Name: Ein Visual Beschreibung der Dissektion der Hirnoberfläche Gefäßsystem und assoziierten Hirnhäute und der Aderhaut Plexus aus Rattenhirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Lernen Sie die Präparation der Hirnhäute und des Plexus chorioideus aus Rattenhirnen für neurovaskuläre Forschung. Diese Methode ermöglicht präzise Dissektion mit minimaler Gewebeschädigung.

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Obwohl nicht in der Video gezeigt wurden Ratten erste eine Überdosis von 300 mg / kg Pentobarbital gegeben, was zu einer Anästhesie in weniger als 3 min, und dann durch Enthauptung getötet. Ihre Gehirne wurden dann schnell, aber vorsichtig aus dem Schädel entfernt und gekühlt in eiskaltem Kochsalzlösung für 5 min. Es ist wichtig, damit das Gehirn abkühlen dieser Zeitspanne vor Sezieren des MAV so dass der MAV von der Oberfläche der Rinde getrennt werden kann (der Oberseite der Schicht I). Das Hirn wurde dann in den Boden einer Petrischale Glas ruht auf Eis, das voll war (1 cm tief) eiskalter physiologischer Kochsalzlösung oder 0,1 M Natrium-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH = 7,4 gestellt. Alle Präparation wird mit dem Gehirn zum größten Teil in Kochsalzlösung eingetaucht getan. Ein. Die Entfernung der Zirbeldrüse <ol><li> Platzieren des Gehirns dorsalen Seite nach oben (bezogen auf den Boden der Petrischale). Die Zirbeldrüse liegt am kaudalen ventralen Bereich zwischen den beiden Hemisphären nur rostral t liegter Kleinhirn (pineal Vertiefung), und ist direkt unterhalb oder an der Oberfläche der Hirnhaut über der Colliculi. Entfernen Sie die Zirbeldrüse erste mit zwei kleinen gebogenen Spitze Pinzette. Es ist rosa in der Farbe wie der Hirnrinde, wird aber oft in den Resten von Blut und Gefäßen verbleibende vom Gehirn entfernt umgeben. </li></ol> 2. Entfernen des MAV <ol><li> Flip das Gehirn über &quot;upside down&quot; und trennen Sie die A. vertebralis, kleineren Arterien und Meningen für den pons aus der Hirnhaut und Gefäßsystem des Vorderhirns. Entfernen des Vorderhirns MAV wird dann gestartet. Es ist wichtig, ventral beginnen in der Dissektion Prozess. Die großen großen Arterien aus dem Kreis der Willis, Mitte Hirnarterien (MCA) und der vorderen Arterien sind die stärksten und dienen als &quot;Gerüst&quot;, mit denen die kleineren oberflächlichen Arterien und Arteriolen des Pia- Membran kann dann aus dem Kortex der Rest der Hirnhaut entfernt werden. Siehe Überprüfung durch Scremin 7 für mErz visuelle Darstellungen und Details der Hirnoberfläche Gefäßsystem. </li><li> Beginnend mit beiden Hemisphären, verwenden Sie die kleine gebogene Spitze Pinzette die hintere kommunizieren Arterie unmittelbar hinter der A. carotis interna Stelle durchtrennen. So trennt die weitere vorderen und hinteren arteriellen Bäumen des Vorderhirns. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die kontralaterale Hemisphäre. </li><li> Ergreifen der MCA und der vorderen Arterie mit der Zange, ziehen in einer anterioren-dorsaler Richtung, so dass der MAV Abdecken des ventralen vorderen Kortex (piriformis, Riechtuberkel) über und um den Riechbahn angehoben wird. Dadurch wird ein Großteil der MAV für den vorderen Kortex (vereinzelten und Orbital). </li><li> Schalten Sie das Gehirn in einem 45 bis 90 ° Winkel zu der Petrischale. Die seitlichen, stärker vordere Bereiche des MAV umgebenden seitlichen kortikalen Regionen (Granulat abgeschottet sekundären somatosensorischen und auditorischen Cortex) kann aus der Rinde durch Ergreifen des MCA und zugehörigen arter befreities und vorsichtig dorsal entlang der Hirnrinde. Falls erforderlich, können die Enden der Zange zum Heben und befreien die großen Arterien aus der Rinde beim Präparieren werden. </li><li> Entfernen Sie nun die weitere hinteren seitlichen Regionen des MAV. (Beachten Sie, dass es am besten, von einer Hemisphäre zur anderen wechseln während dieser Ernte, um sicherzustellen, dass die MAV kalt und hydratisiert bleibt. Auch wenn der Widerstand bei der Befreiung der MAV aus der Rinde auf einer Hemisphäre Schalter auf der kontralateralen Hemisphäre gestoßen vorübergehend und gehen Sie dann wieder auf den ursprünglichen Hemisphäre später.) </li><li> Um die am dorsalen Bereiche des MAV umgebenden primären somatosensorischen entfernen und motorischen Kortex des Gehirns drehen dorsalen Seite nach oben (bezogen auf den Boden der Petrischale). Um endlich befreien die MAV aus dem Gehirn, verwenden Sie die Enden der Zange entlang der sagittalen Sinus. Dieser Teil des geernteten MAV kann entweder temporär beibehalten werden in eiskalter Kochsalzlösung bis zur Prüfung und Analyse eingefroren oder für eine spätere Verarbeitung. Oftdie MAV, welche die populärsten posterior / kaudalen Regionen des Kortex (entorhinalen, visuellen und auditiven Kortex meisten caudal) bleibt an der Hirnrinde. Seiner Entnahme wird später im Video, wenn die zwischen dem MAV retrosplenialen Cortex und die über den Colliculi seziert gezeigt. </li></ol> 3. Entfernen der Aderhaut Plexus <ol><li> Positionieren Sie das Gehirn Dorsalseite und halten Sie ihn mit den größeren Pinzette Drücken Sie die kleineren Pinzette nach unten durch die Mittellinie zwischen den Hemisphären und dann die Enden Punktion durch die Rinde und Corpus callosum (≈ -3,3 mm bregma) in der Spitze die Mittellinie des Hippocampus. </li><li> Verwenden Sie die Zange, um den Kortex mit callosum wegziehen aus dem dorsalen Hippocampus und Septum, Aussetzen meisten der Seitenventrikel. Der Plexus geortet und identifiziert werden durch die rote Wellenlinie Abgrenzung der Hauptverkehrsader, die ihre Länge läuft. Mit den beiden Enden der Zange, um die Seitenwände des dritten ven hebelntricle und vergrößern Sie es am meisten kaudalen Ende (≈ -4,3 mm bregma 8). </li><li> Mit den kleinen Zange, ziehen Sie dieses Ende des Plexus kostenlos. Dann die sehr Frontzahnbereich zwischen Septum und caudatus / Putamen (die meisten rostral Umfang ≈ 1,6 mm von Bregma) gehen und mit der Zange Vergrößern diesen Abschnitt des Ventrikels und ziehen Sie den Plexus kostenlos. Führen Sie den gleichen Vorgang auf der kontralateralen Hemisphäre, um den zweiten verbleibenden Plexus erhalten. Auch dieses Gewebe kann entweder temporär beibehalten werden in eiskaltem Kochsalzlösung bis zur Prüfung und Analyse oder gefroren für eine spätere Verarbeitung. </li></ol> 4. Beseitigung der verbleibenden MAV im 3. Ventrikel Über der Thalamus und die Colliculi ebenso wie die auf die mehr Caudal Regionen des Cortex einschließlich retrosplenialen, auditiven und visuellen Cortex <ol><li> Entfernen Sie den gesamten Hippocampus aus beiden Hemisphären Aussetzen der MAV über den Thalamus und colliculi. Die Entfernung vondieser Teil des MAV ist viel weniger schwierig als die Entfernung von MAV über den Kortex. </li><li> Ziehen Sie diesen Teil der MAV frei durch Ergreifen des größeren Gefäßen, die über dem vorderen Teil des Thalamus und vorsichtig kaudal. Das Gefäßsystem an die supra collicular Netzwerk verbunden und liefert Blut in den dorsalen Hippocampus und dorsalen Thalamus Netzwerk. Wegziehen kaudal und allmählich frei die supracollicular Netzwerk bis zum Erreichen der letzten Teile der Schwanzflosse arteriellen Kreis Gefäßsystem. An diesem Punkt muß mehr darauf geachtet werden, alle verbleibenden hinteren ventralen MAV auf der Oberfläche des körnigen retrosplenialen, primären akustischen und visuellen Kortex zu entfernen. Wie bei dem anderen Abschnitt des MAV Abdecken der mehreren vorderen Teile des Cortex, kann dieses Gewebe entweder temporär beibehalten werden in eiskalter Kochsalzlösung bis zur Prüfung und Analyse eingefroren oder für eine spätere Verarbeitung. Ein verbleibender hinteren ventralen MAV mit diesem zweiten MAV Abschnitt geerntet sollte ein entfernt werdend hinzugefügt, um die erste seziert MAV Abschnitt über die Hirnrinde, wenn sie getrennt analysiert werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Wenn die Dissektion korrekt ausgeführt wird, sollten die resultierenden MAV Geweben in zwei intakten Entitäten Wiegen etwa 35 bis 45 mg insgesamt sein. Die zunächst seziert MAV Umgebung die meisten der Cortex sollte etwa 25 mg und der MAV für den Thalamus wiegen, sollten colliculi und okzipitalen Kortex wiegen etwa 15 mg. Es sollte leicht rosa in der Farbe von der Restblut im Gefäßsystem. Die bilaterale Plexus choroideus geernteten sollte in zwei intakten Gewebeproben mit jedem Wägevorgang 1 bis 2 mg liegen. Obwohl überschüssiges Wasser aus dem MAV entfernt werden vor der Lagerung oder Verarbeitung mit einem Papiertaschentuch, wie sie in der Linse Reinigung verwendet, um Gewebe zu vermeiden ist es nicht eine gute Idee, um überschüssiges Wasser aus dem seziert Plexus zu entfernen. Abbildung 1 wurde für generierte Vergleichen der Expression profil<html> es in drei Regionen (Striatum, parietalen Kortex und MAV) unter kontrollierten Bedingungen mit Agilent-014.879 Whole Rat Genome 4x44K 60mer Oligonukleotid-Arrays (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO Accession # GPL7294; GSE23093 und GSE29733, die anwesend sind, der NCBI GEO-Repository). Die beiden Kurven in der Figur zeigen die Expression bildlich in 1) das Striatum des parietalen Kortex verglichen und 2) der MAV der Parietalkortex verglichen. Es ist klar, dass das Striatum und Parietalkortex viel enger beieinander liegen als der MAV verwandt sind. Die Daten Vergleich der Plexus mit der MAV wird in einer zukünftigen Veröffentlichung vorgelegt. Jedoch ist es wahrscheinlich, dass die Profile in der Expression und MAV Plexus choroideus näher aneinander als sie an das Striatum und Parietalkortex sind verwandt. Abbildung 2 zeigt die differentielle Genexpression als Reaktion auf Hyperthermie (EIH) versus AMPH im Vergleich MAV zu kontrollieren und zu einander. Inhalt &quot;&gt; Die Genexpression von mehr als 11.000 Gene, die mit offiziellen NCBI-Gen Symbole in MAV von Kontrolltieren wurde die im Striatum und parietalen Kortex aufgenommen verglichen. Über 2000 dieser Gene hatten ein 2,5-fach oder mehr unterschiedlichen Ausdruck in der MAV im Vergleich zu den zwei neuronale-reiche Gewebe und 550 Gene hatte eine 10-fach größere Differenz in Ausdruck. Etwas mehr als 40% (253) von diesen waren Gene mit einer verringerten Expression von 10-fach oder mehr in MAV und wurden bzgl. neuronale Funktion. Es gab 343 Genen mit über eine 10-fache oder größer Expression in MAV gegenüber Parietalkortex und Striatum. Diese Liste von Genen als Startpunkt, mit denen wurde verwendet, um Gene mit einer sehr hohen Anreicherung im MAV bestimmen. Tabelle 1 listet die Gene mit mehr als 15-fach, um die Expression in MAV Parietalkortex und Striatum verglichen und kategorisiert sie hinsichtlich Funktion. Viele dieser Gene an das vaskuläre System und / oder das Immunsystem verwandt waren. Diese Types von Genen sollte etwa 5 angereichert werden - bis 10 - fach bis wegen der erhöhten Vaskulatur selbst und Blut darin. Aber auch für Gene mit bekannten allgemeinen vaskulären Funktionen, eine Erhöhung über 15-fach zeigt Anreicherung in MAV. Es gab auch Anzahlen von Genen, die mit sehr großer fach Veränderungen waren: 1) Proteine ​​der extrazellulären Matrix (nicht spezifisch an Vaskulatur Verwandte), 2) gelösten Transportern und 3) Lipid und Retinsäuremetabolismus. Wie gut, einige Wachstum und Differenzierung Gen oder Transkriptionsfaktoren gefunden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vergleich der Genexpression in MAV mit parietalen Kortex und Striatum. Volcano Plot Vergleich der Genexpression des parietalen Kortex und Striatum (oben plot) und dem parietalen Kortex und MAV (unten Plot). Die roten Symbole bezeichnen die Gene, die signifikant betwe sinden Regionen p &lt;0,05 und eine 1,5-fache oder mehr unterschiedliche Expression zwischen den Regionen. Die schwarzen Symbole repräsentieren Gene, die nicht wesentlich zwischen den Regionen unterscheiden (p&gt; 0,05) und weniger als das 1,5-fache, die sich in Ausdruck. Die rosa Symbole zeigen Gene mit weniger als einer 1,5-fachen Unterschied in der Expression, aber statistisch signifikant bei p &lt;0,05. Die gelben Symbole Identifizierung von Genen, die eine 1,5-fache oder mehr Ausdruck haben, aber diese Änderung ist nicht statistisch signifikant bei p &lt;0,05. Abkürzungen AMPH Amphetamin EIH umwelt-induzierte Hyperthermie MAV Hirnhäute und zugehörige zerebrale Gefäßsystem Norm normothermen steuert <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig2.jpg" /> Abbildung 2. Auswirkungen der Hyperthermie und Amphetamin auf die Genexpression in MAV. Volcano Parzellen verglichenGenexpressionsniveaus im MAV nach Kochsalzlösung, EIH oder AMPH an der 3 hr Zeitpunkt. Die roten Symbole deuten die Gene, die als nicht signifikant unterschiedlich, während die schwarzen Punkte / Kreise Genen, die nicht signifikant zwischen Regionen unterscheiden repräsentieren. Zusätzliche statistische Analyse wurde verwendet, um zu überprüfen, welche die Expression Unterschiede zwischen der Kontrolle und Behandlung in der Tat statistisch signifikant waren. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> MAV Expression Gehirn Expression </td><td fo:width="4.5in"> NCBI Gene Symbole </td><td fo:width="1.5in"> Tissue Spezifität oder gemeldet Funktion (en) </td></tr><tr><td> &gt; 50-fach </td><td> ANXA2 a, Col8a1, Des, ESM1, Glycam1, Kl a, Lect1, LEPR, Lum, MYH11, Ogn, Tagln, Thbs2, TNNT2 </td><td> Gefäßsystem &amp; Heart </td></tr><tr><td> &gt; 50-fach </td><td> CCL19, CD74 a, Defb1, Lrrc21, MGL1, Mrc1, Msln, Pla2g5, PRG4, RT1-Bb, RT1-Da </td><td> Immune System </td></tr><tr><td> &gt; 50-fach </td><td> Adh1, Aebp1, Aldh1a2, GSTM2 </td><td> Retinsäure &amp; Lipid-Verarbeitung </td></tr><tr><td> &gt; 50-fach </td><td> Cdh1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, GPC3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, TSPAN8 </td><td> Extrazellulären Matrix &amp; Zell-Zell-Verbindungen </td></tr><tr><td> &gt; 50-fach </td><td> AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr </td><td> Ion &amp; Solute Homöostase </td></tr><tr><td> &gt; 50-fach </td><td> AlX3, CDKN1C, FOXC2, IGFBP2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, sFRP1, TBX15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 </td><td> Development &amp; Transcription Verordnung </td></tr><tr><td> &gt; 50-fach </td><td> Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 </td><td> Unknown &amp; Sonstiges </td></tr><tr><td> 30 bis 50-fache </td&gt; <td> ANXA1 a, Angpt2, C6 a, GJB2, Ptgis, Thbd, TIMP1 </td><td> Gefäßsystem &amp; Heart </td></tr><tr><td> 30 bis 50-fache </td><td> Casp12, CCL2, Ccr1, CD14, CXCL10 Ifitm3, Klra5, LGALS1, LGALS3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, SPP1, XCL1 </td><td> Immune System </td></tr><tr><td> 30 bis 50-fache </td><td> Col6a3, Cpxm1, EFEMP1, Fmod, MGP, NID2 </td><td> Extrazellulären Matrix &amp; Zell-Zell-Verbindungen </td></tr><tr><td> 30 bis 50-fache </td><td> Cp, CUBN, GCGR, S100A6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 </td><td> Ion &amp; Solute Homöostase </td></tr><tr><td> 30 bis 50-fache </td><td> Cfd, CH25H, CRABP2, Rarres2 </td><td> Retinsäure &amp; Lipid-Verarbeitung </td></tr><tr><td> 30 bis 50-fache </td><td> BMP6, Casp12, DAB2 Folr1, Igf2, Msx1, Tbx18, TWIST1, Wnt5b </td><td> Development &amp; Transcription Verordnung </td></tr><tr><td> 30 bis 50-fache </td><td> Cela3b, CLN6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim </td><td> Unknown &amp; Sonstiges </td></tr><tr><td> 15 bis 30-fache </td><td> Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf a, CNN1, Cox8h, Ctsk, F13a1, GJA5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, PROS1, RT1-Ba, Serpinb10, SERPING1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnip a, Vamp5, Vtn </td><td> Gefäßsystem &amp; Heart </td></tr><tr><td> 15 bis 30-fache </td><td> Ada a, BST2, Ccl6, CD40, CD68, CTSC, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, FMO1, GLIPR1, IER3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-Db1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 </td><td> Immune System </td></tr><tr><td> 15 bis 30-fache </td><td> Adamtsl4, COL1A1, Crb3, Dpt, Egfl3, FBN1, Fbln1, FBLN5, Fn1, ITGB4, Lama2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, MMP14, Mmp23, PPIC, SERPINH1, TIMP3 </td><td> Extrazellulären Matrix &amp; Zell-Zell-Verbindungen </td></tr><tr><td> 15 bis 30-fache </td><td> Cybrd1, Selenbp1, SLC2A4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 </td><td> Ion &amp; Solute Homöostase </td></tr><tr><td> 15 bis 30-fache </td><td> AGPAT2, Bdh2, CYP26B1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, PON3, RBP1, RBP4 </td><td> Retinsäure &amp; Lipid-Verarbeitung </td></tr><tr><td> 15 bis 30-fache </td><td> ATF3, DKK4, Eya2, Ifitm7, LTBP1, Mustn1, Nr2f2, PTRF, SphK1, TGFBI, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, ZIC1 </td><td> Development &amp; Transcription Verordnung </td></tr><tr><td> 15 bis 30-fache </td><td> Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, DSE, Enpep, Enpp2, Epn3, FLNA, FMO3, GNMT, Gprc5c, HSPB1, Klc3, KRT18, Krt19, MDK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, RIN3, Spag11, SULT1A1, Tmem106a, Wfikkn2 </td><td> Unknown &amp; Sonstiges </td></tr></tbody></table> * Genes in der Tabelle enthalten sind sowohl mehr als 15-fach über Expression im Striatum und Pariet seinal Cortex und 5-fach über dem Hintergrund Ebenen. Das untere der beiden Verhältnissen (MAV / Striatum oder MAV / parietalen Cortex) für jedes Gen wurde für die Gruppierung verwendet. a Gene werden in Endothelzellen gefunden, aber auch wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Vermittlung Immunantworten. Tabelle 1. Genes mit einem 15-fach * oder mehr erhöhte Expression in MAV im Vergleich zum Striatum und parietalen Kortex.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren. Die hier vorgestellte Arbeit kann nicht notwendigerweise die Meinung der Food and Drug Administration.

Technische Aspekte der MAV und Plexus Dissektion Es ist kritisch, während der Dissektion der MAV, damit das Gehirn &quot;eingetaucht&quot; die meiste Zeit in dem normalen Kochsalzlösung oder Natriumphosphat-gepufferte Kochsalzlösung. So dass die MAV und Kortex beim Präparieren austrocknen wird in der MAV Einhaltung eng an Rindenschicht I. Dies die Menge des kortikalen Gewebes mit der MAV und / oder das Ergebnis in der Unfähigkeit, diese Einhaltung MAV Abschnitte aus der Rinde zu entfernen geerntet erhöhen führen. Außerdem ist Geduld erforderlich beim Präparieren. Noch einmal, wenn begegnet man gewissen Widerstand beim Entfernen des MAV vom Kortex in einer Hemisphäre beim Präparieren, auf die andere Halbkugel umzuschalten und gehen später wieder zu der Seite, wo Widerstand angetroffen wurde. Diese Methode dauert einige Übung, um perfekte und erfordert etwa 5 bis 15 &quot;Praxis&quot; Dissektionen, bevor eine konsequent einheitliche Ernte von MAV Gewebe erreicht. Das Verfahren zum Starten der Dissektion und removal des MAV am arteriellen Kreis an der Unterseite des Gehirns erleichtert die Entfernung der Hirnhaut mit dem größeren Gefäßsystem als Träger &quot;Gerüst&quot;. Ein Großteil des ursprünglich im Blut MAV Gefäßsystems nach der Tötung sollte während der Dissektion ausgestoßen werden, und weniger als 5% der RNA aus MAV geerntet sollte von Blut Ursprungs sein. Es ist möglich, fast alles Blut durch Perfusion des Tieres mit 50 bis 70 ml Kochsalzlösung, mittels histologischer Techniken, vor Dekapitation und Gehirn Entfernung zu entfernen. Allerdings ist es dann wesentlich schwieriger, die MAV Geweben beim Präparieren visualisieren. Die drei wahrscheinlichsten Quellen von &quot;Verunreinigung&quot; der MAV Gewebe sind die Zirbeldrüse, kortikale Schicht I Gewebe und restliches Riechkolben Gewebe aber es ist auch möglich, Hypophyse Gewebe bei der Herstellung zu erhalten. Pineal Kontamination in der MAV erhält MAV enthaltend ein rund 1 bis 2 mm Durchmesser, die farbige Kugel dunkelrot ist nachgewiesen. Die primäre Funktionder Zirbeldrüse wird normalerweise als völlig verschieden von der MAV. Seine primäre Funktion ist es, Melatonin, das Aspekte des zirkadianen Rhythmus 9 regelt, und in Lipoxygenierung 10 von Lipidvorstufen produzieren. Obwohl das Gen Lox, die Lipoxygenase-Aktivität reguliert, wurde angenommen, dass in erster Linie im Erwachsenen Zirbeldrüse 10 zeigen unsere Ergebnisse, dass es auch konsequent anwesend signifikante Niveaus in MAV. Restliches kortikalem oder Riechkolben Kontamination Ergebnisse im pinkish stegartige MAV Gewebe mit etwa 1 bis 2 mm dichteren Geweben, die viel heller in der Farbe in ihr eingeschlossen sind. Dies kann durch &quot;schwimmt&quot; der MAV auf der Oberfläche des Puffers, und dann Entfernen der schwereren kortikalen oder Birne Geweben unter Verwendung der beiden Dissektionszange gesichtet werden. Bei Verunreinigungen des MAV aus Rindenschicht Ich Gewebe, Hypothalamus Gewebe oder die Zirbeldrüse vorhanden ist, dann mehrere Gene haben eine signifikantdeutlich mehr Ausdruck als das, was normalerweise in einem &quot;sauberen&quot; dissection vorhanden. Kontamination des MAV mit Zirbeldrüse wird höhere Expression Arylalkylamin-N-acetyltransferase (AANAT), die für Melatoninsynthese ist resultieren. Leider wenn pineal Verunreinigung tritt während MAV Dissektion, werden die Niveaus der Lox in MAV möglicherweise nicht genau bestimmt werden. Kontamination des MAV mit kortikalen Gewebe wird höhere Expression von Neuron-spezifische Gene wie hippocalcin (HPCA), Parvalbumin (Pvalb) und / oder neuronalen Pentraxin Rezeptor (Nptxr) führen. Kontamination MAV mit hypothalamischen Gewebe wird im höheren Expression des Wachstumshormons 1 (GH1), Proopiomelanocortin (POMC) führen. Für den Fall, dass einige Verunreinigungen existiert in den geernteten Geweben können die meisten dieser Gene identifiziert und nicht in Genexpressionsanalyse verwendet. Dies ist besonders wichtig für Gene, die in der zirkulierenden blood, die noch vorhanden sein können, in MAV oder der Aderhaut Plexus. Interpretting Genexpression Daten aus geernteten MAV und Plexus Der zerebrale Oberfläche (oberflächlich) Gefäßsystem zusammen mit den zugehörigen Hirnhäute (MAV) und der Plexus sind notwendig für die zerebrale Durchblutung und Liquor (CSF) Homöostase 4,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Das Gewebe Ernte ist geeignet für biochemische und physiologische Untersuchungen, und der MAV wurde gezeigt, dass sie empfindlich gegen Beschädigungen durch Amphetamin und Hyperthermie 1,2 durch Genexpressionsanalyse hergestellt. Diese Ergebnisse sind angemessen mit dem, was auch über schwere Hyperthermie und Exposition gegenüber Amphetaminen an das Gehirn Gefäßsystem im Allgemeinen 18,19,20 bekannt. Menschliche klinische Daten stützen die Überzeugung, dass die subduralen Gefäßsystem empfindlich auf durch Amphetamin und Methamphetamin 21,22 beschädigen. Wie gut, darunter die großen und kleinen zerebralen BlutgefäßverteilungenING die in der Pia-Schicht der Hirnhäute, die in MAV geerntet werden, sind potenziell hohes Interesse bei der Untersuchung concussive Arten von Kopfverletzungen 23,24 25. Die aktuelle Genexpressionsprofil ergab aus der MAV bedeutet, dass der Pia und möglicherweise die Arachnoidea Meningen kann eine größere Rolle als bei der Regulierung CSF Zusammensetzung erwartet spielen. In der Zukunft durch die Verwendung von Techniken Präpariermikroskop, kann es möglich sein, eine weitere Aufteilung der Gewebe umfassend den MAV so dass die pialen und Arachnoidea Membranen vom größeren arteriellen Gefäßsystem vorliegenden und ggf. voneinander getrennt werden können. Dies ermöglicht eine bessere Interpretation der Funktion eines jeden dieser drei Bestandteile des geernteten MAV.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Normale Kochsalzlösung (9 g Kochsalz / 1 Liter H 2 O) </td><td> Im Hause </td><td></td><td> Dissection-Puffer </td></tr><tr><td> 0,1 M Natriumphosphat pH 7,4 </td><td> Im Hause </td><td></td><td> Dissection-Puffer </td></tr><tr><td> Bone Rongeurs </td><td> Roboz </td><td> RS-8300 </td><td> Schädelknochen entfernt </td></tr><tr><td> Zange gebogenen Spitze (4 &quot;lang &amp; 0,8 mm breite Spitze) </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 oder RS-5137 </td><td> Präparierzange </td></tr><tr><td> Pinzetten-gerade Spitze (5,5 &quot;lang) </td><td> Roboz </td><td> RS-8124 oder RS-8104 </td><td> Thumb Kornzangen </td></tr></tbody></table>

ein visual beschreibung der dissektion der hirnoberfläche gefäßsystem und assoziierten hirnhäute und der aderhaut plexus aus rattenhirn

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

Diese Video-Präsentation wurde geschaffen, um eine Methode der Ernte die beiden wichtigsten stark vaskulären Strukturen zu zeigen, die ihren Wohnsitz nicht im Gehirn richtig, dass die Unterstützung Vorderhirn Funktion. Sie sind die Hirnoberfläche (oberflächliche) Gefäßsystem zusammen mit den zugehörigen Hirnhäute (MAV) und der Plexus, die notwendig für die zerebrale Durchblutung und Liquor (CSF) Homöostase sind. Das Gewebe geerntet ist für biochemische und physiologische Untersuchungen, und der MAV wurde gezeigt, dass sie empfindlich gegen Beschädigungen durch Amphetamin und Hyperthermie 1,2 hergestellt. Wie gut, sind die großen und kleinen zerebralen Blutgefäßverteilungen in MAV geerntet potenziell hohes Interesse bei der Untersuchung concussive Arten von Kopfverletzungen. Die MAV in dieser Präsentation seziert besteht aus der Pia-und einige der Arachnoidea (weniger Dura) der Hirnhaut und der großen und kleinen Hirnoberfläche Gefäßsystem. Der Plexus choroideus seziert ist die Struktur, in der l liegtateral Ventrikel von Oldfield und McKinley 3,4,5,6 beschrieben. Die Verfahren zum Ernten diese beiden Geweben verwendet erleichtern auch die Ernte von regionalen kortikalen Gewebe frei von Hirnhaut und größere Oberfläche zerebrale Gefäßsystem und ist kompatibel mit anderen Ernten Hirngewebe wie Striatum, Hypothalamus, Hippocampus, etc. Die Dissektion von den zwei Geweben dauert 5 bis 10 min insgesamt. Die Genexpressionsniveaus zur seziert MAV und Plexus choroideus, wie gezeigt und beschrieben in dieser Darstellung kann bei GSE23093 (MAV) und GSE29733 (Plexus choroideus) am NCBI GEO Repository. Diese Daten wurden, und wird verwendet, um weitere Verständnis der Funktionsweise des MAV und Plexus choroideus und wie neurotoxischen Ereignisse wie schwere Hyperthermie und AMPH beeinträchtigen ihre Funktion.

Diese Video-Präsentation zeigt ein Verfahren zur Ernte der beiden wichtigsten stark vaskuläre Strukturen, die Vorderhirn Funktion unterstützen. Sie sind die Hirnoberfläche (oberflächliche) Gefäßsystem zusammen mit den zugehörigen Hirnhäute (MAV) und der Plexus, die notwendig für die zerebrale Durchblutung und Liquor (CSF) Homöostase sind.

Ein Visual Beschreibung der Dissektion der Hirnoberfläche Gefäßsystem und assoziierten Hirnhäute und der Aderhaut Plexus aus Rattenhirn

Diese Videopräsentation wurde erstellt, um eine Methode zur Entnahme der zwei wichtigsten, hochvaskularisierten Strukturen zu demonstrieren, die sich nicht innerhalb des Gehirns befinden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die der Hirnrinde des Vorderhirns und des Mittelhirns, des Thalamus und der Balken überlagernden Häute der Hirnhäute – insbesondere die Peel- und Arachnoidea-Anteile – sowie die damit verbundene arterielle Gefäßversorgung effizient und zügig zu dissezieren und gleichzeitig den Plexus choroideus aus den Seitenventrikeln zu gewinnen. Dazu wird zunächst die Zirbeldrüse entfernt und die den Vorderhirnregionen anliegenden Meningen sowie die arteriellen Gefäßbäume gelöst. Anschließend werden die Arterien und Arteriolen auf der kortikalen Oberfläche vorsichtig abgetrennt, beginnend am ventralen arteriellen Kreis nach Willis, und dann weiter zur dorsalen kortikalen Oberfläche fortgesetzt, sodass die Peel- und verbleibenden Arachnoidea-Membranen weiterhin mit der Gefäßversorgung verbunden bleiben, wobei darauf zu achten ist, die Mitnahme benachbarter kortikaler Gewebeanteile auf ein Minimum zu beschränken.Anschließend werden der Kortex und die kommissuralen Fasern vom Septum und Hippocampus abpräpariert, wodurch die Seitenventrikel freigelegt werden, um den Plexus chorioideus zu gewinnen. Schließlich wird der Hippocampus entfernt, wodurch Thalamus und Kolliculi des Mittelhirns freigelegt werden. Die über dieser Region liegenden Meningen und die zugehörige Gefäßversorgung werden dann präpariert.Letztlich kann die Integrität und Spezifität der präparierten Meningen und der assoziierten arteriellen Gefäße sowie des Plexus choroideus durch den Vergleich der Genexpressionsprofile jedes dieser Bereiche bestimmt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Forschung zu beantworten, die sich auf das die Gehirnfunktion unterstützende vaskuläre System beziehen. Dazu gehören Ähnlichkeiten sowie Vergleiche und Unterschiede in der Funktion des Plexus choroideus im Vergleich zu den Meningen und deren assoziiierter arterieller Gefäßversorgung hinsichtlich Durchblutung, CSF-Funktion, neurotoxischer Noxen und Hirntrauma.Um dieses Protokoll zu beginnen, legen Sie Gehirne, die unmittelbar nach der Tötung aus Ratten entfernt wurden, sofort für fünf Minuten in eiskalte, normale Kochsalzlösung. Es ist wichtig, dem Gehirn vor der Dissektion ausreichend Zeit zur Abkühlung zu geben, damit die vier Hirnhäute und die zugehörige arterielle Gefäßversorgung oder MAV von der Oberfläche der Großhirnrinde getrennt werden können. Danach wird das Gehirn in den Boden einer Glas-Petri-Schale gelegt, die auf Eis mit einem Zentimeter eiskalter, normaler Kochsalzlösung oder 0,1-molarer, mit Natriumphosphat gepufferter Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von 7,4 steht.Die gesamte Dissektion sollte durchgeführt werden, während das Gehirn größtenteils in Salzlösung eingetaucht ist. Um die Dissektion zu beginnen, lege das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben in die Petrischale und identifiziere die Zirbeldrüse, die sich im kaudalsten ventralen Bereich zwischen den beiden Hemisphären befindet. Unmittelbar kranial zum Kleinhirn und direkt unterhalb oder an der Oberfläche der Hirnhäute.Über den Kollinen. Entfernen Sie die Zirbeldrüse mit zwei kleinen gebogenen Spitzpinzetten. Beachten Sie, dass die Zirbeldrüse rosa gefärbt ist wie die Hirnrinde, jedoch häufig von Resten von Blut und Blutgefäßen umgeben ist, die bei der Entfernung des Gehirns zurückgeblieben sind.Drehen Sie das Gehirn anschließend in der Petrischale um, sodass es verkehrt herum liegt. Trennen Sie dann die Arteria vertebralis sowie die kleineren Arterien und die das Pons bedeckenden Meningen von den Meningen und der Gefäßversorgung des Vorderhirns ab. Entfernen Sie danach das MAV.Es ist wichtig, den Präparationsvorgang ventral mit den großen Arterien des arteriellen Gefäßkreises von Willis, den mittleren Hirnarterien und den vorderen Arterien zu beginnen. Danach wird, ausgehend von einem der beiden Hemisphären, mit einer kleinen gebogenen Pinzette die hintere Verbindungsarterie direkt hinter dem Übergang zur Arteria carotis interna durchtrennt, wodurch die vorderen und hinteren arteriellen Äste des Vorderhirns getrennt werden. Anschließend wird derselbe Vorgang für die kontralaterale Hemisphäre wiederholt.Jetzt die A. cerebri media und die vordere Arterie mit der Pinzette fassen und vorsichtig in anteriodorsaler Richtung ziehen, sodass die das ventrale vordere Kortexgebiet bedeckende weiche Hirnhaut (MAV) über den Riechnerv und herum angehoben wird. Dadurch wird ein Großteil der das vordere Kortexgebiet bedeckenden MAV gelöst. Drehen Sie das Gehirn um einen Winkel von 45 bis 90 Grad relativ zur Petrischale, sodass die seitlichen, weiter vorne liegenden Bereiche der MAV, die die lateralen kortikalen Regionen umgeben, vom Kortex gelöst werden können; fassen Sie anschließend die A. cerebri media und die zugehörigen Arterien und ziehen Sie vorsichtig dorsal entlang des Kortex.Gegebenenfalls können die Enden der Pinzette verwendet werden, um die großen Arterien während der Präparation vom Kortex abzuheben und zu lösen. Entfernen Sie nun die weiter posterior gelegenen lateralen Bereiche des MAV. Beachten Sie, dass es empfehlenswert ist, während dieses Gewinnungsprozesses zwischen den Hemisphären zu wechseln, um sicherzustellen, dass der MAV kalt und feucht bleibt; wechseln Sie ebenfalls die Hemisphäre, wenn beim Lösen des MAV vom Kortex ein Widerstand spürbar ist.Schließlich, um die am stärksten dorsalen Bereiche der MAV, die den primären somatosensorischen und motorischen Kortex umgeben, zu entfernen, drehen Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben, um diesen Bereich vom Gehirn zu lösen, und verwenden Sie die Spitzen der Pinzette entlang des Sinus sagittalis. Dieser Teil der gewonnenen MAV kann vorübergehend in eiskalter Kochsalzlösung aufbewahrt werden, bis er für Tests und Analysen benötigt wird, oder zur späteren Verarbeitung eingefroren werden. Häufig bleibt die MAV, die die am stärksten posterior gelegenen Bereiche des Kortex bedeckt, daran angeheftet.Die Entfernung wird in einem späteren Abschnitt dieses Videos gezeigt. Um den Plexus choroideus zu entfernen, positionieren Sie zunächst das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben und halten Sie es mit der größeren Pinzette fest. Danach führen Sie die kleinere Pinzette entlang der Mittellinie zwischen den Hemisphären nach unten und nutzen deren Spitzen, um durch die Hirnrinde und den Balken in die obere Mittellinie des Hippocampus einzudringen.Verwenden Sie anschließend die Pinzette, um den Kortex mit dem Balken vom dorsalen Hippocampus und Septum wegzuziehen, wodurch der größte Teil des lateralen Ventrikels freigelegt wird. Das Plexus choroideus kann anhand der wellenförmigen roten Linie identifiziert werden, die die Hauptarterie markiert, welche sich über seine gesamte Länge erstreckt. Benutzen Sie die beiden Enden der Pinzette, um die seitlichen Wände des dritten Ventrikels aufzuleveren und diesen an seinem am weitesten innen liegenden Ende zu erweitern.Danach mit der kleinen Pinzette dieses Ende des Plexus choroideus lösen. Anschließend die Pinzette verwenden, um den vordersten Bereich zwischen Septum und Regio putamen caudatum zu erweitern, und den Plexus choroideus auch an diesem Ende lösen. Dieselbe Prozedur zudem am kontralateralen Hemisphäre durchführen, um den zweiten verbleibenden Plexus choroideus zu erhalten.Auch dieses Gewebe kann vorübergehend auf Eis, in kalter, salzhaltiger Lösung oder eingefroren bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt werden. Um den verbleibenden MAV, der die hintersten Kaudalregionen des Kortex bedeckt, zu entfernen, entfernen Sie zunächst den gesamten Hippocampus aus beiden Hemisphären, wodurch der MAV über dem Thalamus und den Colliculi freigelegt wird. Beachten Sie, dass die Entfernung dieses Teils des MAV deutlich einfacher sein wird als die Entfernung des MAV vom Kortex für den verbleibenden MAV.Indem man die größeren Blutgefäße erfasst, die den vorderen Teil des Thalamus überlagern, und vorsichtig am Coddly zieht, stellt man fest, dass diese Gefäße mit dem suprakokurrikulären Netzwerk verbunden sind und das dorsale Hippocampus- und dorsale Thalamusnetzwerk durchbluten. Ziehen Sie sanft am Coddly, bis das suprakokurrikuläre Netzwerk gelöst ist und die letzten Abschnitte des coddly arteriellen Kreises erreicht werden können. An diesem Punkt ist besondere Sorgfalt erforderlich, um verbleibende MAV von der Oberfläche der granulären retros linealen primären, auditiven und visuellen Kortexareale zu entfernen.Jegliche verbleibenden posterior-ventralen kortikalen MAV, die mit diesem zweiten thalamischen und callösen MAV-Abschnitt gewonnen wurden, sollten entfernt und dem ersten, separat analysierten kortikalen MAV-Abschnitt hinzugefügt werden. Als Nächstes kann zum Vergleich der Genexpressionsprofile zwischen Striatum, parietalem Kortex und MAV-Regionen unter Kontrollbedingungen eine Genexpressionsanalyse mittels Agilent 0 1 4 8 7 9 Whole Rat Genome, Four by 44.060-mer-Oligonukleotidarrays durchgeführt werden. Weitere Einzelheiten zur Aufarbeitung, zum Scannen und zur anfänglichen Datenspeicherung finden sich bei Thomas et al.Wenn die Dissektion korrekt durchgeführt wird, sollten die resultierenden MAV-Gewebe aus zwei intakten Einheiten bestehen, die zusammen etwa 35 bis 45 Milligramm wiegen. Die ursprünglich dissezierte MAV, die größtenteils den Kortex umgibt, sollte etwa 25 Milligramm wiegen, und diejenige, die Thalamus, Calli und okzipitalen Kortex bedeckt, sollte etwa 15 Milligramm wiegen.Das Gewebe sollte aufgrund des verbliebenen Blutes in der Gefäßstruktur leicht rosa gefärbt sein. Der gewonnene bilaterale Plexus choroideus sollte aus zwei intakten Gewebeproben bestehen, wobei jede ein bis zwei Milligramm wiegt, wie hier dargestellt. Hier sehen wir einen Vergleich der Genexpressionsprofile im Striatum, parietalen Kortex und MAV unter Kontrollbedingungen.Im oberen Diagramm wird die Expression im Striatum im Vergleich zum Parietalkortex gezeigt. Während im unteren Diagramm die Expression im MAV im Vergleich zum Parietalkortex dargestellt wird, ist erkennbar, dass das Striatum und der Parietalkortex untereinander viel enger verwandt sind als das MAV. Hier sehen wir die differentielle Genexpression im MAV als Reaktion auf Hyperthermie im Vergleich zur Kontrolle, als Reaktion auf Amphetamin im Vergleich zur Kontrolle sowie bei Hyperthermie im Vergleich zu Amphetamin.Schließlich sehen wir hier Gene mit einem mehr als 15-fach höheren Expressionsniveau in der MAV im Vergleich zum Parietalkortex und Striatum, charakterisiert nach Funktion. Viele dieser Gene stehen im Zusammenhang mit dem vaskulären System und/oder dem Immunsystem. Andere Gene mit sehr hohen Faltungsänderungen sind Proteine der extrazellulären Matrix, SLC-Transporter sowie Gene, die an dem Stoffwechsel von Lipiden und Retinsäure beteiligt sind.Während des Vorgehens ist es wichtig, bei der Dissektion der MAV Geduld zu bewahren. Ebenso wichtig ist es, das Gehirn während der gesamten Dissektion in isotonischer Salzlösung oder phosphatgepufferter Salzlösung untergetaucht zu halten. Außerdem wird empfohlen, den Abschnitt der MAV an vier oder fünf Ratten zu üben, bevor Gewebeproben zur Erzeugung experimenteller Daten gewonnen werden.

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