טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להאיץ את ניתוח ההתמיינות העצבית של תאי אב עצביים אנושיים שגודלו בסביבה תלת מימדית. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של התאים במטריצה הטהורה של הידרוג'ל המבוססת על פפטיד בהרכבה עצמית. לאחר מכן, התאים משתחררים מהפיגומים התלת מימדיים.

בשלב השלישי מתבצעת צביעה חיסונית פיטוכימית של התאים בשלב האחרון. התאים נספרים על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את קצב ההתמיינות העצבית או את קצב האפופטוזיס באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה עבור סמנים עצביים או אפופטוטיים בהתאמה.

בטכניקה זו, כימות ההתמיינות העצבית מהיר בהרבה ונתוני ה-Optane מערבה בבסיס רחב יותר וטכניקות צילום מיקרו להטמעת תאים במטריצה הטהורה במקום הראשון כיסוי זכוכית מעוקר בקוטר 13 מילימטר מחליק לכל אחת משתי בארות של צלחת תרבית תאים של ארבע בארות. לאחר מכן אחסן את הצלחת על ספסל נקי לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, נתק את תאי האב העצביים האנושיים או H NPCs על ידי הוספת 2.5 מיליליטר טריפסין טרי.

בנזון תמיסה לצלחת התרבות ודגירה של תרחיף התאים ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. לאחר חמש דקות, עצור את התגובה עם מעכב טריפסין בנזון תמיסה. לאחר מכן, לאחר סיבוב התאים המנותקים ב-3000 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, יש להשעות את הגלולה המתקבלת בחמישה מיליליטר של תמיסת סוכרוז של 10%, ולאחר מכן לשטוף את תרחיף התאים באותם תנאי צנטריפוגה.

לאחר השלכת ה-snat Resus, השעו את הגלולה בתמיסת הסוכרוז לריכוז תאים סופי של אחד כפול 10 עד התאים השישיים למיליליטר. עכשיו במהירות האפשרית, מערבבים 60 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם תמיסה אחת, מעבירים 120 מיקרוליטר מהתרחיף הזה לצינור החרוטי עם תמיסה שתיים ומערבבים בזהירות ואז מיד מניחים 100 מיקרוליטר מהתערובת על כל אחת מהחלקות הכיסוי בצלחת ארבע הבארות. לבסוף הוסף לאט לאט 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים לכל באר.

לאחר שתיים-שלוש דקות, הוסף עוד 200 מיקרוליטר של אמצעי תרבית תאים לבארות והתחל את ההרכבה העצמית של המטריצה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה על האזור המחומם של הספסל הנקי שלכם. הימנע מהזזת צלחת תרבית התאים ככל האפשר לאחר הרכבת המטריצות השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להסיר את רוב המדיה אך לא את כולה כדי למנוע התייבשות של המטריצות .

לאחר מכן שטפו את המטריצות עם 500 מיקרוליטר מדיה טרייה למשך 10 דקות. לבסוף, הסר את אמצעי הכביסה. הוסף עוד 500 מיקרוליטר מדיה והניח את צלחת התרבות בחממה.

אם אפשר. אחסן את המטריצות בחממה משלהן כדי למנוע טלטול מקרי של המבנים ביום הראשון של ניסוי הצביעה. הסר את המדיה מהמטריצות בעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר ולאחר מכן שטוף את הפיגומים עם PBS פעם אחת למשך חמש דקות.

לאחר מכן הסר את ה- PBS והוסף 400 מיקרוליטר פרלדהיד לכל באר כדי לתקן את המטריצות ולדגור אותן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר תיקון הפיגומים, יש לשטוף אותם עם 500 מיקרוליטר PBS למשך חמש דקות. לאחר מכן דגרו על המבנים והמאגר החוסם למשך שש עד תשע שעות, החליפו את המאגר אחת לשעתיים-שלוש עם דגירה אחרונה של לילה במאגר חוסם טרי בארבע מעלות צלזיוס למחרת, הסירו את המאגר החוסם.

מוסיפים את תמיסת הנוגדנים לבארות ודוגרים שוב על המטריצות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. כעת, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף את הפיגומים ב-500 מיקרוליטר PBS למשך שמונה שעות, החלף את ה-PBS כל שעתיים ולאחר מכן למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם PBS טרי. לאחר שטיפת הלילה, הסר את ה-PBS ודגר את הפיגומים עם תמיסת הנוגדנים המשנית למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר בחושך.

לאחר מכן שטפו את הדגימות עם PBS ארבע עד שש פעמים למשך שעה בכל פעם, ולאחר מכן דגרו את המבנים עם PBS טרי בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך הלילה. כעת הוסף 50 מיקרוליטר של MOE על שקופיות המיקרוסקופ כדי להכין אותן להרכבת המטריצות. לאחר מכן הרכיב בזהירות פתק כיסוי על כל שקופית.

לבסוף, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להשיג מיקרוגרפים בודדים וזאקים הדומים ל-H NPCs הצבועים בירוק לביטוי הסמן העצבי בטא שלוש טובולין המוצג כאן. לאחר שטיפת הפיגומים עם 500 מיקרוליטר HBSS למשך דקה אחת, השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להעביר את הפיגומים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השעו מחדש את תמיסת התא מספר פעמים עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לשבש מכנית את המטריצות ולאחר מכן צנטריפוגה את תמיסת הפיגום ב -3000 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב -500 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין בנזין על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.

לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הפסק את התגובה לאחר חמש דקות עם מיליליטר אחד של מעכב טריפסין. תמיסת בנזה נאז מעלה ומטה מספר פעמים לאחר סיבוב מתלה התא באותם תנאי צנטריפוגה.

הסר כל פסולת מטריצה על ידי שטיפת התאים בשני מיליליטר של מאגר HBSS פעמיים. לבסוף, הסר אגרגטים על ידי העברת תמיסת תרחיף התאים דרך צנטריפוגת מסננת תאים של 70 מיקרון באותם תנאים ואסוף את התאים במדיום תרבית תאים. התחל בקיבוע התאים המפורקים בפרלדהיד פרפורם 1% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.

לאחר מכן לאחר סיבוב התאים reus, השעו את הגלולה במאגר כביסה. כעת, לאחר צנטריפוגה של התאים במשך 10 דקות ב-350 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס, ראוס משהה את הגלולה המתקבלת ב-25 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים. דגרו את תרחיף התאים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר.

לאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר פון ישירות לדגימות, ולאחר מכן שטוף את מתלי התאים פעמיים באותם תנאי צנטריפוגה. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו 25 מיקרוליטר של הנוגדן המשני ולאחר מכן דגרו על התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, לאחר שטיפת התאים פעמיים נוספות עם מאגר ספונין, יש להשעות את הגלולה ו -500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לניתוח זרימה ציטומטרי.

באיור זה מוצגים H NPCs עטופים ומטריצה טהורה התאים גדלים בכדור, מבנים צפופים שבהם קוטר הכדורים יכול להיות עד כמה מאות מיקרונים בין הכדורים. ניתן לראות צרורות של תהליכים שנבנו על ידי התאים כפי שמצוין על ידי החצים הלבנים. למרות שבקושי ניתן לזהות תאים בודדים, תאים עטופים במטריצה טהורה בתוספת למינין גדלים במבנים פחות צפופים ומפוזרים בצורה הומוגנית יותר כפי שניתן לראות באיור זה, ניתן אפילו לזהות תאים בודדים באזורים פחות צפופים כפי שמצוין על ידי החצים השחורים כאן, H NPCs התמיינו במשך ארבעה ימים בלמינציה בתוספת pur Matrixx צביעה ירוקה לביטוי הסמן העצבי

בטא שלוש טובולין מוצגים כדי להעריך את אחוז התאים החיוביים. ניתן לקבוע את מספר התאים הכולל על ידי ספירת גרעיני התאים הצבועים כאן בכחול עם דפי. תצלום מיקרו זה מייצג את ההקרנה המלאה של ערימת Z של תמונות שצולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תאים המשתחררים מהמטריצה יכולים להיות מושבים שוב, למשל, על פתקי כיסוי כפי שמוצג באיור זה למחקרים פונקציונליים נוספים. תצלום מיקרו זה מראה תאים שגודלו בתלת מימד לאחר שעברו את הליך השחרור שהוזכר קודם לכן ותרבו במשך שלושה ימים. הצביעה של בטא שלוש טובולין באדום חושפת מורפולוגיה דומה לתאים המתארחים בפיגום התלת-ממדי תוך שימוש בתאים לא מוכתמים כבקרה שלילית.

ה-GA המיוצג כאן כמסגרת השחורה הוגדר לניתוח הבא של תאים חיוביים של בטא שלושה טובולין בתרשים נקודה זה, תאים חיוביים מופיעים בתוך המסגרת השחורה בחלק הימני של ציר ה-x ואוכלוסיית ביניים במסגרת המנוקדת, וככל הנראה ניתן לראות גם פסולת תאים. השוואה של ספירת תאים ידנית וספירה על ידי ציטומטריית זרימה מוצגת באיור סופי זה. ניתן לזהות שיעור גבוה בהרבה של תאים חיוביים על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה כפי שמצוין על ידי הריבועים השחורים הפתוחים, ואז ניתן לספור אותם בדרך כלל על ידי ספירה ידנית כפי שמצוין על ידי המשולשים השחורים המוצקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במדדים גרועים לטיפוח MPCs קצה בפיגום תלת מימדי, וכיצד לשחרר את התאים מהפיגום עבור מנתחי ציטומטרי זרימה.