Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

In diesem Video-Artikel beschreiben wir ein neuartiges Hydro-Put-Protokoll für die automatisierte Synthese von Oligosacchariden in Lösungsphase und die Funktionalisierung von Poly-anhydrid-Nanopartikeln. Mit diesen auf Kohlenhydraten basierenden Targeting-Agents werden zunächst Kohlenhydratmoleküle mithilfe eines automatisierten Systems synthetisiert, das die Synthese in Lösungsphase anstelle von Festphasensynthesizern verwendet. Anschließend werden die Oligosaccharid-Zwischenprodukte durch Florisil- oder Festphasen-Extraktion (FSPE) gereinigt.

Die hergestellten Kohlenhydratmoleküle werden mittels NMR charakterisiert und anschließend durch Carbo-IDE-Konjugation an die Polyanhydrid-Nanopartikel gebunden. Abschließend werden die mit Kohlenhydraten funktionalisierten Nanopartikel mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie und einem Hydro-Phenyl-Schwefelsäure-Assay charakterisiert. Letztendlich konnten mithilfe der hier beschriebenen Hydro-Phenyl-Methode die Reaktionsbedingungen zur Optimierung der Nanopartikelmorphologie und der Kohlenhydratdichte auf der Partikeloberfläche ermittelt werden.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie der festphasengebundenen Oligosaccharid-Synthese besteht darin, dass in diesem Verfahren deutlich geringere Mengen an Bausteinen verwendet werden. Typischerweise setzen wir zwei bis drei Äquivalente ein, anstelle von 10 bis 20 Äquivalenten. Die Idee für diese Methode entstand, als wir die Wirksamkeit von Oberflächeneffekten bei der Funktionalisierung von polyhydroxynanopartikeln mittels Kohlenhydraten zur gezielten Ansteuerung von CEEP-Rezeptoren auf antigendenpräsentierenden Zellen nachweisen konnten. Anschließend wollten wir ein Hochdurchsatzverfahren entwickeln, das es uns ermöglicht, die zahlreichen Parameter, die an der Herstellung und Anwendung dieser neuartigen Trägersysteme beteiligt sind, systematisch zu untersuchen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Entwicklung automatisierter Plattformen für die Hochdurchsatzsynthese von Oligosacchariden und deren Anbindung an Polymerpartikel ein neuartiges Forschungsgebiet darstellt, für das bisher nur wenig Dokumentation verfügbar ist, vor der automatisierten Synthese von Diano-Säure. Ein geeignet geschützter Zuckerdonor, typischerweise Trichloracetamid, sowie ein Akzeptor hauptsächlich in Alcon, fluoriertes Alkohol, werden am Reagenztisch synthetisiert und in Chloromethan vorbereitet; außerdem werden Trimethylsilo, Trifluormethansulfonat in Chloromethan, 80 % Methanol und 100 % Methanol bereitgestellt. Stellen Sie sicher, dass die relative Luftfeuchtigkeit im Raum bei 30 % oder darunter im Automatisierungskammer liegt.

Hohe Luftfeuchtigkeit ist schädlich für Glykosylierungsreaktionen. Die folgenden Schritte werden mithilfe einer Automatisierungsplattform durchgeführt. Die erste Glykosylierung wird mit dem Donator und dem Floristenalkohol durchgeführt.

Nach Abschluss wird das resultierende Florist-Tag-Zucker-Molekül durch FSPE gereinigt. Die temporäre Schutzgruppe wird anschließend mit Natrium, Methoxid und Methanol entfernt, und erneut wird das Produkt durch FSPE gereinigt. Danach wird der Florist-Tag-Zucker als Akzeptor verwendet und mit dem gleichen Donor gekoppelt, um das Disaccharid zu erhalten; das Disaccharid wird dann durch FSPE gereinigt, um den Prozess zu beginnen.

Stellen Sie die Reagenzien, einschließlich des Donor-Akzeptor-Promotors, 80 % Methanol Wasser, 100 % Methanol und Natriummethoxid, auf der Robotikplattform bereit und starten Sie das Programm. Der Roboterarm entnimmt nacheinander den Donor und den Akzeptor aus den Fläschchen und überführt sie in ein Reaktionsfläschchen. Anschließend wird das Gemisch aus Donor und Akzeptor 30 Minuten lang gerührt.

Nachdem 30 Minuten vergangen sind, überträgt der Roboterarm katalytisches Trimethylsilo, Trifluor, Methansulfonat in die Mischung. Die Lösung wird anschließend weitere 30 Minuten gerührt. Nach Abschluss des Rührens pausiert das Programm.

Entnehmen Sie eine Portion von 10 Mikrolitern, um mithilfe der Dünnschichtchromatographie zu überprüfen, ob die Reaktion abgeschlossen ist. Falls die Reaktion vollständig ist, wird das Akzeptormolekül nicht sichtbar sein. Falls die Reaktion nicht vollständig ist, bleibt das Akzeptormolekül auf der TLC sichtbar.

Wenn dies der Fall ist, stoppen Sie das Programm, stellen Sie die Zeit für die Glykosylierung auf etwa 30 Minuten zurück und geben Sie ein Überschuss an dem Promotor Trimethylsilo, Trifluormethansulfonat zu. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Sobald die Reaktion beendet ist, überträgt der Roboter das Reaktionsgemisch auf FSPE-Kartuschen, die mit C9F17-modifiziertem Kieselgel zur Reinigung enthalten.

Anschließend werden die Kartuschen mit acht Millilitern 80%igem Methanol und danach mit acht Millilitern 100%igem Methanol gewaschen. Um die nicht-floris-Fraktion zu entfernen, wird der Durchlauf in einer Vial gesammelt, um das gewünschte, mit florist markierte Produkt zu erhalten. Falls eine zusätzliche Reinigung erforderlich ist, halten Sie den Roboter an und entfernen Sie die entsprechenden Reaktionsprodukte.

Je nach Struktur können Spender äußerst reaktionsträge sein, und einige floristische Akzeptormoleküle verbleiben möglicherweise, selbst nach Zugabe eines ausreichenden Promotors. In einem solchen Fall ist die FSPE nicht effizient genug für die Reinigung, und eine zusätzliche Reinigung mittels Säulenchromatographie an Kieselgel kann anschließend durchgeführt werden, nachdem der Roboterarm Natriummethoxid in das Reaktionsgefäß abgegeben hat. Danach wird die Reaktion zwei Stunden lang auf der Robotikplattform gerührt; falls die Reaktion gemäß Dünnschichtchromatographie (TLC) nicht vollständig ist, sollte die Inkubationszeit um etwa eine Stunde verlängert werden.

Nach Beendigung der Reaktion wird das Produkt wie zuvor durch FSPE gereinigt. Danach wird das Reaktionsprodukt vom Roboter genommen und auf dem Laborplatz in wasserfreiem Toluol gelöst, gefolgt von einer Einengung zur Entfernung von restlichem Wasser. Sobald die Probe trocken ist, wird sie erneut in den Roboter eingelegt und der gleiche Zyklus durchlaufen, einschließlich der Glykosylierungsreinigung mittels FSPE.

Der tiefe Schutz der temporären Schutzgruppe, gefolgt von Glykosylierung, wird wiederholt, bis die gewünschte Kettenlänge für das Zielmolekül erreicht ist, um das geschützte Produkt, das aus der Automatisierung erhalten wurde, zu entschützen, und das Vial vom Roboter zu entfernen. Die letzten Schritte des Verfahrens verwenden explosiven Wasserstoffgas und müssen außerhalb der Automatisierungsplattform durchgeführt werden. Auf dem Laborpult oz erfolgt die Spaltung der Doppelbindung im Florist-Tag, gefolgt von der Oxidation des gebildeten Aldehyds zu Carbonsäure.

Reinigen Sie das resultierende Produkt mittels Säulenchromatographie an Kieselgel auf dem Laborpult unter Verwendung einer Mischung aus 30 % Methanol in Dichlormethan. Schließlich, um die Benzolethergruppen durch palladiumkatalysierte Hydrierung zu entfernen, leiten Sie das Produkt durch ein Satellitenpad, um Palladium zu entfernen, und erhalten so das reine Endprodukt. Charakterisieren Sie das Produkt vollständig mittels Kernspinresonanz- oder NMR-Spektroskopie.

Die Hochdurchsatz-Polymer-Synthese und die Herstellung von Nanopartikeln erfolgt gemäß dem von Peterson et al. beschriebenen Protokoll. Wie im begleitenden Dokument angegeben, besteht die automatisierte Abscheidungsapparatur, die für die Partikelfunktionalisierung verwendet wird, aus drei ne 1000 Pumpen, einem robotischen Tisch, der aus zwei Aktuatoren integriert ist, einer für die Bewegung in X-Richtung und der andere für die Bewegung in Y-Richtung, sowie einem zweiten robotischen Tisch mit zwei benachbarten Halterungen, die aus drei Aktuatoren bestehen, jeweils einer pro Richtung für die Pumpen, und insgesamt fünf Aktuatoren sind angeschlossen. In Reihe geschaltete Aktuatoren und Pumpen werden über einen Computer mit LabVIEW-Software gesteuert.

Die für die Partikelfabrikation verwendeten Copolymer-Systeme basieren auf SEBA-Säure oder SA sowie einem sechs BIS, para-Carboxy-Oxil-Hean oder CPH und einem achtzehn BIS para-Carboxy-Phenoxy-3,6-Dioxan oder CP Teeg. Nach der Herstellung der Nanopartikel wird ein Rack mit den 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, die eine Nanopartikel-Bibliothek enthalten, auf die Linearantriebsstufe gebracht, um Kohlenhydrate an die Oberfläche der Polyanhydrid-Partikel zu koppeln, und es wird eine mittlere Carbonsäure-Kopplungsreaktion durchgeführt, die aus zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen besteht. Für die erste Reaktion füllen Sie eine Spritze in einer programmierbaren Spritzenpumpe mit einer wässrigen Lösung aus EDC und Ethylendiamin in einer Konzentration von jeweils zwei Milligramm pro Milligramm Nanopartikel und 0,6 Milligramm pro Milligramm Nanopartikel.

Füllen Sie eine zweite Spritze in einer programmierbaren Spritzenpumpe mit 2,5 Milligramm pro Milligramm Partikel von NHSA, insgesamt 12 Äquivalente pro Nanopartikelprobe, mit einer wässrigen Lösung. Anschließend weisen Sie mithilfe des Lab-View-Programms den Roboter an, Reagenssuspensionen in die Nanopartikelbibliothek abzugeben. Die Roboteraktuatoren bewegen dann den Röhrchenhalter in die korrekte Position auf der Plattform, um die Lösungen EDC und NHS abzugeben.

Aktivieren Sie die Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Polyanhydrid-Nanopartikel, um eine mittlere Kopplung zu ermöglichen. Tauchen Sie anschließend eine Beschallungssonde in jedes Reagenzglas ein und beschallen Sie jede Probe 30 Sekunden lang bei 40 Hertz. Reinigen Sie die Sonde mit Aceton, bevor Sie zur nächsten Probe übergehen.

Nachdem alle Proben gesättigt sind, wird der Probenträger von der Robotikplattform abgenommen. Inkubieren Sie die Nanopartikelsuspensionen neun Stunden lang bei konstanter Rotation bei vier Grad Celsius. Die Reaktionszeiten für die erste und zweite Reaktion können angepasst werden, um die endgültige Saccharidkonzentration zu verändern.

Nach Abschluss der Reaktion die Röhrchen fünf Minuten lang mit 12.000 × g zentrifugieren. In einer kalten Umgebung zum Robotersystem zurückkehren. Den Röhrchenhalter am Roboterarm befestigen und die zweite Spritze auf der Robotikplattform befüllen.

Bei kaltem Wasser sollte die erste Spritze leer bleiben. Starten Sie den Roboter. Das Überstand in jedem Röhrchen wird in die leere Spritze gezogen, und die zweite Pumpe gibt kaltes Wasser in die Röhrchen ab.

Dieser Schritt wird durchgeführt, um nicht umgesetzte Reagenzien aus den Nanopartikelsuspensionen zu entfernen. Anschließend homogenisieren Sie die Nanopartikelsuspension durch Beschallung, wie zuvor gezeigt. Danach zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 × g für fünf Minuten.

Führen Sie eine zweite Waschung mit kaltem Wasser durch und verwenden Sie dazu die robotische Vorrichtung: Geben Sie für die zweite Reaktionszugabe 12 Äquivalente pro Nanopartikelprobe EDC in die erste Pumpe und 12 Äquivalente pro Nanopartikelprobe NHS in die zweite Pumpe. Starten Sie die robotische Plattform, um ausreichende Volumina in die Röhrchen mit den Nanopartikeln abzugeben. Die Anwesenheit von EDC und NHS ermöglicht die Bildung einer Amidbindung zwischen den Aminogruppen des bereits an der Oberfläche der Nanopartikel angehefteten Ethylendits und der Carboxylgruppe des geschützten Zuckers.

Nach Abschluss der Deposition werden 10 Äquivalente eines spezifischen Saccharids zugegeben. In diesem Fall wurde Lactose verwendet sowie die Glykolsäurekontrolle in den beiden verfügbaren Pumpen. Jedes Saccharid wird je nach gewünschter Funktionalisierung, die in jedem Reagenzglas erreicht werden soll, in verschiedene Reagenzgläser abgefüllt, was zuvor im Lab-View-Programm programmiert wurde, das zur Steuerung der Aktuatoren und Pumpfunktionen für die spezifische in dieser Studie angewandte Reaktion dient. Für die Anbindung von Kohlenhydraten wird Glykolsäure als Linkerkontrolle verwendet, da tiefgeschützte Saccharide bereits über dieses Molekül kovalent verknüpft verfügen, was eine weitere Anbindung an die Oberfläche der Nanopartikel ermöglicht.

Nanopartikelsuspensionen werden wie zuvor durch Beschallung homogenisiert und anschließend neun Stunden bei konstanter Rotation bei vier Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubation werden die Nanopartikelsuspensionen durch Zentrifugation gewaschen, wobei der Überstand entfernt wird; danach wird das Pellet in kaltem Wasser resuspendiert und die Röhrchen, die nun die funktionalisierte Nanopartikelbibliothek enthalten, zur Trocknung für mindestens zwei Stunden in eine Vakuumkammer gestellt. Funktionalisierte Nanopartikel werden mittels dynamischer Lichtstreuung und anderer Methoden hinsichtlich Oberflächenzusammensetzung, Konzentration, Partikelgröße, Größenverteilung und Oberflächenladung charakterisiert.

Die hier gezeigte vollständig geschützte Diano-Seite wurde mithilfe der Automatisierungsplattform synthetisiert. Die synthetisierte Verbindung wurde mittels Protonen-NMR-Spektroskopie an einem VXR-400-Megahertz-Spektrometer charakterisiert. Unter Verwendung von CDC13 als Lösungsmittel kann die Bildung des Produkts anhand der Anwesenheit einiger charakteristischer Signale bestätigt werden.

Im Protonen-NMR-Spektrum stammen die vier Protonen von 1,79 bis 2,21 und die zwei Protonen bei 3,38 vom Florist-Tag. Das Singulett-Signal bei 2,16 entspricht dem Acetatpeak; die Signale bei 4,94 und 5,11 sind die anomeren Protonen, um den Einfluss der Reaktionszeit auf die endgültige Morphologie der Nanopartikel und den Grad der Zuckeranlagerung zu bewerten. Die Nanopartikel wurden mit zunehmender Reaktionszeit funktionalisiert; wie hier gezeigt, stieg die Konzentration von Diano auf der Oberfläche der 50 50 CPT CPH-Nanopartikel mit der Gesamtreaktionszeit an und erreichte nach 18 Stunden ein Maximum.

Nanopartikel, die mit einer Gesamtreaktionszeit von 24 Stunden funktionalisiert wurden, wurden anschließend verwendet, um ihre Fähigkeit zur gezielten Bindung an CLRs auf dendritischen Zellen aus murinem Knochenmark mittels Durchflusszytometrie zu bewerten, wie hier gezeigt. Nach Stimulation mit nicht funktionalisierten sowie mit Lactose- und Dano-funktionalisierten Nanopartikeln wurde eine erhöhte Expression des DC-Signals und des Mano-Rezeptors gegenüber C-Typ-Lektinrezeptoren beobachtet. Dies weist auf eine effektive gezielte Bindung hin.

Doch die mit Diano funktionalisierten Partikel zeigten ein höheres Expressionsniveau, was auf eine Spezifität dieses Liganden für die untersuchten Rezeptoren hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die hochdurchsatzfähige automatisierte Synthese von Oligosacchariden sowie die Funktionalisierung von Poly-Nanopartikeln durchgeführt wird. Unter Verwendung dieser auf Kohlenhydraten basierenden gezielten Wirkstoffe kann, einmal die Synthese des Donor-Akzeptor-geschützten Zuckers sowie der Aufbau der Apparatur beherrscht, der Prozess innerhalb von 24 bis 48 Stunden abgeschlossen werden.

Selbstverständlich hängt die Dauer von der Größe der Bibliothek sowie von der Funktionalisierungszeit ab. Bei Anwendung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Reaktionsbedingungen für die Funktionalisierung biologisch abbaubarer Polyhydro-Partikel je nach Nanopartikelchemie optimiert werden können. Durch Befolgung dieses Verfahrens lassen sich verschiedene Kohlenhydratstrukturen synthetisieren, um unterschiedliche Zellrezeptoren anzusteuern und damit das immunologische Ergebnis zu beeinflussen.