Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kortikale Interneuron-Vorläuferzellen in postmitotischen Interneuronen-Vorläufern für embryonale Stammzellen der Maus unter Verwendung einer modifizierten Embryoidkörper-Monolayer-Methode zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie Subtypen kortikaler Interneurone während der Entwicklung ihr individuelles Schicksal erreichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine effiziente Generierung von Nkx2.1-exprimierenden Interneuronen-Vorläuferzellen sowie Methoden zur Anreicherung von Parvalbumin- oder Somatostatin-Interneuronen-Untergruppen ermöglicht.

Um dieses Verfahren zu beginnen, werden mitotisch inaktive MEF-Feederzellen in MEF-Medien auf mit Gewebekulturen behandelte Platten aufgefüllt. Lassen Sie sie mindestens 12 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius absetzen, bevor Sie die mESCs plattieren. Wenn Sie das MEF-Medium nicht sofort verwenden, tauschen Sie es alle drei Tage aus.

Als nächstes fügen Sie den MEF-Platten mES-Zellen hinzu, die einen Maus-Leukämie-Hemmfaktor enthalten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Passage von mES-Zellen mit Trypsin-EDTA, sobald die Schale zu 70 bis 80 % konfluent wird, und Aufrechterhaltung der mES-Zellen auf einer MEF-Feeder-Schicht in mESC-Medien, um die Pluripotenz zu erhalten.

Bevor Sie mit der Differenzierung beginnen, passieren Sie die Zellen mindestens einmal auf gelatinebeschichtete Platten ohne MEFs, um sie zu verdünnen. Bereiten Sie dazu mit Gelatine beschichtete Platten vor, indem Sie 0,1 % Gelatine und PBS mit Kalzium und Magnesium in eine mit Gewebekultur behandelte Schale geben und mindestens 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Platten Sie 1,5 bis zweimal 10 bis die sechsten Zellen auf jeder zehn Zentimeter großen Platte und lassen Sie sie zwei Tage lang expandieren, bevor Sie mit der Differenzierung beginnen.

Nachdem die mES-Zellen auf den mit Gelatine beschichteten Platten zwei Tage lang gewachsen sind, wird auf DD0 das Medium aspiriert und die Zellen einmal mit PBS ohne Kalzium und Magnesium gewaschen. Fügen Sie dann so viel Trypsin-EDTA hinzu, dass die Oberfläche der Platten bedeckt ist. Und legen Sie die Zellen wieder für vier Minuten bei 37 Grad Celsius in den Inkubator.

Nach vier Minuten wird Trypsin-EDTA mit dem Doppelten seines Volumens an mESC-Medien abgeschreckt. Übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen geeigneter Größe und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200-mal g. Entfernen Sie anschließend das Rohr und saugen Sie das Medium an, ohne das Pellet zu stören.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter KSR-N2-Medium. Messen Sie anschließend die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Beginnen Sie mit der Züchtung der Zellen als Embryoidkörper, indem Sie 75.000 Zellen pro Millileter in KSR-N2-Medien in die nicht adhärenten Gewebekulturschalen geben.

Und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie sich auf DD1 auf die Zelllandung vor, indem Sie die mit Gewebekulturen behandelten Schalen mindestens eine Stunde lang oder über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Poly-L-Lysin beschichten. An DD2 aspirieren Sie das Poly-L-Lysin und beschichten die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Laminin.

Bei DD3 vor Beginn der EB-Dissoziation Laminin aspirieren und die Platten in einer Gewebekulturhaube vollständig trocknen lassen. Übertragen Sie anschließend die EBs mit dem Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie drei bis vier Minuten lang bei 15-mal g oder bis die EBs pelletiert sind. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie drei Milliliter Zellablösung, die DNase enthält, hinzu.

Inkubieren Sie die Probe dann 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Schnippen Sie alle drei Minuten vorsichtig mit dem Schlauch, um die EB-Dissoziation zu unterstützen. Sobald die EBs nicht mehr sichtbar sind oder 15 Minuten verstrichen sind, fügen Sie sechs Milliliter KSR-N2 hinzu, das DNase enthält, und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 mal g.

Dann plattieren Sie die Zellen in KSR-N2, die LDN193189, XAV939 und den ROCK-Inhibitor, Y27632, enthalten, bei 4,5 bis fünf mal zehn bis vier Zellen pro Quadratzentimeter. Wechseln Sie unter DD5 den Datenträger durch KSR-N2, der FGF2, IGF1 und SSH enthält. Bereiten Sie als Nächstes Gewebekulturplatten für die Neubeschichtung an Tag 8 vor, wobei Sie die Anweisungen in den Verfahren zu DD1 und DD2 befolgen.

Tauschen Sie auf DD7 das Medium durch KSR-N2 aus, das FGF2, IGF1 und SHH enthält. Auf DD8 beschichten Sie die Zellen neu, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Trypsin-EDTA von den Platten lösen. Quenden Sie Trypsin-EDTA mit dem Doppelten seines Volumens mit KSR-N2.

Und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 mal g. Filtern Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Filterrohr, um Klumpen zu entfernen. Dann beschichten Sie die Zellen mit 250.000 Zellen pro Quadratzentimeter in N2-KSR, das FGF2, IGF1 und Y27632 enthält, mit SHH.

Tauschen Sie auf DD10 das Medium durch KSR-N2 aus, das SHH enthält. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Kalzium und Magnesium und fügen Sie den Zellen ein vorgewärmtes, nicht Trypsin enthaltendes Zelldissoziationsreagenz hinzu, das DNase enthält. Legen Sie sie für 10 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in den Inkubator oder bis sich die Zellen abgelöst haben.

Klopfen Sie dann alle fünf Minuten vorsichtig auf die Platten, um die Dissoziation zu unterstützen. Tauschen Sie auf DD5 das Medium durch KSR-N2 aus, das FGF2 und IGF1 enthält. Bereiten Sie als Nächstes Gewebekulturplatten für die Neubeschichtung auf DD8 vor.

Tauschen Sie auf DD7 das Medium durch KSR-N2 aus, das FGF2 und IGF1 enthält. Auf DD8 werden die Zellen mit einem geglätteten Agonisten neu beschichtet und ein atypischer PKC-Inhibitor hinzugefügt. Tauschen Sie auf DD10 das Medium durch KSR-N2 aus, das aPKCi enthält.

Trennen Sie bei DD11 die Zellen von den Platten für FACS. Wenn die Zellen für FACS auf DD11 nicht abgetrennt wurden, wechseln Sie das Medium an DD12 durch KSR-N2, das aPKCi enthält. Tauschen Sie auf DD14 das Medium durch KSR-N2 aus, das aPKCi enthält.

Und auf DD16 tauschen Sie das Medium durch KSR-N2 aus, das aPKCi enthält. Sammeln Sie dann auf DD17 die Nkx-2.1:mCherry-positiven Zellen. Hier sind die repräsentativen Bilder der Immunfärbung für Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry und Lhx6:GFP aus einer Differenzierungskultur am Tag 12 zu sehen.

Beachten Sie, dass es sich bei diesen Bildern um überlappende Kanäle aus demselben Sichtfeld handelt. Dieses Diagramm zeigt die Quantifizierung des durchschnittlichen Prozentsatzes von DAPI-positiven Kernen, die Nkx2.1 an DD12 in Kultur exprimieren. Und dies ist ein repräsentatives FACS-Diagramm, das die vier verschiedenen Zellpopulationen zeigt, die mit unserer Dual-Reporter-mESC-Linie isoliert werden können.

Beachten Sie, dass sich mCherry auf der x-Achse und GFP auf der y-Achse befindet. Das obere rechte Feld stellt also Zellen dar, die mCherry-GFP doppelt positiv sind. Hier ist der Zeitverlauf der Induktion von Nkx2.1:mCherry und Lhx6:GFP von DD6 bis 16, ausgedrückt als Prozentsatz der Zellen in Kultur, die entweder nur mCherry, nur GFP exprimieren oder mCherry-GFP co-exprimieren.

Sobald dieses Protokoll gemeistert ist, kann es innerhalb von 17 Tagen von Anfang bis Ende abgeschlossen werden, wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, immer mit pleuripotenten, undifferenzierten, gesund aussehenden Stammzellen zu beginnen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie die Transplantation in neonatale oder adulte Maus-Neokortex, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Bestimmung des Schicksals von Interneuronen oder zur Wirkung der Interneuronentransplantation auf die Funktion von Schaltkreisen und das Verhalten von Tieren zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsneurowissenschaften, um Faktoren zu erforschen, die das Schicksal von Interneuronen bei Mäusen und damit auch bei Patienten beeinflussen, die von interneuronalen Störungen betroffen sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Nkx2.1-exprimierende Vorläuferzellen und ihre postmitotischen Nachkommen aus embryonalen Stammzellen der Maus ableiten können. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.