Ein Visual Beschreibung der Dissektion der Hirnoberfläche Gefäßsystem und assoziierten Hirnhäute und der Aderhaut Plexus aus Rattenhirn

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Schalen- und Arachnoidalanteile der Hirnhäute und des zugehörigen arteriellen Gefäßsystems effizient und zügig zu präparieren, wobei die Oberfläche der Vorderhirnrinde und des Mittelhirns, des Thalamus und der Calli überlagert wird, sowie der Plexus choroideus aus den lateralen Ventrikeln entnommen zu werden. Dies wird erreicht, indem zuerst die Zirbeldrüse entfernt und die Hirnhäute und arteriellen Bäume, die mit dem Vorderhirn verbunden sind, getrennt werden. Zweitens werden die Arterien und Arterien auf der kortikalen Oberfläche vorsichtig entfernt, beginnend am ventralen Willis-Kreis und dann weiter zu den dorsalen kortikalen Oberflächen, so dass die Schale und die verbleibenden Arachnoidalmembranen mit dem Gefäßsystem verbunden bleiben, wobei sichergestellt wird, dass die Entnahme von benachbartem kortikalem Oberflächengewebe minimiert wird.

Als nächstes werden die Kortex und die Kommissurafasern vom Septum und Hippocampus wegpräpariert, wobei die lateralen Ventrikel freigelegt werden, um die Entnahme des Plexus choroideus zu ermöglichen. Schließlich wird der Hippocampus entfernt, wodurch der Thalamus und die Calli des Mittelhirns freigelegt werden. Anschließend werden die Hirnhäute und das zugehörige Gefäßsystem, das über dieser Region liegt, präpariert.

Letztendlich kann die Integrität und Spezifität der präparierten Hirnhäute und des zugehörigen arteriellen Gefäßsystems sowie des Plexus choroideus durch den Vergleich der Genexpressionsprofile jeder dieser Regionen bestimmt werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Forschung im Zusammenhang mit dem Gefäß zu beantworten, das die Gehirnfunktion unterstützt. Es enthält Ähnlichkeiten und Vergleiche sowie Unterschiede in der Funktion des Plexus choroideus im Vergleich zu den Hirnhäuten und den damit verbundenen arteriellen Gefäßen in Bezug auf den Blutfluss, die Liquorfunktion, neurotoxische Beleidigungen und Hirntraumata.

Um dieses Protokoll zu beginnen, legen Sie Gehirne, die gerade von Ratten unmittelbar nach der Euthanasation entnommen wurden, fünf Minuten lang in eiskalte, normale Kochsalzlösung. Es ist wichtig, das Gehirn vor der Präparierung so lange abkühlen zu lassen, damit die vier Hirnhäute und die zugehörigen arteriellen Gefäße oder MAV von der Oberfläche der Rinde getrennt werden können. Legen Sie dann das Gehirn auf den Boden einer Petrischale aus Glas, die auf Eis mit einem Zentimeter Eis, kalter, normaler Kochsalzlösung oder 0,1 molar Natriumphosphat gepufferter Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von 7,4 ruht.

Alle Dissektionen sollten mit dem Gehirn durchgeführt werden, meist in Kochsalzlösung getaucht. Um mit der Dissektion zu beginnen, legen Sie die dorsale Seite des Gehirns nach oben in die Petrischale und lokalisieren Sie die Zirbeldrüse, die sich in der am stärksten verhätschelten ventralen Region zwischen den beiden Hemisphären befindet. Nur rostral zum Kleinhirn und direkt unter oder an der Oberfläche der Hirnhäute.

Über den Colli. Entfernen Sie die Zirbeldrüse mit zwei kleinen Pinzetten mit gebogener Spitze. Beachten Sie, dass die Zirbeldrüse wie die Rinde rosa gefärbt ist, aber oft von Resten von Blut und Gefäßen umgeben ist, die von der Gehirnentnahme stammen.

Drehen Sie dann das Gehirn in der Petrischale auf den Kopf. Trennen Sie dann die Wirbelarterie und kleinere Arterien und Hirnhäute, die die Pons bedecken, von den Hirnhäuten und Gefäßen des Vorderhirns. Beginnen Sie als Nächstes mit der Entfernung des MAV.

Es ist wichtig, ventral mit dem Präparierprozess mit den großen Arterien des Willis-Kreises, den mittleren Hirnarterien und den vorderen Arterien zu beginnen. Verwenden Sie als Nächstes, beginnend mit einer der beiden Hemisphären, eine kleine Pinzette mit gebogener Spitze, um die hintere Kommunikationsarterie direkt hinter dem inneren Karotisanschluss zu durchtrennen und so die vorderen und hinteren Arterienbäume des Vorderhirns zu trennen. Wiederholen Sie dann den gleichen Vorgang für die kontralaterale Hemisphäre.

Greifen Sie nun die MCA und die Arteria anterior mit der Pinzette sanft in anteriore dorsale Richtung, so dass das MAV, das die ventrale anteriore Rinde bedeckt, über und um den Riechtrakt angehoben wird. Dadurch wird ein Großteil des MAV, das den vorderen Kortex bedeckt, entfernt. Drehen Sie das Gehirn in einem Winkel von 45 bis 90 Grad zur Petrischale, so dass die lateralen, vorderen Regionen des MAV, die die lateralen kortikalen Regionen umgeben, vom Kortex befreit werden können, greifen Sie das MCA und die zugehörigen Arterien und ziehen Sie sanft dorsal entlang des Kortex.

Bei Bedarf können die Enden der Pinzette verwendet werden, um die großen Arterien während der Dissektion aus der Rinde zu heben und zu befreien. Entfernen Sie nun die hinteren lateralen Bereiche des MAV. Beachten Sie, dass es am besten ist, während dieses Entnahmeprozesses von einer Hemisphäre zur anderen zu wechseln, um sicherzustellen, dass das MAV kalt und hydratisiert bleibt. Wechseln Sie auch die Hemisphäre, wenn Sie auf einen Widerstand bei der Befreiung des MAV aus der Rinde stoßen.

Um schließlich die dorsalen Regionen des MAV zu entfernen, die den primären somatosensorischen und motorischen Kortex umgeben, drehen Sie die dorsale Seite des Gehirns nach oben, um diesen Abschnitt vom Gehirn zu befreien, und verwenden Sie die Enden der Pinzette entlang des Sinus sagittalis. Dieser Teil des geernteten MAV kann entweder vorübergehend in eiskalter Kochsalzlösung aufbewahrt werden, bis er für Tests und Analysen benötigt wird, oder für die spätere Verarbeitung eingefroren werden. Oft bleibt das MAV, das die hintersten koddelen Regionen der Hirnrinde abdeckt, angeheftet.

Die Entfernung wird in einem nachfolgenden Abschnitt dieses Videos gezeigt. Um die erste Position des Plexus choroideus zu entfernen, die Rückenseite des Gehirns nach oben und halten Sie ihn mit der größeren Pinzette an Ort und Stelle. Schieben Sie dann die kleinere Pinzette durch die Mittellinie zwischen den Hemisphären nach unten und stechen Sie mit den Enden durch den Kortex und das Corpus callosum in die Spitze der Mittellinie des Hippocampus.

Als nächstes ziehen Sie mit der Pinzette den Kortex mit Kallosum vom dorsalen Hippocampus und Septum weg, wodurch der größte Teil des lateralen Ventrikels freigelegt wird. Der Plexus choroideus kann durch die wellenförmige rote Linie lokalisiert und identifiziert werden, die die große Arterie abgrenzt, die über seine Länge verläuft. Hebeln Sie mit den beiden Enden der Pinzette die Seitenwände des dritten Ventrikels ab und vergrößern Sie ihn an seinem verhätscheltesten Ende.

Ziehe dann mit der kleinen Pinzette dieses Ende des Plexus choroideus frei. Als nächstes vergrößern Sie mit der Pinzette den vorderen Bereich zwischen dem Septum und der Putamenregion caudatus und ziehen den Plexus choroideus auch an diesem Ende frei. Führen Sie den gleichen Eingriff auch an der kontralateralen Hemisphäre durch, um den zweiten verbleibenden Plexus choroideus zu erhalten.

Auch hier kann dieses Gewebe entweder vorübergehend in Eis, Kälte, Kochsalzlösung aufbewahrt oder für die spätere Verarbeitung eingefroren werden. Um das verbleibende MAV zu entfernen, das die hintersten verwöhnten Regionen des Kortex bedeckt, entfernen Sie zunächst den gesamten Hippocampus von beiden Hemisphären und legen Sie das MAV über dem Thalamus und den Colliculi frei. Beachten Sie, dass die Entfernung dieses Teils des MAV viel weniger schwierig ist als die Entfernung aus dem Kortex für den verbleibenden MAV.

Durch das Greifen des größeren Gefäßsystems, das über dem vorderen Teil des Thalamus liegt, und sanftes Ziehen an der Kette, wird dieses Gefäßsystem mit dem supra kocurricularen Netzwerk verbunden und versorgt den dorsalen Hippocampus und das dorsale Thalamusnetzwerk mit Blut. Ziehen Sie sich hätscheln weg und schließlich wird das Supra-Netzwerk befreit und die letzten Teile des verhätschelten arteriellen Kreises können erreicht werden. Zu diesem Zeitpunkt muss mehr Sorgfalt darauf verwendet werden, das verbleibende MAV auf der Oberfläche des linearen, auditiven und visuellen Kortex der granularen Retros zu entfernen.

Alle verbleibenden posterioren ventralen kortikalen MAV-Schnitte, die mit diesem zweiten Thalamus- und Calli-MAV-Schnitt entnommen wurden, sollten entfernt und dem ersten kortikalen MAV-Schnitt hinzugefügt werden, wenn sie separat analysiert werden sollen. Um die Genexpressionsprofile zwischen dem parietalen Kortex des Striatums und den MAV-Regionen unter Kontrollbedingungen zu vergleichen, kann die Genexpressionsanalyse unter Verwendung des gesamten Rattengenoms von Agilent 0 1 4 8 7 9 und vier x 44.060 mer Oligonukleotidarrays durchgeführt werden. Weitere Details zur Verarbeitung, zum Scannen und zur Erstspeicherung der Daten finden Sie in Thomas et al.

Wenn das Präparieren korrekt ausgeführt wird. Das resultierende MAV-Gewebe sollte in zwei intakten Einheiten mit einem Gesamtgewicht von etwa 35 bis 45 Milligramm vorliegen. Das anfänglich präparierte MAV, das den größten Teil des Kortex umgibt, sollte etwa 25 Milligramm wiegen, und dasjenige, das den Thalamus, die Calli und den okzipitalen Kortex bedeckt, sollte etwa 15 Milligramm wiegen.

Das Gewebe sollte von dem Restblut im Gefäßsystem leicht rosa gefärbt sein. Der entnommene bilaterale Plexus choroideus sollte in zwei intakten Gewebeproben mit einem Gewicht von jeweils ein bis zwei Milligramm vorliegen, wie hier zu sehen. Hier sehen wir einen Vergleich der Genexpressionsprofile im striatum, parietalen Kortex und MAV unter Kontrollbedingungen.

Das obere Diagramm zeigt die Expression im Striatum im Vergleich zum parietalen Kortex. Während das untere Diagramm die Expression im MAV im Vergleich zum parietalen Kortex zeigt, ist zu sehen, dass das Striatum und der parietale Kortex viel enger miteinander verwandt sind als der MAV. Hier sehen wir die differentielle Genexpression in MAV als Reaktion auf Hyperthermie im Vergleich zur Kontrolle, als Reaktion auf Amphetamin im Vergleich zur Kontrolle und in Hyperthermie im Vergleich zu Amphetamin.

Schließlich sehen wir hier Gene mit einer mehr als 15-fachen Expression im MAV im Vergleich zum parietalen Kortex und Striatum, die durch ihre Funktion charakterisiert sind. Viele dieser Gene stehen in Verbindung mit dem Gefäßsystem und/oder dem Immunsystem. Andere Gene mit sehr großen Faltungsänderungen sind extrazelluläre Matrixproteine, Sautentransporter sowie der Lipid- und Retinsäurestoffwechsel

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, beim Präparieren des MAV geduldig zu sein. Es ist auch wichtig, dass das Gehirn während der gesamten Dissektion in isotonische Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung eingetaucht bleibt. Es wird auch empfohlen, den Schnitt des MAV an vier oder fünf Ratten zu üben, bevor Gewebe für die Generierung experimenteller Daten entnommen wird.