Ein hoher Gehalt In Vitro Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Das übergeordnete Ziel dieser High-Content-Screening-Plattform für die Betazellreplikation ist es, die Untersuchung der molekularen Signalwege zu erleichtern, die das Wachstum von Betazellen einschränken. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Betazellbiologie zu beantworten. Wie zum Beispiel eines der wichtigsten Signalmoleküle und Signalwege, die die Regeneration von Betazellen steuern.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Erhöhung des Durchsatzes der Zellauskleidung auf eine spezifische Bewertung und den automatisierten Datenanalysten einer primären Inselzellreplikation ermöglicht. Der Einsatz dieser Technik hat das Potenzial, sich auf die Entwicklung der regenerativen Therapie für Diabetes auszuweiten. Eine Krankheit mit großen gesundheitlichen und wirtschaftlichen Kosten für unsere Gesellschaft.

Beginnen Sie mit einer mit Pankreas beladenen 10-Milliliter-Spritze für die Bauchspeicheldrüse, die mit einer 22-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um den Gallengang communis an der Verbindung der Ductus cysticus und der Lebergang communis oder nur distal davon zu chemulieren. Stützen Sie den gemeinsamen Gallengang mit einem Skalpellgriff und injizieren Sie langsam 10 Milliliter der Lösung. Nachdem die gesamte Kollagenase verabreicht wurde, verwenden Sie eine gebogene Pinzette und eine Schere, um die aufgeblähte Bauchspeicheldrüse vom absteigenden Dickdarm, Darm, Magen und Spline zu trennen.

Legen Sie dann bis zu zwei Pankreaten in ein 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis, das fünf Milliliter Pankreasverdauungslösung enthält. Wenn alle Pankreaten gesammelt sind, legen Sie die Verdauungsröhrchen 15 Minuten lang in ein 37 Grad heißes Wasserbad und schwenken Sie sie alle drei Minuten sanft. Schütteln Sie die Röhrchen am Ende der Verdauung 10 Mal kräftig vertikal.

Und fügen Sie den Proben 10 Milliliter Kaltwaschpuffer hinzu. Schütteln Sie die Tuben noch fünfmal kräftig und legen Sie sie auf Eis. Füllen Sie anschließend die Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 50 Millilitern mit Kaltwaschpuffer und drehen Sie die Röhrchen fünfmal um.

Schleudern Sie dann das Gewebe herunter und gießen Sie die Überstände ab, wobei Sie darauf achten, dass sich die Pellets nicht lösen. Suspendieren Sie die Gewebeaufschlämmung erneut in 25 Millilitern Waschpuffer, gefolgt von einem sanften Vortexen. Wiederholen Sie die Schritte zum Schleudern und Aufhängen noch zwei weitere Male.

Anschließend werden die Gewebesuspensionen durch ein 30-Mesh-Gewebesieb in ein steriles 250-Milliliter-Becherglas gegossen. Spülen Sie die Verdauungsröhrchen mit zusätzlichen 20 Millilitern Waschpuffer und gießen Sie die Waschungen auf das Netz, um das unverdaute Pankreas- und Fettgewebe zu entfernen. Das gefilterte Material auf zwei neue 50-Milliliter-Röhrchen verteilen und das Gewebe durch Zentrifugation pelletieren.

Dekantieren Sie dann den Überstand und drehen Sie die Rohre um, um den überschüssigen Puffer abzulassen. Um die Inselzellen zu reinigen, fügen Sie den Pankreasgewebepellets 20 Milliliter Kältedichtegradient hinzu und pipettieren Sie vorsichtig fünfmal auf und ab, um den Inhalt homogen wieder zu suspendieren. Als nächstes legen Sie langsam 10 Milliliter HBSS über die Wand jedes Gradientenröhrchens, achten Sie darauf, eine scharfe Flüssigkeitsschnittstelle zu erhalten und die Pankreaszellen durch Zentrifugation zu trennen.

Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Inselschicht von der Grenzfläche in neue konische 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Waschen Sie dann die Inselzellen dreimal in 40 bis 50 Milliliter Waschpuffer. Drehen Sie ihre Röhren um, um die Pellets zwischen jeder Zentrifugation wieder zu suspendieren.

Bringen Sie die Röhrchen nach der letzten Wäsche in eine Gewebekulturhaube. Aspirieren Sie den Überstand. Und suspendieren Sie die Pellets wieder in sechs Millilitern Inselmedium.

Sieben Sie die Inselzellen aus jedem Röhrchen in einzelne Vertiefungen mit einer Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen. Und schwenken Sie die Platte, um die Inselchen in der Mitte der Vertiefungen zu sammeln. Bewerten Sie die Reinheit der Inselzellen unter dem Mikroskop.

Um die Inselzellen weiter zu reinigen, sammeln Sie sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette und geben Sie sie mit sechs Millilitern Inselmedium in die benachbarte Vertiefung. Wiederholen Sie das Schwenken, Sammeln, Übertragen und mikroskopische Auswerten der Inseln, bis eine Reinheit von mehr als 90 Prozent erreicht ist. Übertragen Sie dann die Inselzellen in eine einzelne 10 Zentimeter große Gewebekulturschale mit 20 Millilitern Inselmedium.

Nachdem alle Inseln geerntet wurden, stellen Sie die Kulturschale über Nacht in einen Gewebekultur-Inkubator. Beschichten Sie dann die Vertiefungen einer 384-Well-Platte mit 40 Mikrolitern 804G, konditioniertem Medium pro Well, und legen Sie die Platte über Nacht in den Inkubator. Verwenden Sie am nächsten Tag einen Zellschaber, um die Inseln vorsichtig zu lösen.

Füllen Sie dann die Inseln in ein 50-Milliliter-Röhrchen um. Sammeln Sie die Inseln durch Zentrifugation. Waschen Sie sie dann mit 20 Millilitern warmem p, b, s.

Eine Minute lang zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Und suspendieren Sie das Pellet wieder in null Komma zwei, fünf Prozent Trypsin.

Inkubieren Sie die Inselzellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um die Inselzellen 10 Mal nach fünf und 10 Minuten zu aspirieren und abzugeben. Nach der zweiten Triteration wird eine 20 Mikroliter große Probe der trypsinisierten Inselzellen gezählt. Wenn das Gewebe vollständig verdaut ist, suspendieren Sie die dissoziativen Inselzellen in einer Konzentration von vier Komma fünf mal zehn bis zu vier Zellen pro Milliliter im Inselfunktionsmedium.

Verwenden Sie dann einen 12-Well-Verteileraspirator, um das 804G-Zustandsmedium von der zuvor vorbereiteten 384-Well-Platte zu entfernen. Und sieben Sie 70 Mikroliter Inselzellen pro Vertiefung in die Reihen c bis n in den Spalten vier bis 21. Lassen Sie die Inselzellen 48 Stunden lang im Gewebekultur-Inkubator haften.

Verwenden Sie nach zwei Tagen den 12-Well-Verteileraspirator, um das Inselmedium vorsichtig zu entfernen, und verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um 35 Mikroliter Inselfunktionsmedium in jede Vertiefung zu geben. Übertragen Sie dann 35 Mikroliter der frisch zubereiteten zwei x zusammengesetzten Lösungen von Interesse in jede Vertiefung. Und stellen Sie die Inseln für weitere 48 Stunden in den Inkubator ein.

Nach 48 Stunden fixieren, färben und analysieren Sie die mit Verbindungen behandelten Inselkulturen mit einer automatisierten High-Content-Imaging-Plattform. In einem typischen Experiment wird die Replikationsrate der DAPI-, PD-1- und insulinpositiven Betazellen durch den Prozentsatz der Betazellen bestimmt, die Ki-67 koexprimieren. Die Alpha-Zellreplikation wird als Prozentsatz der DAPI-positiven, PD-negativen, Glucagon-positiven und Ki-67-co-exprimierenden Zellen gemessen.

In diesem repräsentativen Experiment wurde beispielsweise beobachtet, dass Dipryridamol die Replikation von Beta-, aber nicht von Alpha-Zellen fördert. Diese Technik kann in sieben Tagen abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können Verbindungen, die sich in der Betazellreplikation befinden, weiter untersucht werden, um die Wirkmechanismen aufzudecken.

Diese Technik hat es Forschern auf dem Gebiet der Betazellbiologie ermöglicht, neue Signalfaktoren und Signalwege zu identifizieren, die das Wachstum von Betazellen regulieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Fähigkeit kleiner Moleküle testen können, die Regeneration von Betazellen selektiv zu stimulieren.