Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Protokolls besteht darin, die funktionelle Untersuchung von Genen auf genomweiter Ebene durch gleichzeitige Überwachung mehrerer zellulärer Endpunkte zu ermöglichen. In dieser Demonstration werden Firefly-RAN- und Cipro-Dina-Luciferase-basierte Reporter verwendet, um die Aktivität des P-53-WINT- bzw. des KRAS-Signalwegs zu überwachen. Diese drei Reporter werden gemeinsam mit einem irna-Molekül, das ein Gen der Interesse zielt, in HCT-116-Zellen – einer kolorektalen Krebszelllinie – transfiziert.

Anschließend werden die Aktivitäten von Feuerfliegen- und Vanille-Luciferase in den Zelllysaten gemessen, während die Aktivität der Cipro-DEA-Luciferase, eines sezernierten Enzyms, im Kulturmedium bestimmt wird. Die Ergebnisse belegen die Reproduzierbarkeit des Assaysystems sowie die Fähigkeit, gemeinsame und einzigartige Wirkungen von Genen innerhalb dieser drei für Krebs relevante Signalwege aufzuzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Microray oder Multicolor-Pries liegt darin, dass sie eine erschwingliche, universelle und kosteneffiziente Möglichkeit darstellt, die transkriptionellen zellulären Produkte zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Fragen in der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise zur Entwicklung molekular gezielter therapeutischer Strategien. Obwohl unser vorübergehender Transfektionsprotokoll-Aufwand IL und ein minimales zeitliches Engagement für den Screenaufbau erfordert, wird dies voraussichtlich die Signalvariabilität von Brunnen zu Brunnen erhöhen, was durch die Betrachtung der Reporterverhältnisse anstelle der absoluten Ausfälle aus den Brunnen kompensiert werden kann. Um dieses Verfahren zu beginnen, waschen Sie fünf 10 cm² große Platten mit 80 bis 90 % konfluenten HCT 116-Zellen mit PBS und gewinnen Sie anschließend die Zellen durch Trypsinisierung für jede Platte.

Verwenden Sie ein Milliliter Trypsinlösung, gefolgt von einer Neutralisation mit 10 Milliliter DMEM, das 2 % FBS und 1 % Penicillin enthält. Überführen Sie die suspendierten Zellen in einen 50-Milliliter-Konischkolben und zentrifugieren Sie sie etwa fünf Minuten bei 130 ×g. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter Medium.

Zählen Sie die Zellenanzahl mit einem Zellzähler und stellen Sie anschließend eine Zelllösung mit 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter her. Bewahren Sie 150 Milliliter der Zellsuspension für den nächsten Schritt unter Verwendung einer automatisierten Mehrfachdosierpipette in einer Platte auf. Geben Sie 100 Mikroliter oder 10 hoch 4 Zellen in jedes Loch einer 96-Loch-Kulturplatte.

Die Zellsuspension sollte in diesem Fall ausreichen, um 1296-Well-Platten zu beimpfen. Inkubieren Sie die Platten mit den Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, während Sie das Transfektionsgemisch vorbereiten. Die hier verwendete hochwertige Reporter-Konstrukt-DNA wurde mit standardmäßigen MIDI-Präp-Kit-Methoden isoliert und auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnt.

Für jeden Reporter stellen Sie 100 Mikroliter Reporter-Konstrukt-Stammlösung her, indem Sie die folgenden Komponenten kombinieren: 30 Mikroliter P 53, 30 Mikroliter FL, 30 Mikroliter eight X-T-C-F-R-L, 30 Mikroliter elk one G four, sechs Mikroliter U-A-S-C-L und vier Mikroliter H zwei oh. Dies ergibt eine DNA-Mischung mit einem endgültigen Verhältnis von eins zu eins zu eins zu 0,2 der Reporter und einer endgültigen DNA-Konzentration von 0,3 Milligramm pro Milliliter. Bereiten Sie anschließend I-R-N-A-D-N-A-Transfektionsmischungen in ausreichender Menge für die Transfektion von 1296 vor.

Verdünnen Sie in Mehrlochplatten 80 Mikroliter der Stammlösung des Reporterkonstrukts in acht Milliliter EC-Puffer aus dem QIAGEN-Transfektionskit, um eine DNA-Lösung mit einer Endkonzentration von drei Mikrogramm pro Milliliter Platte zu erhalten. Geben Sie 20 Mikroliter der DNA-Lösung in jedes Loch einer 96-Loch-PCR-Platte. Die Anzahl der 96-Loch-Platten hängt davon ab, wie viele irna-Pools getestet werden sollen.

Beispielsweise benötigen wir in diesem Fall 4 Platten mit 96 Vertiefungen zur Auswertung. 384 verschiedene siRAN-Pools mithilfe eines automatisierten Flüssigkeitsmanipulators übertragen, indem jeweils zwei Mikroliter jeder fünf Mikromolar siRAN-Lösung in die entsprechende Vertiefung der PCR-Platte gegeben werden, die den verdünnten DNA-Vorrat enthält. Als Nächstes fügen Sie je einen Mikroliter Enhancer-Lösung zu jeder Vertiefung der DNA-siRAN-Platte hinzu.

Lassen Sie die Enhancer-Reaktion fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen. Geben Sie anschließend drei Mikroliter Transfektionsreagenz zu jedem Well und inkubieren Sie weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Bildung der Transfektionskomplexe zu stoppen, geben Sie 10 Mikroliter DMEM, das 2 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, zu jedem Well der PCR-Platte hinzu.

Holen Sie die 1296er-Platten mit HCT-116-Zellen aus dem Inkubator. Übertragen Sie 10 Mikroliter der Transfektionsmischung in jedes Loch einer 96er-Platte mit Zellen, da jede Transfektion im Dreifachansatz durchgeführt wird. Dieselbe Mischung wird auf zwei zusätzliche 96er-Platten mit Zellen angewendet.

Inkubieren Sie die Zellen mit den Transfektionsgemischen 36 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Umgebung mit 5 % Kohlendioxid. 36 Stunden nach der Transfektion der Zellen können die Luciferase-Aktivitäten gemessen werden.

Da diese Studie mehrere Reporter umfasst, von denen einer in das Kulturmedium abgegeben wird und zwei andere im zellulären Zytoplasma exprimiert werden, werden Messungen sowohl aus dem Kulturmedium als auch aus einem zellulären Lysat gewonnen, um die Cipro Dina-Luciferase- oder CL-Aktivität in der Kultur nachzuweisen. Medium-Replikatplatte.

20 µL Kulturmedium in eine weiße, undurchsichtige 96-Well-Platte geben. Mit dem Multi-Drop 20 µL CL-Assaypuffer in jedes Well hinzufügen. Anschließend 10 µL Cipro Dina Lucifer und Substrat in jedes Well geben und die CL-Aktivität mittels eines Luminometers detektieren, um die Aktivitäten der Feuerfly-Luciferase und der Vanille-Luciferase nachzuweisen; Zelllysate müssen zuvor hergestellt werden.

Entfernen Sie das Kulturmedium von den Zellen, indem Sie jede Platte umdrehen und das Medium in einem Ausguss entsorgen. Entfernen Sie das restliche Medium, indem Sie die umgedrehte Platte vorsichtig auf Papiertüchern antippen. Geben Sie 30 Mikroliter eines 1×-Passiven-Lysepuffers in jedes Zellbrühenloch.

Stellen Sie die Platten für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einen Plattenschüttler, der mit mittlerer Geschwindigkeit eingestellt ist. Nach fünf Minuten fügen Sie 20 Mikroliter des Luciferase-Assay-Reagenzes in jedes Zellbrüden hinzu und messen Sie sofort die Firefly-Luciferase-Aktivität mit dem Luminometer. Danach fügen Sie das Stop-and-Glow-Reagenz hinzu, um die Firefly-Luciferase-Aktivität zu quenchieren, und messen Sie anschließend die Luciferase-Aktivität.

Vor der Multiplexierung wurde die Robustheit der drei verschiedenen Screening-Plattformen einzeln bewertet. Angegebene kolorektale Krebszelllinien wurden mit den acht XTCF PP 53 ta Luke- oder ALK one-Feuerfadenluciferase-kodierenden Reporterkonstrukten sowie mit Pools aus siRNAs, die gegen WINT Beta-Catenin P 53 oder KAS gerichtet waren, transfiziert. Die für den jeweiligen Signalweg relevanten Genotypen jeder Zelllinie sind angegeben.

Die Stärke jeder Screening-Plattform wurde anhand der Reproduzierbarkeit dieser induzierten Effekte auf den jeweiligen Signaltransduktionsweg bewertet. Wie in diesen repräsentativen Ergebnissen gezeigt, haben Betain und siRNAs keinen Einfluss auf die Aktivität des acht XTCF-Reporters in RKO-Zellen. Im Gegensatz zu DLD ein und HCT ein 16 Zellen, die jeweils im APC-Weg, Suppressorprotein defizient sind und eine aktivierte Form von β-Catenin exprimieren.

Anschließend wurde gezeigt, dass diese Reporter gemeinsam für simultane Messungen der Genaktivität der Wnt-beta-Catenin-, p53- und KRAS-Signaltransduktionswege unter Verwendung der angegebenen siRNA-Pools in diesen Diagrammen eingesetzt werden können. Die relativen Luciferase-Aktivitäten sind auf der Y-Achse dargestellt, und die siRNAs, die gegen das jeweils angegebene Gen von Interesse gerichtet sind, sind auf der X-Achse abgetragen. Beispielsweise verringert ein siRNA-Pool, der gegen beta-Catenin gerichtet ist, die Aktivität des Wnt-beta-Catenin-Weges, ohne die p53- und KRAS-Wege signifikant zu beeinflussen.

Bei der Entwicklung eines Multiplex-Reportersystems ist es wichtig, die gewünschte Zelllinie hinsichtlich des Transfektionsbereichs und des Reportersignals zu optimieren.