الطيفية Karyotyping إلى دراسة حالة شذوذ الكروموسومات في البشر والفئران مع مرض الكلى المتعدد الكيسات

الهدف من هذا الإجراء هو تسمية الكروموسومات بمجسات الطلاء لتحديد انحرافات الكروموسومات وعيوب الفصل في الفئران والبشر المصابين بمرض الكلى المتعدد الكيسات. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الخلايا أولا من البشر على الفئران ومعالجتها باستخدام smid ، متبوعا بتثبيت وإعداد انتشارات الطور على الشرائح الزجاجية. بعد ذلك ، تتم معالجة الشريحة مسبقا لإزالة الحمض النووي الريبي الإضافي والسيتوبلازم الذي قد يتداخل مع التهجين.

يتم ذلك عن طريق الهضم باستخدام الحمض النووي الريبي والبيبسين على التوالي. ثم يتم إجراء تمسخ الكروموسوم والمسبار متبوعا بالتهجين لتسمية الكروموسومات. الخطوة الأخيرة هي الكشف عن المسبار بأصباغ الفلورسنت.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر التشوهات العددية والهيكلية في الكروموسومات من خلال التألق والفحص المجهري والتقاط الصور وتحليلها بواسطة برنامج Skyview. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تقنيات ثني GIMs الكلاسيكية ، هي أنها توفر معلومات إضافية حول الانحرافات الكروموسومية المعقدة مثل عمليات نقل الكروموسومات ، وإعادة ترتيب الكروموسومات المعقدة التي لا يمكن تمييزها بتقنيات الانحناء الكلاسيكية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مرض الكلى المتعدد الكيسات ، مثل آلية تكوين الكلى الكيسية.

سيوضح الإجراء هو الدكتور وئام أبو ، مما يسمح لباحث ما بعد الدكتوراه الموهوب من مختبرنا ببدء الخلايا البطانية في DMEM التي تحتوي على 10 إلى 15٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء. ثم عالج الخلايا بمحلول كول بتركيز نهائي قدره 0.05 ملليغرام لكل مليلتر لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الحصاد لحصاد الخلايا أولا ، اجمع الوسط الذي يحتوي على أي خلايا عائمة في 50 ملليلترا. أنابيب أجهزة الطرد المركزي المعقمة.

شطف الخلايا على الطبق معقمة مرة واحدة PBS بعد الحضانة مع رحلات معقمة لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، وحصاد وجمع الخلايا المتبقية في نفس الأنبوب. بعد تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي بمعدل 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق ، استنشق غالبية الحشرات من الأنبوب تاركا حوالي 0.5 مل فوق الحبيبات. قم بفك حبيبات الخلية عن طريق النقر على الأنبوب.

بعد ذلك ، اعتمادا على حجم الحبيبات ، أضف خمسة إلى 10 مل من محلول مفرط التوتر بنسبة 0.56٪ كلوريد البوتاسيوم في الماء المقطر واحتضان المعلق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد الحضانة ، استخدم ماصة صغيرة سعة مليلتر واحد لإضافة قطرة واحدة من محلول مثبت مثلج لكل مليلتر واحد من تعليق الخلايا مفرطة التوتر. ثم اقلب الأنبوب برفق ليخلط بعد الطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق بسرعة 1،200 دورة في الدقيقة.

استنشق الاستلقاء كما كان من قبل. بعد ذلك ، أضف ببطء ملليلترا واحدا من محلول التثبيت الطازج أثناء النقر على الحبيبات. ثم أضف برفق أربعة ملليلتر أخرى من المثبت إلى جدار الأنبوب.

هذا الإجراء أمر بالغ الأهمية لضمان عدم احتجاز انتشاءات الطور في كتل الخلايا. بعد تكرار خطوة الطرد المركزي وشفط المادة الطافية ، استبدل خمسة إلى 10 ملليلتر من المثبت عن طريق سحب المثبت ببطء أسفل جدران الأنبوب. في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الخلايا في أنبوب مشدود ومغلق عند 20 درجة مئوية تحت الصفر على المدى القصير أو 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل حتى تصبح جاهزة للمضي قدما.

عندما تكون جاهزا للمتابعة ، تحقق من عدد كروموسومات الطور في تحضير الخلية. نظف الشريحة بالإيثانول المطلق. ثم قم بقلب الشريحة في الماء المقطر حوالي 10 مرات لتشكيل غمد من الماء على سطح الشريحة ، ضع الشريحة على لوح زجاجي وقم بإسقاط 15 إلى 20 ميكرولترا من تعليق الخلية من 10 بوصات فوق الشريحة.

ضع الشريحة في حمام مائي على درجة حرارة 65 إلى 70 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين واتركها تجف ، وتحقق من الشريحة تحت مجهر ضوئي باستخدام الأهداف الجافة 10 مرات و 40 مرة. تأكد من وجود كروموسومات Metaphase وأن الفروق متباعدة بشكل متساو. افحص السيتوبلازم المحيط بالكروموسومات.

إذا كان السيتوبلازم موجودا كما هو موضح هنا ، فتابع المعالجة المسبقة للشرائح. إذا لم يكن هناك سيتوبلازم وكان للكروموسومات مورفولوجيا جيدة ، فلا داعي للمعالجة المسبقة للشرائح عند 120 ميكرولتر من محلول واحد إلى 200 محضر حديثا من 20 ملليغرام لكل مليلتر. يذوب محلول الحمض النووي الريبي في مرتين SSC إلى زجاج غطاء 24 ملم × 60 ملم.

اقلب شريحة الطور الطوري ووجهها لأسفل على زجاج الغطاء. ثم اقلب شريحة الطور برفق ووجهها لأعلى. ضع الشريحة داخل غرفة رطبة واحتضانها 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.

بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، قم بإزالة زجاج الغطاء بعناية دون خدش الشريحة وغسل مخزن SSC مرتين في وعاء اقتران ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع الرج. في هذه الأثناء ، أضف خمسة إلى 15 ميكرولترا من 100 ملليغرام لكل مليلتر من البيبين في الماء المقطر إلى دورق نظيف ، ثم أضف 100 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.01 مولار إلى 37 درجة مئوية. من المهم إضافة PEPs إلى الدورق النظيف أولا ، وإلا فلن يذوب.

انقل هذا المحلول إلى جرة coplan. احتضن شريحة الغسيل في وعاء التوصيل عند 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن ثلاث إلى خمس دقائق بعد الهضم. اغسل الشريحة مرتين في وعاء يحتوي على XPBS لمدة خمس دقائق مع الرج.

اتبع ذلك بغسل لمدة خمس دقائق في وعاء كوبين يحتوي على PBS مكمل بكلوريد المغنيسيوم. ثم حضانة لمدة 10 دقائق في جرة كوبين تحتوي على 1٪ فورمالديهايد ، متبوعة بغسل أخير في وعاء كوشين يحتوي على XPBS لمدة خمس دقائق. ثم قم بتجفيف برطمانات الكوشين المنزلقة التي تحتوي على سلسلة من الإيثانول بنسبة 70٪ 80٪ و 100٪ لمدة دقيقتين لكل منهما ، ثم جففها في الهواء.

راقب الشريحة تحت المجهر الضوئي باستخدام عدسة جافة 40 مرة للتأكد من هضم الشرائح بشكل صحيح ، وعدم وجود سيتوبلازم ، والحفاظ على مورفولوجيا الكروموسوم. أخيرا ، حدد منطقة للتهجين باستخدام قلم ماسي. بعد تحضير محلول تغيير الطبيعة حديثا ، ضعه في وعاء وقم بتسخينه مسبقا إلى 70 درجة مئوية في حمام مائي.

ثم ضع الشريحة في برطمان كوشين الذي يحتوي على محلول تغيير طبيعة Prewarm في حمام مائي على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. بعد الحضانة ، ضع الشريحة على الفور في بارد مثلج ، 70٪ إيثانول لمدة ثلاث دقائق ، متبوعا بنسبة 80٪ و 100٪ إيثانول لمدة ثلاث دقائق لكل منهما ثم يجف في الهواء. افحص الشريحة بحثا عن مورفولوجيا الكروموسوم ، وظهور الكروموسومات الداكنة التي لا تبدو فاتحة أو لامعة.

يدل على الكروموسوم أو التشكل الجيد. قم بتدفئة طلاء السماء. مسبار عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة 20 دقيقة.

ثم الدوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 1000 دورة لدقائق. لبضع ثوان ، قم بتغيير طبيعة المسبار في جهاز تدوير حراري عند 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، يليه الحضانة عند 37 درجة مئوية. لمدة ساعة واحدة ، ضع 10 ميكرولترات من المسبار المشوه على منطقة التهجين وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي مقاس 22 ملم × 40 ملم.

التأكد من عدم حبس فقاعات الهواء ، قم بإغلاق حواف زجاج الغطاء بالأسمنت المطاطي ، ثم احتضانها في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 إلى 72 ساعة. قم بإزالة زجاج الغطاء بعناية وضع الشريحة في وعاء توصيل يحتوي على محلول غسيل طازج ، وهو محلول قبل الحرب إلى 45 درجة مئوية. يغسل لمدة خمس دقائق ، ثلاث مرات عند 45 درجة مئوية في حمام مائي مهتز بمعدل 45 دورة في الدقيقة.

ثم اغسل الشرائح مرتين في محلول الغسيل اثنان على حرارة 45 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لكل منهما مع الرج ، تليها خمس دقائق في محلول الغسيل ثلاث درجات مئوية 45 درجة مئوية مع الرج. بعد ذلك ، ضع 80 ميكرولترا من كاشف الحظر. ثم ضع غطاء زجاجي وحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

قم بإزالة زجاج الغطاء واترك السائل يجف. ضع 80 ميكرولترا من كاشف تلطيخ الخيال العلمي. ضع غطاء زجاجي وحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة بعد الحضانة ، اغسل الشريحة بمحلول غسيل ثلاث درجات مئوية لمدة خمس دقائق ، ثلاث مرات مع الرج.

بعد ذلك ، ضع 80 ميكرولترا من كاشف تلطيخ PS 5.5. ضع غطاء زجاجي وحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة بعد الحضانة وغسل ثلاث مرات بمحلول الغسيل ثلاث مرات كما كان من قبل. أخيرا ، قم بإمالة الشريحة واترك السائل يجف.

ضع 20 ميكرولترا من كاشف أنتيفا الدابي وضع مجهر 24 ملم × 60 ملم. غطاء زجاجي يزيل بعناية فقاعات الهواء التي ربما تكون قد شكلت شرائح ، ويمكن تصويرها على الفور أو تخزينها عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد. تم التقاط هذه الصورة السماوية لطور طبيعي ينتشر من فأر من النوع البري باستخدام مجهر أوليمبوس المجهز بعدسة غمر بالزيت 60 مرة.

مرشح تمرير ثلاثي النطاق مصمم خصيصا يعرف باسم المكعب الطيفي ، ومرشح داغ ، ووحدة مقياس تداخل الكيس مع كاميرا CCD. تم تنفيذ الأنماط النووية الطيفية باستخدام برنامج skyview. تعرض اللوحة العلوية اليسرى امتداد الطور التعريفي المسمى، وتعرض اللوحة العلوية اليمنى صورة الحقل الساطع للحيز.

تظهر اللوحة السفلية الكروموسوم الذي تم فرزه بترتيب تصاعدي باستخدام برنامج skyview. تظهر صورة السماء هذه لطور الطور المنتشرة من فأر بالضربة القاضية متماثل اللواقح pkd عددا غير طبيعي من الكروموسوم حيث يوجد 68 كروموسوما بدلا من 40. تظهر أيضا تشوهات الكروموسومات مثل حذف الكروموسوم الثامن والكروموسوم أو الانتقالات ، مثل تلك الموجودة بين الكروموسومات الخامسة و 16 ، وكذلك بين الكروموسومات 11 و 19.

هذه الصورة السماوية لانتشار الطور الطوري للكروموسومات البشرية من أنسجة الأوعية الدموية لمريض غير مصاب بمرض A-D-P-K-D لديها النمط النووي الأنثوي الطبيعي المكون من 44 جسيما جسميا واثنين من الكروموسومات XXX. تظهر هذه الصورة النهائية للسماء نموذجا ينتشر من أنسجة الأوعية الدموية لمريض A-D-P-K-D مع نمط نواوي غير طبيعي من 88 جسما وأربعة كروموسومات جنسية XXXX. سيد واحد.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمسة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.