Intraduktale Injektion von LPS als Maus-Modell der Mastitis: Signaling Visualisierte über einen NF-kappaB Reporter Transgene

Hier beschrieben ist ein Verfahren, bei dem Lipopolysaccharid in der laktierenden Milchdrüse der Maus über den Nippel, um Mastitis zu simulieren, ein Zustand, üblicherweise durch bakterielle Infektion verursacht wird injiziert. Lipopolysaccharide Injektion führt zu einer erhöhten nuclear factor kappa B (NF-kappaB) Signaltechnik, visualisiert durch Biolumineszenz Bildgebung eines NF-kappaB Luciferase-Reporter-Maus.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Mastitis oder Entzündung der Brustdrüse zu untersuchen und insbesondere die NF-Kary-Aktivität in einer entzündeten Laktationsdrüse sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein weiblicher NF Kappa b-Reporter, transgen, mit einem Wildtyp-Männchen gekreuzt wird. Acht Tage nach der Geburt der Welpen wird das Lipopolysaccharid über eine einleitende Injektionstechnik in die Laktation des Weibchens eingeführt, die sechs Stunden nach der Injektion nicht alle Wunden an der Injektionsstelle schädigt.

Die Maus wird einer biolumineszenten Bildgebung unterzogen, um die Luciferase-Aktivität in der Brustdrüse zu erkennen. Letztendlich können die Ergebnisse eine signifikante NF KB-Aktivität in den LPS-behandelten Drüsen durch die Verwendung der intraduktalen Injektionsmethode zeigen, gefolgt von biolumineszierender Bildgebung. Der Hauptvorteil unseres Ansatzes gegenüber anderen Methoden der intraduktalen Injektion besteht darin, dass die Injektionsstelle in keiner Weise beschädigt wird.

Dies ist absolut entscheidend, wenn Sie vorhaben, die mit der LPS-Injektion verbundene Entzündung zu untersuchen, da jede Schädigung der Stelle oder der Brustwarze diese Analyse überlagern und verwirren würde. Für dieses Verfahren werden weibliche Mäuse verwendet, die positiv für das NGL Reporter-Transgen sind. Eins. Hündinnen sind mindestens sechs Wochen alt.

M paart sie mit einem FVB-Wildtyp-Männchen durch har und brütet 15 Tage nach der Paarung. Beginnen Sie, die Hündinnen regelmäßig auf Anzeichen einer Schwangerschaft zu untersuchen, insbesondere auf einen großen, hervorstehenden Umfang. Trennen Sie trächtige Weibchen in ihren eigenen Käfig und wenn das letzte Weibchen trächtig wird, nehmen Sie das Männchen aus dem Zuchtkäfig.

Für eine ausreichende Laktation ist ein Wurf von mindestens sechs Welpen erforderlich. Acht Tage nach der Geburt eines solchen Wurfes. Fahren Sie mit dem Protokoll fort.

Der schwierigste Teil des Eingriffs ist die einleitende Injektion selbst. Ruhige Hände und viel Übung sind hilfreich, aber Fallstricke können immer auftreten. Seien Sie darauf vorbereitet, am Tag der Injektion mehrere Mäuse bereit zu haben, um den Erfolg sicherzustellen.

Beginnen Sie mit der Verdünnung von von E. coli abgeleiteten Lipopolysacchariden in PBS auf eine Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter. 50 Mikroliter dieser LPS-Lösung werden in die Brustdrüse injiziert. Bereiten Sie ein zweites Röhrchen PBS allein vor, das für die Kontrollinjektion verwendet werden soll.

Neben der Bühne des Präparierbereichs. Befestigen Sie einen Nasenkonus, um die Anästhesie durchzuführen. Bereiten Sie die helle Beleuchtung der Bühne bei Bedarf mit zusätzlichen Scheinwerfern vor.

Sobald die Dissektionseinrichtung fertig ist, starten Sie die isof-Fluormaschine und den Luftstrom. Laden Sie anschließend die 31-Gauge-Insulinspritze mit 50 Mikrolitern der LPS-Lösung und legen Sie die Spritze für Übungsinjektionen beiseite. Verwenden Sie Triamblau-Farbstoff, verdünnt in PBS, um die Ergebnisse zu visualisieren.

Betäuben Sie anschließend die Maus, die injiziert werden soll, sobald sich ihre Atmung verlangsamt hat. Stellen Sie es auf den Tisch und geben Sie Iso-Fluor über den Nasenkonus ab. Verwenden Sie ein Kneifen, um zu bestätigen, dass die vollständige Betäubung während des gesamten Eingriffs erfolgt.

Überwachen Sie das Atemmuster der Maus. Stellen Sie den Fluorspiegel kontinuierlich ein, um ihn konstant zu halten. Verwenden Sie einen kleinen Tropfen 70%iges Ethanol, um die Haare am Bauchbauch des Tieres zu glätten und die Brustwarzen zu lokalisieren.

Lokalisieren Sie die Brustwarze der rechten Leistendrüse Nummer vier am Unterbauch mit einer feinen Pinzette in der nicht dominanten Hand. Ziehe die Brustwarze vorsichtig von der Haut weg. Die Pinzette sollte niemals festgeklemmt werden.

In der dominanten Hand sollte nur ein leichter Griff auf die Brustwarze ausgeübt werden. Bringen Sie die vorgeladene Spritze in das Sichtfeld und halten Sie sie so, dass keine Neupositionierung erforderlich ist, um den Inhalt zu injizieren. Richte die Nadel vorsichtig auf die kleine duktile Öffnung in der Mitte des Nippels.

Führen Sie etwa ein Viertel der Nadel in den Kanal ein, ohne sie neu zu positionieren. Injizieren Sie den Inhalt der Spritze über einen Zeitraum von drei bis fünf Sekunden. Entferne dann vorsichtig die Nadel vom Nippel.

Laden Sie eine zweite Spritze mit 50 Mikrofreisetzungen PBS und wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Seite. Nummer vier, Brustwarze der Leistendrüse mit der PBS-Kontrolle. Sobald beide Injektionen abgeschlossen sind, brechen Sie die Anästhesie ab und bringen Sie die Maus in einen Erholungskäfig.

Das Weibchen sollte sich innerhalb von fünf Minuten bewegen. Nach einer Stunde bringst du sie mit ihren Zügen in einen Käfig zurück. Die Maus sollte nach sechs Stunden Injektion abgebildet werden.

Überwachen Sie in der Zwischenzeit die Maus, wenn Anzeichen von Stress beobachtet werden. Brechen Sie das Experiment ab und euthanasieren Sie die Mäuse in der bildgebenden Einrichtung. Bereiten Sie sich darauf vor, das Weibchen mit Fluor zu betäuben.

Stellen Sie sicher, dass die Anästhesie sowohl in die Box als auch in die Bildgebungskammer fließt. Legen Sie die Maus unter isof-Fluor-Anästhesie in die durchsichtige Anästhesiebox. Sobald sich die Atmung verlangsamt hat, kneifen Sie, um zu bestätigen, dass die Maus vollständig betäubt ist.

Injizieren Sie anschließend retroorbital 100 Mikroliter Luzifersubstrat durch eine 26-Gauge-Nadel. Bringen Sie die Maus sofort nach der Injektion in die Bildgebungskammer und befestigen Sie den Nasenkonus, der Isof Lorraine liefert. Bringen Sie die Maus in Rückenlage und befestigen Sie jeden Fuß mit schwarzem, undurchsichtigem Klebeband auf der Bühne.

Geben Sie die entsprechenden Einstellungen in die IVIS-Software ein, um sowohl ein fotografisches Weißlichtbild als auch ein Bild der biolumineszierenden Aktivität aufzunehmen. Die Belichtungszeit sollte 10 Sekunden betragen, sobald die Bilder aufgenommen wurden. Befolgen Sie das gleiche Wiederherstellungsprotokoll wie für die Nachinjektion beschrieben.

Die Foto- und Leuchtbilder werden automatisch überlagert und auf dem Bildschirm angezeigt. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder, indem Sie interessante Bereiche oder ROI-Kreise gleicher Größe auf jeder Seite des Unterbauchs der Maus platzieren. Eine über der PBS-Injektionsdrüse und eine über der LPS-Injektionsdrüse.

Stellen Sie die Anzeige auf Photonen ein. Es sollte eine Zahl angezeigt werden, die die innerhalb jedes ROI erkannte Lumineszenz angibt. Verwenden Sie diese Zahl in der statistischen Analyse, um das optimale Bild anzuzeigen. Passen Sie den Schwellenwert des angezeigten Signals weiter an.

Dies ändert die Gesamtlumineszenzanzeige nicht, ermöglicht jedoch die Entfernung des Hintergrundsignals, wenn die PBS-Injektionsdrüse frei vom Hintergrundsignal ist. Das erhöhte Signal in der LPS-behandelten Drüse sollte in der Bildpraxis deutlich werden: Die Injektionen wurden am 21. Tag der Laktation durchgeführt, wenn weniger Milch produziert wird und der Erfolg einer Injektion leicht durch Trianblau-Färbung sichtbar gemacht werden kann. Bei erfolgreich injizierten Gedächtnisdrüsen wurde nur der duktale Baum bei einer erfolglosen Injektion mit Lösung gefüllt. Es gab eine Ansammlung von Flüssigkeit an der Brustwarze oder am umgebenden Gewebe.

Die erfolgreiche Injektion von LPS in die Milchgänge am achten Tag führte zu einer erhöhten NF KB-Aktivität innerhalb der Drüse aufgrund der konstitutiven NF KB-Aktivität im Gehirn und anderen Bauchorganen. Es gab ein konsistentes Basissignal vor jeder Manipulation. Die Luziferaseaktivität war in der LPS-injizierten Drüse einer Gruppe von vier Mäusen wesentlich höher als in der PBS-injizierten Drüse.

Es wurde ein statistisch signifikanter Anstieg der Lumineszenz innerhalb der LPS-behandelten Drüsen gemessen. Diese Methode kann Aufschluss über die Entzündung der Brustdrüse geben. Es kann auch auf andere Forschungsbereiche wie die Krebsforschung angewendet werden.

Sie können Krebszellen oder Karzinogene direkt in den Milchgang injizieren.