Name: Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung von Maus-embryonalen Stammzellen in kortikale Interneuron-Vorstufen mit einer modifizierten Embryoidkörper-Monolayer-Methode. Diese Technik ermöglicht die effiziente Generierung von Nkx2.1-exprimierenden Progenitoren für neurobiologische Forschung und therapeutische Anwendungen.

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Wir sind dankbar, Qing Xu für die Entwicklung der Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual Reporter mESC Linie und Jennifer Tyson, Asif Maroof, sowie Tim Petros für ihre frühen Arbeiten zu helfen, dieses Protokoll zu entwickeln. Wir danken auch den CHOP Flow Cytometry Kern für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 MH066912 (SA) und F30 MH105045-02 (DT) unterstützt.

Hinweis: Die dual Reporter mESC Linie beschrieben in diesem Protokoll sind auf Anfrage möglich (sande@mail.med.upenn.edu).
(1) Media-Vorbereitung
Hinweis: Warm alle Medien auf 37 ° C vor der Verwendung in der Zellkultur.
<ol><li>
Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) Medien (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>449 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) und Filter durch eine Filteranlage 500 mL 0,22 µm Pore 50 mL fetalen bovine Serum (FBS) hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
N2-Medien (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>Geben Sie 5 mL L-Alanin-L-Glutamin (100 X) und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) bis 489,5 mL DMEM: Nährstoff-Mischung f-12 (DMEM/F-12) und Filter durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) und 5 mL N2 Anhang-B nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 1 Monat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Serumfreien Wachstumsmedium (KSR) (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>Fügen Sie 75 mL serumfreien Medium Ergänzung, 5 mL L-Glutamin (100 X), 5 mL MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA) (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maus embryonalen Stammzellen Medien (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>75 mL Stammzellen Grade FBS, 5 mL MEM-NEAA hinzufügen (100 X), 5 mL L-Glutamin (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kultivierung mESCs
<ol><li>Platte mitotically inaktiven MEF Feeder Zellen in MEF Medien auf Gewebekultur behandelt Teller mit 3-4 x 104 Zellen/cm2. Lassen Sie mindestens 12 Stunden für sie in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 Regeln vor der Beschichtung der mESCs. Wenn nicht sofort verwendet wird, ersetzen Sie die MEF-Medien alle 3 Tage. Entsorgen Sie MEFs, wenn nicht innerhalb von 7 Tagen nach der Beschichtung verwendet.</li>
	<li>MEF-Platten in mESC Medien Maus Leukämie hemmenden Faktor (mLIF) (1.000 U/mL) mit fügen Sie mESCs (Dichteumfang von 1-4 x 104 Zellen/cm2 hinzu). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.</li>
	<li>Durchgang mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) mESCs (1:5-1:10) Sobald das Gericht wird ~ 70-80 % Zusammenfluss oder wenn die Kolonien beginnen zu berühren. Dies in der Regel erfolgt alle 2 Tage, aber kann bis zu 4 oder 5 Tage, je nach der anfänglichen Beschichtung Dichte nehmen.</li>
	<li>Pflegen Sie die mESCs auf einem MEF Feeder Layer mESC Mittel-und Pluripotenz zu halten.</li>
	<li>
Vor Beginn der Differenzierung, die passage der Zellen mindestens einmal auf Gelatine beschichtete Platten ohne MEFs, die MEFs zu verdünnen.
	<ol>
<li>Bereiten Gelatine beschichtete Platten durch Zugabe von 0,1 % Gelatine in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 +/Mg2 + zu einem Gericht Gewebekultur behandelt und bei 37 ° C für mindestens 1 h Platte 1,5-2 x 106 Zellen/10 cm Platte verlassen (2,7 bis 3,6 x 104 Zellen/cm2) und lassen Sie die Zellen, für 2 Tage vor Beginn der Differenzierung zu erweitern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mESCs in Richtung MGE-ähnliche Teleenzephalischer Stammväter Differenzierung
<ol><li>
Differenzierung-Tag (TT) 0 = "float Zellen"
	<ol>
<li>Nachdem die mESCs gewachsen sind, auf Gelatine beschichtete Platten für 2 Tage, aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie genügend Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) bedecken die Oberfläche der Platte (in der Regel 4 mL Trypsin-EDTA für eine 10 cm Gewebekultur Teller), und legen Sie die Zellen wieder in den Brutschrank bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 4 min.</li>
		<li>Stillen Sie nach 4 min die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit mESC Medien. Die Zellen auf eine entsprechend dimensionierte Zentrifugenröhrchen übertragen und die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie nach 5 min das Rohr und aspirieren Sie die Medien ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen das Pellet in 1 mL KSR:N2 Medien (1:1) mit der BMP-Inhibitor LDN-193189 (250 nM) und der Wnt-Inhibitor XAV-939 (10 µM).</li>
		<li>Messen Sie die Zellkonzentration unter Verwendung eines Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler. Start wachsenden Zellen als Embryoid Körper (EBs) durch Zugabe von 75.000 Zellen/mL in KSR:N2 Medium (1:1) mit LDN-193189 (250 nM) und XAV-939 (10 µM) in Gewebekultur-anhaftende Gerichte. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am DD1 bereiten Sie für Zelle "Landung" durch Beschichtung Gewebekultur behandelt Gerichte mit Poly-L-Lysin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) über Nacht (O/N) bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte oder mindestens 1 h.</li>
	<li>DD2, Aspirieren der Poly-L-Lysin und Beschichten der Platten mit Laminin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) O/N bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit. Hinweis: Während O/N optimal ist, weniger als 2 h kann ausreichend sein. Wenn Platten nicht am nächsten Tag verwendet werden, Aspirieren Laminin, ersetzen mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.</li>
	<li>
DD3 ("land Zellen")
	<ol>
<li>Vor Beginn der EB Dissoziation, Aspirieren der Laminin und die Platten trocken in einer Gewebekultur-Haube. Verwenden Sie keine Platten, die glänzende oder sichtbar nass erscheinen. Übertragen Sie die EBs mit Medien in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 3-4 min 15 x g oder bis der EBs haben oelletiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie die Medien und 3 mL Zelle Ablösung Lösung mit DNase (2 U/mL) und Inkubation bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte und 5 % CO2 für 15 min. sanft flick das Rohr alle 3 min um EB Dissoziation zu erleichtern.</li>
	<li>Sobald der EBs sind nicht mehr sichtbar oder 15 Minuten vergangen sind, fügen Sie 6 mL KSR:N2 (1:1) mit DNase (1 U/mL) und Zentrifuge für 5 min bei 200 X g.</li>
	<li>Die Zellen in KSR:N2 (1:1) mit LDN-193189 Platte (250 nM), XAV-939 (10 µM), und der ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 µM) bei 4,5-5 x 104 Zellen/cm2.</li>
</ol>(4) SST-Anreicherung Protokoll: "DD12 GFP hohe Sonic Hedgehog (SHH)" (Fortsetzung von Schritt 3,7)
<ol><li>Ändern Sie auf DD5, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SSH (50 ng/mL).</li>
	<li>Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder am Tag 8 (Schritt 4.4) Beschichtung mit in Schritte 3.2-3.3 aufgeführten Anweisungen.</li>
	<li>Ändern Sie auf DD7, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Auf DD8 Platte wieder die Zellen. Hinweis: Während dieser Schritt nicht notwendig ist, kann wieder galvanischen Zellen frühen differenziert, unerwünschte Zelltypen reduzieren. Re Beschichtung auch Kugeln aus Zellen, die die nachgelagerten immunhistochemische Analysen erschweren bricht, und erhöht die Effizienz der FACS zu späteren Zeitpunkten.<ol>
<li>Neu Platte Zellen, die Zellen von der Platte mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) für 5 min bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2zu lösen. Die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit KSR:N2 zu stillen und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min. filtern die Zellen durch einen 40 µm Filter Schlauch, Klumpen zu entfernen. Platte wieder die Zellen bei 250.000 Zellen/cm2 N2/KSR (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und Y-27632 (10 µM) mit SHH (50 ng/mL). Hinweis: Wenn stattdessen die Entscheidung getroffen wird, nicht auf die Zellen auf DD8 Re Platte wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL) alle 2 Tage ab DD7, DD12 und IGF-1 hinzufügen (20 ng/mL) und FGF-2 (10 ng/mL) bis DD9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auf DD10, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Auf DD12, um Zellen zu erhalten, die für SST Untertypen angereichert sind, verwenden FACS, um Lhx6::GFP zu isolieren-Zellen nur zum Ausdruck zu bringen.
	<ol>
<li>Um die Zellen zu entfernen, verwenden Sie eine nicht-Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz als Trypsin-EDTA. Waschen Sie Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie vorgewärmt nicht Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz mit DNase (2 U/mL) auf die Zellen. Legen Sie sie in den Inkubator bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 10-30 Minuten oder bis die Zellen getrennt haben. Klopfen Sie leicht die Platten alle 5 min um die Dissoziation zu unterstützen. Hinweis: Für DD11-12 Kulturen kann nur 10-15 Minuten erforderlich sein. Für DD15-16 Kulturen kann 30 Minuten oder mehr für vollständige Dissoziation erforderlich.</li>
		<li>Sobald die Zellen komplett von der Platte gehoben haben, fahren Sie mit FACS Isolierung unter Verwendung von standard-Protokollen oder verwenden Sie die Zellen in anderen nachgeschalteten Analysen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PV-Anreicherung Protokoll: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (Fortsetzung von Schritt 3,7)
<ol><li>Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder Beschichtung auf DD8 (Schritt 4.4) mit die Anweisungen gemäß 3.2-3.3 Schritte.</li>
	<li>Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Auf DD8, neu Platte Zellen wie unter Schritt 4.4 mit folgenden Ausnahmen: Wenn die Zellen neu Plattieren, SHH mit gespachtelten Agonist zu ersetzen (SAG; 30 nM) und atypische PKC-Hemmer (aPKCi; 2 µM) hinzufügen. Zusammengenommen, die erneut Galvanik Medien jetzt N2/KSR (1:1) enthält FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM), und aPKCi (2 µM).</li>
	<li>Auf DD10 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM).</li>
	<li>
DD11 Hinweis: an dieser Stelle sind Nkx2.1::mCherry+ Zellen angereichert um PV CIns zu werden.<ol>
<li>Trennen Sie die Zellen aus der Platte für FACS verwenden das gleiche Protokoll in Schritt 4.6 beschrieben. Wenn die Entscheidung getroffen wird, um Nkx2.1::mCherry+ Zellen an einem späteren Tag Differenzierung zu sammeln, ignorieren Sie diesen Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auf DD12 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD14 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD16 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Sammeln Sie auf DD17 die Nkx2.1::mCherry+ Zellen unter Verwendung des gleichen Protokolls in Schritt 4.6 beschrieben.</li>
</ol>(6) PV-Anreicherung Protokoll: "DD17 mCherry Low SHH" (Fortsetzung von Schritt 3,7)
<ol><li>Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL). Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>
Auf DD9 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1). Ab diesem Zeitpunkt sind keine zusätzliche Wachstumsfaktoren notwendig.
	<ol>
<li>Weiterhin die Medien alle 2 Tage bis zur Ernte der Zellen auf DD17 ändern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).</li>
<li>Blahos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+site+on+the+Galpha+-protein+that+recognizes+heptahelical+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors.</a> J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während diese Methode ist sehr effektiv bei der Musterung J1 abgeleitet mESCs (SCRC-1010), erlebten wir Variablen Erfolg mit anderen mESC Linien und klonale Isolate. Zum Beispiel, Foxg1::venus mESCs (EB3 abgeleitet; Danjo Et al. 13) reagieren schlecht auf dieses Protokoll und Foxg1 Induktion durch DD12 ist in der Regel in der Größenordnung von 1 %-2 %. Aus Gründen, die wir nicht vollständig verstehen, produziert ein weiteres Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter Klon (genannt JQ59), die...

Bei Mäusen und Menschen, rund die Hälfte aller kortikalen hemmenden Interneuronen (CIns) stammen im Rahmen einer vorübergehenden subkortikale Struktur bekannt als mediale ganglionic Eminenz (MGE), wo neuroepithelialer Vorfahren der CIns und anderen neuronalen und Gliazellen Untergruppen Ausdrücken der Transkriptionsfaktor Nkx2.11,2. CIn Untergruppen oder Subtypen sind durch sich überschneidende morphologische, neurochemische, elektrophysiologische und Konnektivität Merkmale3,4definiert. MGE-abgeleitete CIns in gruppiert werden können meist nicht überlappende Untergruppen basierend auf ihren Ausdruck der PV oder SST, der Ausdruck der welche korreliert mit bestimmten elektrophysiologische und Konnektivität Tendenzen5. Dysfunktion von Interneuronen, insbesondere in der PV-Untergruppe hat in mehreren-neuropsychiatrischen Störungen und Krankheiten6,7verwickelt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, mitotischen Vorläuferzellen Stammzellen abgeleitet und wandernden Vorstufen für PV oder SST CIn Schicksal für kortikale Interneuron Biologie zu studieren und für den Einsatz in zellbasierten Therapien angereichert zu produzieren.
Wir haben eine skalierbare und hocheffiziente Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen von mESCs entwickelt. Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Zeile8, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6 exprimierenden Post-mitotischen Nachkommen über FACS isoliert und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet werden können. Durch die Manipulation einer Anzahl der Signalwege, Dauer der Kultur und Modus der Neurogenese, erhalten wir Millionen von Eindringmittel beschrifteten Interneuron Vorstufen für eine Vielzahl von downstream-Anwendungen geeignet.
Obwohl einige andere Methoden gibt es zur Erzeugung von MGE-ähnlichen Vorfahren aus mESCs9,10,11,12,13,14, unsere Methode, die stützt sich auf die Wnt Antagonist XAV-939 ist besonders effizient zu generieren Foxg1/Nkx2.1 Co Teleenzephalischer Vorfahren zum Ausdruck zu bringen. Stark erhöht die Fähigkeit, für Interneuron Stammväter oder Post-mitotischen Lhx6 exprimierenden Nachkommen über unser dual Reporter-System wählen die Fähigkeit, verschiedene Vorfahren und deren Nachkommen zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td></td><td>Corning</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzglas mit Zellsieb und Schnappverschluss</td><td>ThermoFisher</td><td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>Maus embryonale Fibroblasten (CF-1 MEF IRR 7M)</td><td>MTI-Globalstem</td><td>GSC-6101G</td><td>1 Fläschchen mit 7M MEFs ist ausreichend für vier 10-cm-TC-Platten. Referenzen: 29,35</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-2</td><td>Auch als antimikrobielles Mittel bekannt. Nicht mit Basismedien filtern, sondern nach der Filtration hinzufügen. Referenzen: 9,11,36,37</td></tr><tr><td>N2 supplement-B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7156</td><td>Nicht mit Basismedien filtern -- hinzufügen nach der</td></tr><tr><td>Filtration Glutamax (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>Auch bekannt als L-Alanin-L-Glutamin. Referenzen: 9,11,38,39</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>ThermoFisher</td><td>10828028</td><td>Auch bekannt als serumfreies Medium. Referenzen: 9,11</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>ThermoFisher 10829018</td><td></td><td>Auch bekannt als nicht-glutaminhaltiges DMEM. Referenzen: 9,11</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>VWR</td><td>82013-578</td><td>Auch bekannt als Stammzell-FBS. Referenzen: 9,11</td></tr><tr><td>Mit Gewebekulturen behandelte Schale (10cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Nicht adhärente sterile Petrischale (10cm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Leukämie-Hemmfaktor (mLIF)</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Nicht einfrieren, bei 4 °C lagern. Referenzen: 9,11</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>0,1% Gelatinelösung</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-999-027</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Auch bekannt als nicht-Trypsin-haltiges Zelldissoziationsreagenz. Referenzen: 9,11</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>Resuspendierung in DMSO und Lagerung bei -80'C in Einmal-Aliquots</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Stemgent</td><td>04-0046</td><td>Resuspendierung in DMSO und Lagerung bei -80'C in Einweg-Aliquots</td></tr><tr><td>rhFGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>Resuspend in PBS mit 0,1 % BSA und Lagerung bei -80'C in Einweg-Aliquoten</td></tr><tr><td>rhIGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>291-G1</td><td>Resuspendierung in PBS mit 0,1 % BSA und Lagerung bei -80'C in Einmal-Aliquoten ROCK-Inhibitor</td></tr><tr><td>(Y-27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Resuspendierung in DMSO und Lagerung bei -80'C in Einmal-Aliquoten</td></tr><tr><td>Geglätteter Agonist (SAG)</td><td>Millipore</td><td>566660-1MG</td><td>Resuspendierung in H20 und Lagerung bei -80'C in Einmal-Aliquoten</td></tr><tr><td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td><td>R& D Systems</td><td>464-SH-025</td><td>Resuspendierung in PBS mit 0,1 % BSA und Lagerung bei -80'C in Einmal-Aliquoten</td></tr><tr><td>PKC&zeta; Pseudosubstrat-Inhibitor, myristoyliertes</td><td>EMD-Millipore</td><td>539624</td><td>In H20 resuspendieren und bei -80 °C in Einmal-Aliquoten lagern</td></tr></tbody></table>

differenzierung der embryonalen stammzellen der maus in kortikalen interneuron vorstufen

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Kortikale GABAergen Interneuronen sind eine heterogene Bevölkerung der Zellen, die kritische Rollen bei der Regelung des Ausgang des exzitatorischen pyramidale Neuronen sowie synchronisieren die Ausgänge der pyramidalen Neuron Ensembles spielen. Defizite im Interneuron Funktion haben in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Autismus und Epilepsie verwickelt. Die Ableitung der kortikale Interneurone aus embryonalen Stammzellen nicht nur für das Studium ihrer Entwicklung und Funktion ermöglicht, sondern bietet einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Pathogenese der kortikalen Interneuron-Erkrankungen. Interneuronen haben auch die bemerkenswerte Fähigkeit, überleben, Migration und Integration in Host kortikalen Schaltung nach Transplantation, so dass sie ideale Kandidaten für den Einsatz in zellbasierten Therapien. Hier präsentieren wir Ihnen eine skalierbare, hocheffiziente, modifizierte Embryoid Körper-Monolayer-Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs). Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Linie, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6-mit dem Ausdruck nach dem mitotischen Nachkommen isoliert über Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet. Wir bieten auch Methoden bereichern Parvalbumin (PV) oder Somatostatin (SST) Interneuron Untergruppen, die für das Studium Aspekte des Schicksal Bestimmung oder für den Einsatz in therapeutischen Anwendungen möglicherweise hilfreich, die von Interneuron Untergruppe angereicherte profitieren würde Transplantationen.

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen ist eine modifizierte Version von unseren veröffentlichten Protokolle15,16,17 und wurde für den Einsatz mit unseren Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP Dual-Reporter mESC optimiert. Durch das Hinzufügen der Wnt-Inhibitors XAV-939 DD0-5, kombiniert mit neu bei DD8 Beschichtung, erreichen wir robuste Nkx2.1 Induktion, wobei mehr als 50 % der alle DAPI + Kerne in...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kortikale Interneuron-Vorläuferzellen in postmitotischen Interneuronen-Vorläufern für embryonale Stammzellen der Maus unter Verwendung einer modifizierten Embryoidkörper-Monolayer-Methode zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie Subtypen kortikaler Interneurone während der Entwicklung ihr individuelles Schicksal erreichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine effiziente Generierung von Nkx2.1-exprimierenden Interneuronen-Vorläuferzellen sowie Methoden zur Anreicherung von Parvalbumin- oder Somatostatin-Interneuronen-Untergruppen ermöglicht.Um dieses Verfahren zu beginnen, werden mitotisch inaktive MEF-Feederzellen in MEF-Medien auf mit Gewebekulturen behandelte Platten aufgefüllt. Lassen Sie sie mindestens 12 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius absetzen, bevor Sie die mESCs plattieren. Wenn Sie das MEF-Medium nicht sofort verwenden, tauschen Sie es alle drei Tage aus.Als nächstes fügen Sie den MEF-Platten mES-Zellen hinzu, die einen Maus-Leukämie-Hemmfaktor enthalten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung von neuroprecursors aus den Entwicklungsländern Kortex embryonaler Mäuse verwendet. Das Verfahren zur Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter, sezieren die kortikale Gewebe und verdauen die isolierten Hirnrinde dargestellt.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Wir beschreiben ein kleines Molekül-basiertes Protokoll zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC). Dieses Protokoll erzeugt Olig2 + NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad von 30 Tagen nach Differenzierung. Wir beschreiben eine Methode, die auf "Aufstocken" OPCs, dass Aktionspotentiale Feuer erzeugen kann.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Wir entwickelten ein neues Protokoll, um die Effizienz der in vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu verbessern. Die differenzierten ES-Zellen erworbenen motorischen Neuronen verfügt wie durch die Expression von neuronalen und motorischen Neurons Marker mit Hilfe von immunhistochemischen Techniken nachgewiesen.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Dieses Video zeigt die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) direkt in neurale Vorläuferzellen, ohne dass Feeder-Zellen oder Zwischenschritte verwendet werden. Die selektive Hemmung des Signalwegs des knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) und des transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGF-β) führt zur Differenzierung der hES-Zellen in neurale Vorläuferzellen (NPCs).

Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in neurale Vorläuferzellen

Dieses Video stellt eine Methode zur Generierung von kortikalen Interneuronen-Vorläufern aus embryonalen Stammzellen der Maus vor. Das Protokoll beinhaltet die Kultivierung der Stammzellen in Medien, die spezifische niedermolekulare Inhibitoren enthalten, die die Proliferation und Aggregation von Stammzellen zu embryoiden Körpern (EBs) erleichtern. Anschließend werden die EBs mit Enzymen dissoziiert und auf Kulturplattenvertiefungen plattiert, die mit Adhäsionsproteinen beschichtet sind, um...

Generierung kortikaler Interneuronen-Vorläufer aus embryonalen Stammzellen der Maus

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vitro Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) aus embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus. Die mES-Zellen werden in Suspension kultiviert, um Embryoidkörper (EBs) zu bilden, die dann durch Retinsäurebehandlung in einer adhärenten Kultur zur Differenzierung in NPCs geführt werden.

Eine Technik zur Erzeugung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Das Video zeigte eine Zellkulturmethode zur Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Neuronen. Durch die Inkubation von Zellen in einem nährstoffreichen Medium, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt wurde, reiften die Vorläuferzellen zu Neuronen mit entwickelten Axonen und Dendriten. Ein Stabilisierungsmittel sicherte die Lebensfähigkeit der Zellen und schützte vor oxidativen Schäden während des gesamten Differenzierungsprozesses.

Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Neuronen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Differenzierung embryonaler Stammzellen in eine vernetzte Population von Neuronen mit funktionierenden Synapsen. Es werden die Schritte beschrieben, die an der Differenzierung embryonaler Stammzellen in Neuronen, der Induktion der Bildung neuronaler Netzwerke und der Anreicherung der Kultur mit vernetzten Neuronen beteiligt sind.

Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus zu einer vernetzten Neuronenpopulation

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Methode zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen unter Verwendung einer serumfreien Monolayer-Methode. Diese Vorläuferzellen können verwendet werden, um reife neuronale Zelltypen abzuleiten oder den Prozess der neuronalen Spezifikation zu untersuchen, und sind für die Skalierung im Multiwell-Format für das Screening von Verbindungen zugänglich.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Erfahren Sie die Differenzierung von Maus-embryonalen Stammzellen in kortikale Interneuron-Vorstufen mit einer modifizierten Embryoidkörper-Monolayer-Methode. Diese Technik ermöglicht die effiziente Generierung von Nkx2.1-exprimierenden Progenitoren für neurobiologische Forschung und therapeutische Anwendungen.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

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