Dünnschichtchromatographie-basierte Trennung von Mykolsäurevarianten: Eine Methode zur Trennung von mykobakteriellen Zellwandlipiden anhand der Polarität

Die mykobakterielle Zellwand enthält verschiedene Varianten von Mykolsäuren – langkettige Fettsäuren mit konservierten Alpha-Ketten. In ihren Beta-Ketten gibt es strukturelle Unterschiede, die zu Schwankungen in der Polarität verschiedener Mykolsäuren führen.

Um die Varianten mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie oder TLC - einer Flüssigchromatographie-Technik - zu trennen, werden mykobakterielle Zellwandlipide in das gewünschte organische Lösungsmittel gebracht. Spotten Sie die Lipide in der Nähe des Bodens einer DC-Platte, die mit einer dünnen Schicht Adsorptionsmaterial vorbeschichtet ist, die als stationäre Phase fungiert.

Legen Sie die Platte in ein Gefäß mit einem organischen Lösungsmittel - der mobilen Phase - und stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand unter den Probenflecken liegt, um eine vorzeitige Diffusion der Mykolsäuren zu verhindern.

Während des Laufs steigt die bewegliche Phase durch Kapillarwirkung durch die winzigen Poren der Adsorptionsschicht auf der Platte auf, schließlich lösen sich die Mykolsäuren im Lösungsmittel auf und wandern nach oben.

Polarere Mykolsäurevarianten werden von der polaren stationären Phase über intermolekulare Kräfte vorübergehend adsorbiert, wodurch ihre Aufwärtsbewegung behindert wird. Weniger polare Mykolsäuren verbleiben in der unpolaren mobilen Phase und wandern weiter.

Die Unterschiede in der Migration führen dazu, dass sich die Varianten der Mykolsäure in diskrete Banden aufteilen.

Besprühen Sie die getrocknete Platte nach Fertigstellung mit einem Phosphomolybdsäurefleck. Erhitze die Platte, um den Fleck in Gegenwart der Lipide zu reduzieren und den Bändern eine dunkelgrüne Farbe zu verleihen.

Um die Proben mit DC zu analysieren, decken Sie eine Wand der DC-Kammer mit einem Stück Filterpapier ab. Geben Sie Vaseline auf die Kammerecken, um die Kammer zu versiegeln. Dekantieren Sie die Lösungsmittelmischung über das Filterpapier und geben Sie das restliche Volumen des Lösungsmittels auf den Boden der DC-Kammer. Schließen Sie die DC-Kammer für mindestens 20 Minuten, um sie zu sättigen

In der Zwischenzeit lösen Sie die Lipide in der Glasröhre in 200 bis 1.000 Mikrolitern Chloroform auf und tragen Sie mit einem Kapillarglasröhrchen 10 Mikroliter der Lipid-Chloroform-Suspension direkt auf die DC-Platte auf. Nachdem Sie die Probe fünf Minuten lang trocknen gelassen haben, setzen Sie die Platte in die gesättigte DC-Kammer ein und lassen Sie die mobile Phase durch die DC-Kammer laufen.

Wenn das Lösungsmittel 1 Zentimeter vom oberen Ende der Platte entfernt ist, legen Sie die Platte unter laminares Flussmittel, bis die Kieselsäure vollständig getrocknet ist. Besprühen Sie dann die getrocknete Platte mit 15 bis 20 Millilitern 10%igem Molybdatophosphorsäurehydrat in Ethanol, bis die Platte hellgelb ist, und erhitzen Sie die Platte zwei bis fünf Minuten lang auf 120 Grad Celsius.