Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Protokolls ist es, die Abfrage der Genfunktion auf Genomebene durch gleichzeitige Überwachung mehrerer zellulärer Auslesungen zu ermöglichen. In dieser Demonstration werden Firefly RAN- und Cipro Dina Luciferase-basierte Reporter verwendet, um die Aktivität des P 53 WINT bzw. KRAS Signalwegs zu überwachen. Diese drei Reporter werden mit irna, die auf ein Gen von Interesse abzielt, in HCT one 16 Zellen, einer Darmkrebszelllinie, transeziert.

Anschließend werden die Aktivitäten von Glühwürmchen und Vanille-Luciferase in den Zelllysaten gemessen, während die Aktivität von Cipro DEA Luciferase gemessen wird. In der Kultur wird ein sezerniertes Enzym gemessen. Es werden mittlere Ergebnisse erzielt, die die Reproduzierbarkeit des Assay-Systems sowie die Fähigkeit zeigen, gemeinsame und einzigartige Wirkungen von Genen innerhalb dieser drei krebsrelevanten Signalwege aufzudecken.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Mikrostrahlen- oder Mehrfarbenverfahren besteht darin, dass sie eine erschwingliche, universelle und kostengünstige Möglichkeit bietet, die zellulären Transkriptionsausgaben zu betrachten. Diese Methode kann helfen, Fragen in der Krebsforschung zu beantworten, wie z.B. die Entwicklung molekular zielgerichteter Therapiestrategien. Obwohl unser transientes transfect-Protokoll IL erfordert und der Zeitaufwand für die Bildschirmeinrichtung minimal ist, wird es wahrscheinlich die Variabilität des Well-to-Well-Signals erhöhen, was durch einen Blick auf die Berichtsverhältnisse und nicht durch die Betrachtung absoluter Ausfälle aus den Wells ausgeglichen werden kann. Um dieses Verfahren zu beginnen, waschen Sie fünf 10 Zentimeter große quadratische Platten mit 80 bis 90 % konfluentem HCT und 16 Zellen mit PBS und ernten Sie dann Zellen durch Trypsinisierung für jede Platte.

Verwenden Sie einen Milliliter Trypsinlösung, gefolgt von einer Neutralisation mit 10 Millilitern DMEM, die 2% FBS und 1% Penicillin enthalten. Streptomycin überträgt suspendierte Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugiert sie fünf Minuten lang bei etwa 130 g. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern Medium.

Zählen Sie die Zellzahl mit einem Zellzähler und stellen Sie dann eine Zelllösung mit 10 bis fünf Zellen pro Milliliter her. Bewahren Sie 150 Milliliter Zellsuspension für den nächsten Schritt mit einer automatisierten Mehrtropfen-Flüssigkeitsspenderplatte auf. 100 Mikroliter oder 10 bis vierte Zellen in jeder Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte.

Die Zellsuspension sollte in diesem Fall für die Beschichtung 1296 ausreichend sein. Well-Platten inkubieren die Platten mit Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, während die Transfektionsmischung vorbereitet wird. Die hier verwendete DNA des hochwertigen Reporterkonstrukts wurde mit Standard-MIDI-Prep-Kits isoliert und auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnt.

Bereiten Sie für jeden Reporter 100 Mikroliter Reporter-Construct-Stammlösung vor, indem Sie die folgenden kombinieren: 30 Mikroliter P 53, FL, 30 Mikroliter acht X-T-C-F-R-L, 30 Mikroliter Elch, ein G, vier, sechs Mikroliter U-A-S-C-L und vier Mikroliter H, zwei oh. Daraus ergibt sich ein DNA-Gemisch mit einem Endverhältnis von eins zu eins zu eins zu 0,2 der Reporter und einer finalen DNA-Konzentration von 0,3 Milligramm pro Milliliter. Als nächstes bereiten Sie I-R-N-A-D-N-A-Transfektionsmischungen vor, die für die Durchtrennung von 1296 ausreichen.

Well-Platten verdünnen 80 Mikroliter der Reporter-Construct-Stammlösung in acht Millilitern EC-Puffer aus dem QIAGEN-Effekt-Kit, um eine DNA-Lösung mit einer Endkonzentration von drei Mikrogramm pro Milliliterplatte zu erhalten. 20 Mikroliter der DNA-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. Die Anzahl der 96-Well-Platten hängt davon ab, wie viele irna-Pools getestet werden sollen.

In diesem Fall benötigen wir zum Beispiel 4 96-Well-Platten für die Bewertung. 384 verschiedene SIRa-Pools, die einen automatisierten Biom-Liquid-Handler verwenden, übertragen zwei Mikroliter von jeweils fünf mikromolaren siRNA in die entsprechende Vertiefung der PCR-Platte, die den verdünnten DNA-Stamm enthält. Geben Sie als Nächstes einen Mikroliter Enhancer-Lösung in jede Vertiefung der DNA-siRNA-Platte.

Lassen Sie die Enhancer-Reaktion fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen. Geben Sie dann drei Mikroliter des wirksamen Transfektionsreagenzes in jede Vertiefung und inkubieren Sie weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Bildung von Transfektionskomplexen zu stoppen, geben Sie 10 Mikroliter DMEM mit 2 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin in jede Vertiefung der PCR-Platte.

Entnehmen Sie die 1296-Well-Platten mit HCT und 16 Zellen aus dem Inkubator. Übertragen Sie 10 Mikroliter des Transfektionsgemisches in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, die die Zellen enthält, da jede Transfektion in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wird. Die gleiche Mischung wird auf zwei weitere 96-Well-Platten mit Zellen aufgetragen.

Inkubieren Sie die Zellen mit Transfektionsmischungen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % Kohlendioxid für 36 Stunden, 36 Stunden nach der Transfektion der Zellen. Die Luziferase-Aktivitäten sind bereit für die Messung.

Da diese Studie mehrere Reporter umfasst, wird einer in das Kulturmedium sezerniert und zwei weitere werden im Zytoplasma der Zelle exprimiert. Die Messungen werden sowohl mit dem Kulturmedium als auch mit einem zellulären Lysat durchgeführt, um die Aktivität von Cipro Dina Luciferase oder CL in der Kultur nachzuweisen. Mittlere Replik-Platte.

20 Mikroliter eines Nährmediums auf eine weiße, undurchsichtige 96-Well-Platte. Mit dem Multi-Drop geben Sie 20 Mikroliter CL-Assay-Puffer in jede Vertiefung. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter Cipro Dina Lucifer und Substrat zu jeder Vertiefung hinzu und weisen Sie die CL-Aktivität mit einem Luminometer nach, um Glühwürmchen-Luciferase- und Vanille-Luciferase-Aktivitäten zu erkennen, müssen zuerst Zelllysate hergestellt werden.

Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Zellen, indem Sie jede Platte auf den Kopf stellen und das Medium in ein Waschbecken werfen. Entfernen Sie das restliche Medium, indem Sie vorsichtig auf die umgedrehte Platte auf Küchenpapier klopfen. Geben Sie 30 Mikroliter eines x passiven Lysepuffers in jede Zellvertiefung.

Legen Sie die Platten auf eine Plattformwippe, die fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf mittlere Geschwindigkeit eingestellt ist. Geben Sie nach fünf Minuten 20 Mikroliter des Luciferase-Assay-Reagenzes in jede Zellvertiefung und messen Sie sofort die Luciferase-Aktivität von Glühwürmchen mit dem Luminometer. Fügen Sie als Nächstes ein Stopp- und Glühreagenz hinzu, um die Luciferase-Aktivität des Glühwürmchens zu löschen und dann die Luziferase-Aktivität zu messen.

Vor dem Multiplexing wurde die Robustheit der drei verschiedenen Screening-Plattformen einzeln bewertet. Indizierte kolorektale Karzinomzelllinien wurden mit den acht XTCF PP 53 ta Luke oder ALK transfiziert, einem Firefly Luciferase-kodierenden Reporterkonstrukt zusammen mit Pools von siRNAs, die auf WINT beta-Catenin P 53 bzw. KAS abzielen. Die für den Signalweg relevanten Genotypen für jede Zelllinie sind angegeben.

Die Stärke jeder Screening-Plattform wurde anhand der Reproduzierbarkeit dieser induzierten Effekte auf den relevanten Signaltransduktionsweg bewertet. Wie in diesen repräsentativen Ergebnissen gezeigt, haben das Betain und die siRNAs keinen Einfluss auf die acht XTCF-Reporteraktivität in RKO-Zellen. Im Gegensatz zu DLD one und HCT one 16 Zellen, die jeweils einen Mangel am A PC-Signalweg aufweisen, weisen Suppressorprotein auf und exprimieren eine aktivierte Form von Beca Tenin.

Anschließend wurde gezeigt, dass diese Reporter zusammen für gleichzeitige Messungen der Genaktivität des Wind-beta-Catenins P 53 und des KRAS-Signaltransduktionswegs unter Verwendung der in diesen Diagrammen angegebenen IRNA-Pools verwendet werden können. Relative Luciferase-Aktivitäten sind auf der Y-Achse dargestellt und siRNAs, die auf das angegebene Gen von Interesse abzielen, sind auf der X-Achse dargestellt. Zum Beispiel reduziert ein siRNA-Pool, der auf Beta-Catenin abzielt, die Aktivität des Beta-Catenin-Signalwegs des Windes, während er die Signalwege P 53 und KRA S nicht signifikant beeinflusst.

Bei dem Versuch, ein Multiplex-Reportersystem zu entwickeln, ist es wichtig, die Zelllinie von Interesse für die Transfektionsregion und die Reportersignalabsicht zu optimieren.