestigten Kolonien zu vertreiben. 10 ml PBS kurzly und entfernen Sie dann durch Absaugen zu Waschschritt abzuschließen. </li><li> MES-Zellen aus PMEF trennen, fügen 0,25% Trypsin / EDTA (3 ml / Schale, StemCell Technologies) und Inkubation für 3-5 min bei 37 ° C, bis die Stammzellen und PMEF von der Platte zu lösen. 15 ml frisches ES-Medien ohne LIF und Pipette Zellen nach oben und unten, um Kolonien (ca. 15-20 mal) zu brechen. Dann wurde zu einem 0,1% Gelatine beschichtete T150 Destillierkolben und Inkubation für 30 min bei 37 ° C Nach der Inkubation sollten PMEF auf die Oberfläche legen, während gelatinierte ES-Zellen zu schweben sollte. Sammeln Sie die schwimmenden mES Zellen in eine 50 ml Tube. </li><li> Spin-Down bei 800 UpM und Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml Medium neurale Differenzierung (siehe Rezept in Tabelle 1). </li><li> Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und dann Platte ungefähr 2 x 10 6 Zellen mES auf einer 100 mm bakteriellen oder Suspension Kulturschale. Diese Platten erlauben Wachstum von Suspensionskulturen und fördern Bildung von Embryoidkörpern (EBS). </li><li> Auf differentiation Tag 1, bilden mES Zellen kleine schwimmende Aggregate (EVG), die sichtbar unter einem Lichtmikroskop sind. Jede Verschleppung PMEF in die Schale legen. Übertragen Sie die Suspensionszellen und Medien in ein 15 ml Tube und zentrifugieren bei niedriger Drehzahl (500 rpm) für 3 min. Medien sorgfältig absaugen, 10 ml frisches Medium neurale Differenzierung der EBs pelletiert und anschließend Platte Zellen in einem neuen bakteriellen Gericht. Zusätzlich zur Aufstockung der Medien, entfernt dieser Schritt keine PMEF tragen, die über aus dem Stand Schritt. </li><li> Auf Differenzierung Tag 2 sind EBs bereit, in Motoneuronen induziert werden. </li></ol> 3. Schritt 3: Motor Neuron-Spezifikation (Timing: 5 Tage) <ol><li> Am Tag 2 Differenzierung, wirbeln die Kulturschale und überweisen Sie den Medien-und EBS in einem 15 ml-Tube. Lassen EBs durch die Schwerkraft (~ 10 min) oder durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (500 rpm) für 3 min zu begleichen. </li><li> Aspirieren Medium vorsichtig resuspendieren und EBs in 10 ml Motor Neuron Differenzierung (MND) Medium (siehe Rezept in <strong&gt; Tabelle 1). Platte EBs in einem neuen bakteriellen Schüssel und ändern Sie die Medien täglich über 5 Tage. </li><li> 200 um im Durchmesser und sollte stark GFP-Signale (Abbildung 1C) zum Ausdruck bringen - Am Tag 7 Differenzierung sollte EBs etwa 150 sein. Diese EBs sind bereit, voneinander zu trennen und plattiert auf poly-DL-ornithine/laminin beschichteten Schalen oder Deckgläser. </li></ol> 4. Schritt 4: Herstellung von Poly-DL-ornithine/laminin beschichtete Deckgläser (Timing: 2 Tage) Zwei Tage vor distanziert EBs (dh auf die Differenzierung Tag 5), bereiten poly-DL-ornithine/laminin-coated Deckgläser. <ol><li> Platz 12-mm-Deckgläschen jähriger (Warner Instruments) an der Unterseite eines 24-Well-Platte. 25 mg Poly-DL-Ornithin (Sigma-Aldrich) in 25 ml sterilem, doppelt destilliertem Wasser (d 2 H 2 O), um ein 10X-Stammlösung (1 mg / ml) zu erhalten. Wenn Sie bereit sind zu verwenden, machen Sie eine 1/10 Verdünnung von Poly-DL-Ornithin mit D 2 H 2 O zu erhalten concentRation von 100 g / ml. 0,5 ml zu jeder Vertiefung der Platte mit 24 Vertiefungen, Inkubation bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Am folgenden Tag (Differenzierung Tag 6), absaugen Poly-DL-Ornithin und lassen die Teller und Deckgläser an der Luft trocknen in einer Gewebekultur Kapuze. Spülen Sie die Platte Brunnen mit D 2 H 2 O dreimal. Der Luft trocknen lassen für eine weitere Stunde. </li><li> 1 mg Mauslaminin (Millipore) in 5 ml kaltem Eis-1X PBS 100x Stocklösung (200 pg / ml) zu machen. Wenn Sie bereit sind zu verwenden, stellen Sie 1/100 Verdünnung in vereisten kalten 1X PBS (2 ug Laminin / ml). 0,5 ml / Well in einer 24-Well-Platte und Inkubation 4 ° C über Nacht. Vor der Aussaat Zellen, sollten überschüssige Laminin entnommen und Vertiefungen mit 1X PBS zweimal gespült. Deckgläser in MND-Medium (0,5 ml / Vertiefung) gespeichert werden. </li></ol> 5. Schritt 5: Axon Dehnung (Timing: 2 Tage) <ol><li> Am Tag 7 Differenzierung, sammeln EBs in ein 15 ml Tube und lassen sich absetzen EBs (ca. 3 min). Aspirieren Medien und Re-Suspend EBs in PBS. Erlauben Sie EBs, sich niederzulassen und dann absaugen PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. 1 ml der Accumax (Millipore) der EBS, vorsichtig mischen und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. Dann saugen überschüssiges Accumax für den EBs. </li><li> Um EBs distanzieren, 3 ml Medium MND. Pipettieren nach oben und unten 20 Mal unter Verwendung einer 1 ml-Eppendorf-Mikropipette (blaue Spitze), um EBs stören. Inkubieren für 2 min bei Raumtemperatur. Übertragen Zellsuspension auf eine 12x75 mm-Rohr mit Zellsieb Kappe (BD Falcon), um eine Einzelzellen-Suspension zu erhalten. Wiederholen diese Trennung Schritt mit den restlichen Klumpen und Zellen durch den Filter, so dass die Ausbeute von einzelnen Zellen anzureichern erhalten. Die endgültige Einzelzellsuspension werden 6 ml sein. </li><li> Vorsichtig mischen diese einzelne Zellsuspension und Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Verdünnte Zellen in MND Medium (ergänzt mit 10 ng / ml von jeder BDNF, GDNF, CNTF und NT-3) auf eine Dichte von 2x10 5 Zellen pro ml. Zellsuspension (0,5 ml / Vertiefung) auf 24-Well-Platten, die poly-DL-ornithine/laminin beschichtete Deckgläser (zuvor hergestellt wie oben beschrieben). Die differenzierten Zellen verlängern lange Neuriten nach 2 Tagen in Kultur (1D). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse 1A zeigt einen Umriss des Protokolls. In Schritt 1 sind MES-Zellen auf PMEF kultiviert und ergänzt mit LIF eine spontane Differenzierung zu verhindern. Im Allgemeinen sind undifferenzierte Kolonien mES rund und kompakt und haben klar definierte Ränder auf. Die Kolonien sind nicht in Kontakt miteinander. In der Regel sollte mES Zellen bei einer 1:4-Verhältnis aufgeteilt werden alle 2 bis 3 Tagen. Jedoch wird jede einzelne Zelle Linie mit einer anderen Rate wachsen und das Split-Verhältnis muß empirisch ermittelt werden. Pfeile in Abbildung 1B zeigt das typische Erscheinungsbild von MES-Zellen nach Kultivierung auf einem PMEF Feeder-Schicht für 3 Tage. Diese Kolonien sind groß (50-100 um Durchmesser), aber immer noch rund und halten definierte Kantes. In diesem Stadium die Kolonien sind bereit für Differenzierung oder Subkultur. Eine Pfeilspitze in Abbildung 1B zeigt eine kleine Kolonie mES, dass Sie in der Regel finden 24 h nach der Beschichtung. Vier Tage nach dem Ausplattieren, werden mES Zellen überwachsen. Sie zeigen eine abgeflachte Aussehen und den Verlust der definierten Grenzen, was darauf hinweist, dass sie beginnen sich zu differenzieren. Solche Zellen sind nicht optimal für die Differenzierung in neuronale Zellen. MES-Zellen in Motoneuronen zu differenzieren, müssen mES Zellen in Suspension kultiviert werden, um EB Bildung zu ermöglichen. In Schritt 2 werden ES-Zellen auf einer Kulturoberfläche ohne Feeder-Schicht in EB Bildung zu fördern übertragen. In diesem Schritt werden sie in neuronalen Differenzierung Medium mit Noggin, bFGF und FGF-8 für 2 Tage in direkter Zellen eines neuronalen Linie ergänzt inkubiert. Kleine EBs können unter dem Mikroskop an Tag 1 der Differenzierung beobachtet werden. Sie sollten in dem Medium zu schweben. Verschleppung PMEF kann auch am Tag 1 gefunden werdender Differenzierung und müssen entfernt werden. Diese Zellen, um bakterielle Gerichte so beseitigt werden, wenn EBs auf eine neue bakterielle Gericht sind passagiert haften. So, am Tag 2 der Differenzierung, sollte wenige oder keine PMEF in der Kulturschale zu sehen. In Schritt 3 fort Übertragung von EBs zu neuen Gerichten sollte Entfernung jeglichen verbleibenden PMEF zu gewährleisten. EBs sind im Motor Neuron Differenzierung (MND) Medien mit RA ergänzt SAG kultiviert und für 5 Tage, um die Zellen in motorischen Neuronen zu differenzieren. Während der Kultur, weiterhin EBs in der Größe wachsen und kann mit dem bloßen Auge eine Differenzierung Tag 3 ersichtlich ~ 4. 1C zeigt das mikroskopische Bild von EBs auf die Differenzierung Tag 7. Im Gegensatz zu den undifferenzierten Zellen, für EBs starke Fluoreszenz aufgrund der Expression von GFP. Diese EBS sind optimal differenziert und sind bereit für die Dissoziation. Durchflusszytometrie zeigte, dass 51% ± 0,8% der Zellen von der dissoziierten EBs hatte in GFP exprimierenden Zellen differenziert 5. In Schritt 5 Kultur these Motoneuronen in Gegenwart von GDNF, CNTF, BDNF, NT3 und Ergebnisse in Verlängerung der langen Vorsprünge axonalen. 1D zeigt das Aussehen des differenzierten Zellen 2 Tage nach dem Ausplattieren von dissoziierten EBs. Beachten Sie lange Neuriten sich von den Zellkörper der plattierten Zellen. Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass die GFP +-Zellen die pan-neuronalen Marker (Neurofilament-mittlerer Kettenlänge) und zwei Motoneuronen spezifische Marker, (Islet-1 und Cholinacetyltransferase, 2) zu exprimieren. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> Abbildung 1. Differenzierung von MES-Zellen in Motoneuronen (Bild von Wu et al modifiziert. 5). A) Schema der Differenzierung Protokoll von MES-Zellen zu Motoneuronen. B) Undifferenzierte Zellen bilden mES runde Kolonien auf der Oberseite eines Fibroblasten-Feeder-Schicht. Sie haben schwache GFP-Expression. C) MES-Zellen wurden von Feeder-Schichten getrennt und KulturvereineRot auf Low-Befestigung Gerichte zu EBs zu bilden. In den ersten beiden Tagen nach der Differenzierung wurden die Zellen auf 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF und 20 ng / ml FGF-8 ausgesetzt. Anschließend wurden sie bewogen, mit 1 uM Retinsäure und 1 uM Sonic-Hedgehog-Agonist SAG für 5 Tage zu unterscheiden. Differenzierte Zellen exprimiert mES starke GFP-Fluoreszenz. A) Nach dem 7-tägigen Differenzierung wurden EBs dissoziiert und vergoldet auf poly-DL-ornithine/laminin beschichteten Platten. Die differenzierten Zellen verlängert langen neuronalen Prozesse nach 2 Tagen in Kultur. Maßstab = 200 um. MN = motorischen Neurons. B, C und D sind Hellfeld-Bilder und B &#39;, C&#39; und D &#39;sind entsprechende Fluoreszenz-Bildern. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> Abbildung 2. Charakterisierung von MES-cell-derived Motoneuronen. Immunfluoreszenzfärbung für Neurofilament mittlerer Kettenlänge (NF-M, rot), ChAT (rot) und Islet-1 (rot) fiel mit GFP (grün) SuchbegriffMultisession. DAPI (blau) wurde verwendet, um die Kerne zu identifizieren. Balken = 50 um.

<ol><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li>
<li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li>
<li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li>
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<li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li>
<li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Qualität der mES Zellen ist die kritischen Parameter zur effizienten Erzeugung von Motoneuronen. mES Zellen müssen auf PMEF kultiviert werden, um spontane Differenzierung zu verhindern. Die Zugabe von LIF hilft bei der Erhaltung der die MES-Zellen in einem undifferenzierten Zustand. Als MES-Zellen teilen sich alle 12 bis 15 h wurde das Kulturmedium verarmt rasch und muss täglich ersetzt werden. Effiziente Aktivierung des Shh-Weg ist ein kritischer Parameter benötigt, um Motoneuronen Spez...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF Medium </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> mES Medium </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES-Zell-Qualifizierte FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nucleosides </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Neuronale Differenzierung Medium </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cult FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Mono-thio Glycerin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Birne </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND Medium (Differenzierung) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Basal Medium-A </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 Ergänzung </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS Supplement-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07159 </td><td> 5 pg / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Retinsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> EMD Chemicals </td><td> 566660 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND Medium (Motor Neuron Kultur) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Basal Medium-A </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 Ergänzung </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS Supplement-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07159 </td><td> 5 pg / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Nicht anwendbar. Tabelle 1. PMEF und Medien für MES-Zellkultur oder Differenzierung. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;strong&gt; Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 0,1% Gelatine </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornithin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0,1 mg / ml in D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Mauslaminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 pg / ml in PBS </td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin / EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Nicht anwendbar. Tabelle 2. Reagenzien für die Beschichtung und Dissoziation.

effiziente differenzierung von embryonalen stammzellen der maus in motoneuronen

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direkte Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ES)-Zellen in funktionelle Motoneuronen stellt eine viel versprechende Quelle für Krankheiten Mechanismen zu studieren, zu neuer Wirkstoffe zu screenen und zu neuen Therapien für Motoneuronen-Krankheiten wie zum Beispiel Spinale Muskelatrophie (SMA) und Amyotrophe Lateralsklerose entwickeln ( ALS). Viele aktuelle Protokolle verwenden eine Kombination von Retinsäure (RA) und Sonic Hedgehog (Shh) an embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen in Motoneuronen 4.1 differenzieren. Allerdings ist die Effizienz der Differenzierung mES Zellen in Motoneuronen nur mit mäßigem Erfolg erfüllt. Wir haben eine zweistufige Differenzierung Protokoll Nr. 5, das verbessert die Differenzierung Effizienz im Vergleich zu derzeit etablierten Protokollen entwickelt. Der erste Schritt besteht darin, die neuralization durch Zugabe von Noggin und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) erweitern. Noggin ist ein knochenmorphogenetisches Protein (BMP)-Antagonisten und in Neuralinduktion gebracht einach der Standard-Modell der Neurogenese und führt zur Bildung der vorderen neuronalen Strukturieren 6. FGF wirkt synergistisch mit Noggin bei der Induktion von Nervengewebe Bildung durch die Förderung einer hinteren neuronalen Identität 9.7. In diesem Schritt wurden mES Zellen mit Noggin, bFGF und FGF-8 für zwei Tage grundiert werden, um neuronale Differenzierung in Richtung Linien zu präsentieren. Der zweite Schritt besteht darin, Motoneuronen-Spezifikation zu induzieren. Noggin / FGFs ausgesetzt mES Zellen wurden mit RA und einer Shh-Agonisten, Agonisten Smoothened (SAG), für weitere 5 Tage inkubiert, um Motoneuronen Generation zu erleichtern. Um die Differenzierung von MES in die Motor-Neuronen zu beobachten, verwendeten wir eine ES-Zelllinie von einer transgenen Maus exprimiert eGFP unter der Kontrolle des Promotors Motoneuronen Hb9 1 abgeleitet. Mit diesem robusten Protokoll erzielten wir 51 ± 0,8% der Differenzierung Effizienz (n = 3, p &lt;0,01, Student t-Test) 5. Die Ergebnisse der ImmunfluoreszenzFärbung zeigte, dass GFP +-Zellen die Motoneuronen spezifische Marker, Islet-1 und Cholin Acetyltransferase (ChAT) auszudrücken. Unsere Zwei-Schritt-Protokoll Differenzierung bietet eine effiziente Möglichkeit an MES-Zellen in spinalen motorischen Neuronen zu differenzieren.

Wir entwickelten ein neues Protokoll, um die Effizienz der in vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu verbessern. Die differenzierten ES-Zellen erworbenen motorischen Neuronen verfügt wie durch die Expression von neuronalen und motorischen Neurons Marker mit Hilfe von immunhistochemischen Techniken nachgewiesen.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Die direkte Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) in funktionelle Motoneuronen stellt eine vielversprechende Ressource dar, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen, zu screenen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, murine embryonale Stammzellen in Motoneuronen zu differenzieren. Kultivieren Sie zunächst murine embryonale Stammzellen auf primären murinen embryonalen Fibroblasten und ergänzen Sie das Kulturmedium mit Leukämie-Hemmungsfaktor. Anschließend fördern Sie den Differenzierungsprozess durch Zugabe von Noggin, bFGF und FGF8, und induzieren die Spezifikation von Motoneuronen durch Inkubation mit Retinsäure und einem Smoothened-Agonisten, woraufhin die Axonverlängerung und die Reifung der Motoneuronen erfolgt.Verwenden Sie abschließend die Immunfluoreszenzmikroskopie, um differenzierte MES-Zellen zu untersuchen, die eine starke GFP-Fluoreszenz exprimieren. Die Erzeugung großer Mengen von Motoneuronen erleichterte die Forschung zu Motoneuronerkrankungen im Vergleich zu bestehenden derzeitigen Protokollen. Diese Methode zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneurone ist effizienter. Diese Methode kann Einblicke in die spinale Muskelatrophie ermöglichen.Es kann auch auf andere Motoneuronerkrankungen wie die amyotrophe Lateralsklerose angewendet werden. Um primäre embryonale Mausfibroblasten zu plattieren, beschi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben ein kleines Molekül-basiertes Protokoll zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC). Dieses Protokoll erzeugt Olig2 + NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad von 30 Tagen nach Differenzierung. Wir beschreiben eine Methode, die auf "Aufstocken" OPCs, dass Aktionspotentiale Feuer erzeugen kann.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vitro Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) aus embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus. Die mES-Zellen werden in Suspension kultiviert, um Embryoidkörper (EBs) zu bilden, die dann durch Retinsäurebehandlung in einer adhärenten Kultur zur Differenzierung in NPCs geführt werden.

Eine Technik zur Erzeugung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Dieses Video zeigt eine Methode zur Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) des Rückenmarks in Motoneuronen. Es beschreibt den Kultivierungsprozess der NPCs auf einer beschichteten Kulturplatte unter Verwendung spezieller Medien, die mit spezifischen Inhibitoren angereichert sind, um die NPC-Differenzierung in reife Motoneuronen zu erleichtern.

Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen des Rückenmarks in Motoneuronen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Differenzierung embryonaler Stammzellen in eine vernetzte Population von Neuronen mit funktionierenden Synapsen. Es werden die Schritte beschrieben, die an der Differenzierung embryonaler Stammzellen in Neuronen, der Induktion der Bildung neuronaler Netzwerke und der Anreicherung der Kultur mit vernetzten Neuronen beteiligt sind.

Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus zu einer vernetzten Neuronenpopulation

Dieses Video zeigt den Prozess der Differenzierung menschlicher iPSCs in Motoneuronen. Die Begründung beinhaltet die Verwendung von iPSCs, die genetisch verändert wurden, um bestimmte Transkriptionsfaktoren zu exprimieren. Wenn dieses Antibiotikum in einem Medium kultiviert wird, das Doxycyclin enthält, löst es die Expression von Transkriptionsfaktoren aus und fördert dadurch die Differenzierung von iPSCs in Motoneuronen-Vorläuferzellen. Letztendlich werden die Vorläuferzellen in einem...

Differenzierung von künstlich hergestellten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in funktionelle Motoneuronen

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Methode zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen unter Verwendung einer serumfreien Monolayer-Methode. Diese Vorläuferzellen können verwendet werden, um reife neuronale Zelltypen abzuleiten oder den Prozess der neuronalen Spezifikation zu untersuchen, und sind für die Skalierung im Multiwell-Format für das Screening von Verbindungen zugänglich.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Umwandlung von induzierten pluripotenten Stammzellen in motorische Neuronen mit einer Wirbelsäulen-oder Schädelidentität, indem es die Transkriptionsfaktoren von induzierbaren PiggyBac-Vektoren ausführt.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Erfahren Sie die effiziente Differenzierung von embryonalen Mausstammzellen in Motoneuronen. Dieses Protokoll nutzt Retinsäure und spezifische Wachstumsfaktoren zur Generierung großer Zellmengen für die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

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