Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

In diesem Videoartikel beschreiben wir ein neuartiges Hydro-Put-Protokoll für die automatisierte Lösungsphasensynthese von Oligosacchariden und die Funktionalisierung von Polyanhy-Nanopartikeln. Mit diesen kohlenhydratbasierten Targeting-Wirkstoffen werden erste Kohlenhydratmoleküle mit einem automatisierten System synthetisiert, das die Lösungsphasensynthese anstelle von Festphasensynthesizern verwendet. Anschließend werden die Oligosaccharid-Zwischenprodukte durch Florist, Festphasenextraktion oder FSPE aufgereinigt.

Die produzierten Kohlenhydratmoleküle werden durch NMR charakterisiert und dann durch Carbo-IDE-Konjugation an die Polyanhydrid-Nanopartikel gebunden. Schließlich werden kohlenhydratfunktionalisierte Nanopartikel mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie und einem Hydroputtphenylschwefelsäure-Assay charakterisiert. Letztendlich wurden unter Verwendung der hier beschriebenen Hydro-Put-Methode die Reaktionsbedingungen zur Optimierung der Nanopartikelmorphologie und der Kohlenhydratdichte auf der Partikeloberfläche erhalten.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber den bestehenden wie der Synthese von Solid-Face-Oligosacchariden besteht darin, dass wir bei dieser Methode eine wesentlich geringere Menge an Bausteinen verwenden. Bei dieser Methode verwenden wir typischerweise zwei bis drei Äquivalente anstelle von 10 bis 20 Äquivalenten. Wir haben die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir die Wirksamkeit von Oberflächeneffekten, die Funktionalisierung von Polyhydro-Nanopartikeln und die Verwendung von Kohlenhydraten zur Bekämpfung von Ceep-Rezeptoren auf Anti-Dellen-Zellen demonstrieren. Wir wollten dann ein Hochdurchsatzsystem entwickeln, das es uns ermöglicht, die verschiedenen Parameter zu screenen, die bei der Herstellung und Anwendung dieser neuartigen Träger eine Rolle spielen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Entwicklung automatisierter Plattformen für die Hochdurchsatzsynthese von Oligosacchariden und deren Bindung an Polymerpartikel ein neuartiges Forschungsgebiet ist, für das vor der automatisierten Synthese von Dianosäure nicht viel Dokumentation verfügbar ist. Ein angemessen geschützter Zuckerspender, typischerweise Trichloracetamid ein Akzeptierer hauptsächlich in Alcon, fluoröser Alkohol werden auf dem Labortisch synthetisiert und in Chlormethan hergestellt, bereiten auch Trimethylsilo, Trifluormethansulfonat in Chlormethan, 80% Methanol und 100% Methanol vor. Stellen Sie sicher, dass die relative Luftfeuchtigkeit im Raum 30 % oder weniger in der Automatisierungskammer beträgt.

Eine hohe Luftfeuchtigkeit ist nachteilig für Glykosylierungsreaktionen. Die folgenden Schritte werden mithilfe einer Automatisierungsplattform durchgeführt. Die erste Glykosylierung wird mit dem Spender und dem Floristen Alkohol durchgeführt.

Sobald dies geschehen ist, wird das resultierende Florist-Tag-Zuckermolekül durch FSPE gereinigt. Die temporäre Schutzgruppe wird dann durch Natrium, Methoxid und Methanol entfernt, und das Produkt wird erneut durch FSPE gereinigt. Danach wird der Floristen-Tag-Zucker als Akzeptor verwendet und an denselben Donor gekoppelt, um das Disaccharid zu erhalten, das Disaccharid wird von FSPE gereinigt, um zu beginnen.

Platzieren Sie Reagenzien, einschließlich des Donorakzeptor-Promotors, 80 % Methanolwasser, 100 % Methanol und Natriummethoxid, in der Roboterplattform und starten Sie das Programm. Der Roboterarm entnimmt den Donor und dann den Akzeptor aus den Fläschchen und überträgt sie in ein Reaktionsfläschchen. Dann wird die Mischung aus Donor und Akzeptor 30 Minuten lang gerührt.

Nach Ablauf von 30 Minuten. Der Roboterarm überträgt katalytisches Trimethylsilo, Trifluor und Methansulfonat in das Gemisch. Die Lösung wird dann weitere 30 Minuten gerührt. Nach Beendigung des Rührens wird das Programm pausiert.

Entfernen Sie ein Aliquot von 10 Mikrolitern, um durch Dünnschichtchromatographie zu überprüfen, ob die Reaktion abgeschlossen ist. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, ist das Akzeptormolekül nicht zu sehen. Wenn die Reaktion nicht abgeschlossen ist, ist der Akzeptor auf der TLC immer noch sichtbar.

Wenn dies der Fall ist, stoppen Sie das Programm, setzen Sie den Zeitpunkt für die Glykosylierung um etwa 30 Minuten zurück und fügen Sie einen Überschuss des Promotors Trimethylsilo, Trifluor und Methansulfonat hinzu. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, überträgt der Roboter das Reaktionsgemisch zur Reinigung in FSPE-Kartuschen, die das modifizierte Kieselgel C nine F 17 enthalten.

Anschließend werden die Kartuschen mit acht Millilitern 80 % Methanol gewaschen, gefolgt von acht Millilitern 100 % Methanol. Um die Nicht-Floris-Fraktion zu eliminieren, wird der Durchfluss in einem Fläschchen gesammelt, um das gewünschte Produkt mit Florist-Etikett zu erhalten. Wenn eine zusätzliche Reinigung erforderlich ist, halten Sie den Roboter an und entfernen Sie die entsprechenden Reaktionsprodukte.

Abhängig von der Struktur können die Spender extrem unreaktiv sein und ein Teil des Floristenakzeptermoleküls bleibt auch nach Zugabe von ausreichend Promotor übrig. Wenn dies der Fall ist, ist FSPE für die Reinigung nicht effizient genug, und eine zusätzliche Reinigung über die Kieselgelsäulenchromatographie kann durchgeführt werden, nachdem der Roboterarm Natriummethoxid in das Reaktionsgefäß abgegeben hat. Die Reaktion wird dann zwei Stunden lang auf der Roboterplattform gerührt, wenn sie nicht wie von TLC bestimmt abgeschlossen ist, verlängern Sie die Inkubationszeit um etwa eine Stunde.

Nach Abschluss der Reaktion wird das Produkt wie zuvor durch FSPE gereinigt. Entfernen Sie anschließend das Reaktionsprodukt aus dem Roboter und auf dem Labortisch, das in wasserfreiem Toluol aufgelöst wird, gefolgt von einer Verdampfung, um das restliche Wasser zu entfernen. Sobald eine Probe trocken ist, wird sie im selben Zyklus wieder in den Roboter gegeben, einschließlich der Glykosylierungsaufreinigung durch FSPE.

tiefe Schutz der temporären Schutzgruppe, gefolgt von der Glykosylierung, wird wiederholt, bis die gewünschte Kettenlänge erreicht ist, damit das Zielmolekül den Schutz des durch die Automatisierung erhaltenen geschützten Produkts aufheben und das Fläschchen aus dem Roboter entfernen kann. Die letzten Schritte des Verfahrens verwenden explosives Wasserstoffgas und müssen außerhalb der Automatisierungsplattform durchgeführt werden. Auf dem Tisch-Oz erfolgt die Lyse der Doppelbindung im Florist-Etikett und gefolgt von der Oxidation des produzierten Aldehyds zu Carbonsäure.

Das resultierende Produkt wird durch Kieselgelsäulenchromatographie auf einem Labortisch mit einer Mischung aus 30 % Methanol in Dichlormethan gereinigt. Um die Benzoethergruppen durch palladiumkatalysierte Hydrierung zu schützen, leiten Sie das Produkt schließlich durch ein Satellitenpad, um Palladium loszuwerden und ein reines Endprodukt zu erhalten. Vollständige Charakterisierung des Produkts mittels Kernspinresonanz oder NMR-Spektroskopie.

Die Polymersynthese und die Herstellung von Nanopartikeln erfolgt nach dem von Peterson et al. beschriebenen Protokoll. Wie in dem Begleitdokument erwähnt, besteht die zur Partikelfunktionalisierung verwendete automatisierte Abscheidungsvorrichtung aus drei ne 1000 Pumpen, einem Robotertisch, der mit zwei Aktuatoren integriert ist, einer für die Bewegung in X-Richtung und der andere für die Bewegung in Y-Richtung, und einem zweiten Robotertisch mit zwei benachbarten Zahnstangen, bestehend aus drei Aktuatoren, Angeschlossen werden einer für jede Richtung der Pumpen und insgesamt fünf Aktuatoren. In Reihe werden Aktuatoren und Pumpen von einem Computer mit Hilfe der Lab-View-Software gesteuert.

Die Copolymersysteme, die für die Partikelherstellung verwendet werden, basieren auf SEBA-Säure oder SA und einem Sechs-Bis-, Para-Carboxy-, Oxil-Hean oder CPH und einem Acht-Bis-Para-Carboxy-Phenoxy-, Drei-Sechs-Dioxan oder CP-Teeg. Nach der Nanopartikelherstellung wird ein Gestell mit den 1,7-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen mit einer Nanopartikelbibliothek zur Linearantriebsstufe für die Bindung von Kohlenhydraten an die Oberfläche von Polyanhypartikeln und eine mittlere Carbonsäure-Kupplungsreaktion, bestehend aus zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen, für die erste Reaktion durchgeführt. Füllen Sie eine Spritze in einer programmierbaren Spritzenpumpe mit einer wässrigen Lösung aus EDC und Ethylendiamin in einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milligramm Nanopartikel bzw. 0,6 Milligramm pro Milligramm Nanopartikel.

Füllen Sie eine zweite Spritze in eine programmierbare Spritzenpumpe mit 2,5 Milligramm pro Milligramm Partikeln NHSA insgesamt 12 Äquivalente pro Nanopartikelprobe, einer wässrigen Lösung. Weisen Sie den Roboter anschließend mit dem Laboransichtsprogramm an, Reagenzsuspensionen in die Nanopartikelbibliothek zu deponieren. Die Roboteraktuatoren würden dann den Schlauchhalter in die richtige Position auf der Plattform für die Abgabe von Lösungen, EDC und NHS bewegen.

Aktivieren Sie die Carbonsäuregruppen auf der Oberfläche von Polyanhydrid-Nanopartikeln und ermöglichen Sie eine mittlere Kopplung. Tauchen Sie dann eine Beschallungssonde in jedes Röhrchen und beschallen Sie jede Probe 30 Sekunden lang bei 40 Hertz. Bevor Sie zur nächsten Probe übergehen, reinigen Sie die Sonde mit Aceton.

Sobald alle Proben gesättigt sind, wird der Röhrchenhalter von der Roboterplattform gelöst. Inkubieren Sie die Nanopartikel-Suspensionen neun Stunden lang mit konstanter Rotation bei vier Grad Celsius. Die Reaktionszeiten für die erste und zweite Reaktion können geändert werden, um die endgültige Saccharidkonzentration einzustellen.

Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 12.000 Mal G. Kehren Sie in einer kalten Umgebung zur Roboterstation zurück. Befestigen Sie den Schlauchhalter wieder am Roboterarm und füllen Sie die zweite Spritze in die Roboterplattform.

Bei kaltem Wasser sollte die erste Spritze leer bleiben. Starten Sie den Roboter. Der Überstand in jedem Röhrchen wird in die leere Spritze aufgezogen und die zweite Pumpe gießt kaltes Wasser in die Röhrchen.

Dieser Schritt wird durchgeführt, um alle nicht reaktiven Reagenzien aus den Nanopartikelsuspensionen zu entfernen. Als nächstes homogenisieren Sie die Nanopartikelsuspension durch Beschallung, wie zuvor gezeigt. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 12.000 mal G.

Führen Sie eine zweite Wäsche mit kaltem Wasser durch, wobei die Robotervorrichtung für die zweite Reaktion verwendet wird: Laden Sie 12 Äquivalente pro Nanopartikelprobe EDC in die erste Pumpe und 12 Äquivalente pro Nanopartikelprobe NHS in die zweite Pumpe. Starten Sie die Roboterplattform, um ausreichende Volumina in die Röhrchen mit Nanopartikeln zu dosieren. Das Vorhandensein von EDC und NHS ermöglicht die Bildung einer Amidbindung zwischen den Amidgruppen aus dem Ethylendit, das bereits an die Nanopartikeloberfläche gebunden ist, und der Carbonsäuregruppe des tiefengeschützten Zuckers.

Sobald die Abscheidung abgeschlossen ist, laden Sie 10 Äquivalente eines bestimmten Saccharids. In diesem Fall wurde Laktose verwendet und die Glykolsäure in den beiden verfügbaren Pumpen gesteuert. Jedes Saccharid wird in Reagenzgläsern abgeschieden, abhängig von der gewünschten Funktionalisierung, die in jedem Röhrchen erreicht werden soll, das zuvor im Laboransichtsprogramm programmiert wurde, und verwendet wird, um die Aktuatoren und Pumpenfunktionen für die spezifische Reaktion zu betreiben. In dieser Studie zur Bindung von Kohlenhydraten wird Glykolsäure als Linkerkontrolle verwendet, da tief geschützte Saccharide dieses Molekül bereits kovalent gebunden haben. Dies ermöglicht eine weitere Befestigung an der Nanopartikeloberfläche.

Nanopartikel-Suspensionen werden wie bisher durch Beschallung homogenisiert und dann neun Stunden lang bei konstanter Rotation bei vier Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubation waschen Sie die Nanopartikelsuspensionen, indem Sie zentrifugieren, den Überstand entfernen, dann das Pellet mit Resus in kaltem Wasser suspendieren und die Röhrchen, die nun die funktionalisierte Nanopartikelbibliothek enthalten, in eine Vakuumkammer legen, um sie mindestens zwei Stunden lang zu trocknen. Funktionalisierte Nanopartikel zeichnen sich durch dynamische Lichtstreuung und andere Methoden zur Beurteilung der Oberflächenzusammensetzung, Konzentration, Partikelgröße, Größenverteilung und Oberflächenladung aus.

Die hier gezeigte vollgeschützte Membranseite wurde mit Hilfe der Automatisierungsplattform synthetisiert. Die synthetisierte Verbindung wurde mittels Protonen-NMR in einem VXR 400 Megahertz Spektrometer charakterisiert. Bei Verwendung von CDC 13 als Lösungsmittel kann die Bildung des Produkts durch das Vorhandensein einiger charakteristischer Peaks bestätigt werden.

Im Protonen-NMR-Diagramm stammen die vier Protonen von 1,79 bis 2,21 und zwei Protonen bei 3,38 vom Floristen-Tag. Der Singulett-Peak bei 2,16 entspricht den Acetat-Peaks bei 4,94 und 5,11 sind die anomeren Protonen, um den Einfluss der Reaktionszeit auf die endgültige Morphologie der Nanopartikel und den Grad der erreichten Zuckerbindung zu beurteilen. Die Nanopartikel wurden mit zunehmender Reaktionszeit funktionalisiert, wie hier gezeigt, stieg die Konzentration von Diano auf der Oberfläche von 50 50 CPT CPH Nanopartikeln mit der Gesamtreaktionszeit an und erreichte nach 18 Stunden ein Maximum.

Nanopartikel, die mit einer Gesamtreaktionszeit von 24 Stunden funktionalisiert wurden, wurden dann verwendet, um ihre Fähigkeit zu bewerten, CLRs auf dendritischen Zellen aus dem Knochenmark der Maus mittels Durchflusszytometrie zu bekämpfen, wie hier gezeigt. Eine erhöhte Expression des DC-Zeichens und des Mano-Rezeptors zu C-Typ-Lektinrezeptoren wurde nach Stimulation mit nicht-funktionalisierten sowie Laktose- und Dano-funktionalisierten Nanopartikeln beobachtet. Dies deutet auf ein effektives Targeting hin.

Diano-funktionalisierte Partikel zeigten jedoch ein höheres Expressionsniveau, was auf eine Spezifität dieses Liganden für die untersuchten Rezeptoren hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die automatisierte Hochdurchsatzsynthese von Oligosacchariden sowie die Funktionalisierung von Polynanopartikeln durchführen. Unter Verwendung dieser Kohlenhydratbasis als Zielmittel kann nach der Beherrschung der Synthese des Donorakzeptors geschützter Zucker sowie der Zusammenbau der Apparatur in 24 bis 48 Stunden erfolgen.

Die Zeitlänge hängt natürlich sowohl von der Größe der Bibliothek als auch von der Funktionalisierungszeit ab. Bei dieser Methode ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie die Reaktionsbedingungen der Funktionalisierung von biologisch abbaubaren Polyhydro-Partikeln in Abhängigkeit von der Nanopartikelchemie optimieren können. Durch dieses Verfahren können verschiedene Strukturen von Kohlenhydraten synthetisiert werden, um verschiedene Zellrezeptoren anzusprechen und das immunologische Ergebnis zu beeinflussen.