Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Protokolls ist es, die Abfrage der Genfunktion auf Genomebene durch gleichzeitige Überwachung mehrerer zellulärer Auslesungen zu ermöglichen. In dieser Demonstration werden Firefly RAN- und Cipro Dina Luciferase-basierte Reporter verwendet, um die Aktivität des P 53 WINT bzw. KRAS Signalwegs zu überwachen. Diese drei Reporter werden mit irna, die auf ein Gen von Interesse abzielt, in HCT one 16 Zellen, einer Darmkrebszelllinie, transeziert.

Anschließend werden die Aktivitäten von Glühwürmchen und Vanille-Luciferase in den Zelllysaten gemessen, während die Aktivität von Cipro DEA Luciferase gemessen wird. In der Kultur wird ein sezerniertes Enzym gemessen. Es werden mittlere Ergebnisse erzielt, die die Reproduzierbarkeit des Assay-Systems sowie die Fähigkeit zeigen, gemeinsame und einzigartige Wirkungen von Genen innerhalb dieser drei krebsrelevanten Signalwege aufzudecken.