Ein Visual Beschreibung der Dissektion der Hirnoberfläche Gefäßsystem und assoziierten Hirnhäute und der Aderhaut Plexus aus Rattenhirn

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die der Hirnrinde des Vorderhirns und des Mittelhirns, des Thalamus und der Balken überlagernden Häute der Hirnhäute – insbesondere die Peel- und Arachnoidea-Anteile – sowie die damit verbundene arterielle Gefäßversorgung effizient und zügig zu dissezieren und gleichzeitig den Plexus choroideus aus den Seitenventrikeln zu gewinnen. Dazu wird zunächst die Zirbeldrüse entfernt und die den Vorderhirnregionen anliegenden Meningen sowie die arteriellen Gefäßbäume gelöst. Anschließend werden die Arterien und Arteriolen auf der kortikalen Oberfläche vorsichtig abgetrennt, beginnend am ventralen arteriellen Kreis nach Willis, und dann weiter zur dorsalen kortikalen Oberfläche fortgesetzt, sodass die Peel- und verbleibenden Arachnoidea-Membranen weiterhin mit der Gefäßversorgung verbunden bleiben, wobei darauf zu achten ist, die Mitnahme benachbarter kortikaler Gewebeanteile auf ein Minimum zu beschränken.

Anschließend werden der Kortex und die kommissuralen Fasern vom Septum und Hippocampus abpräpariert, wodurch die Seitenventrikel freigelegt werden, um den Plexus chorioideus zu gewinnen. Schließlich wird der Hippocampus entfernt, wodurch Thalamus und Kolliculi des Mittelhirns freigelegt werden. Die über dieser Region liegenden Meningen und die zugehörige Gefäßversorgung werden dann präpariert.

Letztlich kann die Integrität und Spezifität der präparierten Meningen und der assoziierten arteriellen Gefäße sowie des Plexus choroideus durch den Vergleich der Genexpressionsprofile jedes dieser Bereiche bestimmt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Forschung zu beantworten, die sich auf das die Gehirnfunktion unterstützende vaskuläre System beziehen. Dazu gehören Ähnlichkeiten sowie Vergleiche und Unterschiede in der Funktion des Plexus choroideus im Vergleich zu den Meningen und deren assoziiierter arterieller Gefäßversorgung hinsichtlich Durchblutung, CSF-Funktion, neurotoxischer Noxen und Hirntrauma.

Um dieses Protokoll zu beginnen, legen Sie Gehirne, die unmittelbar nach der Tötung aus Ratten entfernt wurden, sofort für fünf Minuten in eiskalte, normale Kochsalzlösung. Es ist wichtig, dem Gehirn vor der Dissektion ausreichend Zeit zur Abkühlung zu geben, damit die vier Hirnhäute und die zugehörige arterielle Gefäßversorgung oder MAV von der Oberfläche der Großhirnrinde getrennt werden können. Danach wird das Gehirn in den Boden einer Glas-Petri-Schale gelegt, die auf Eis mit einem Zentimeter eiskalter, normaler Kochsalzlösung oder 0,1-molarer, mit Natriumphosphat gepufferter Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von 7,4 steht.

Die gesamte Dissektion sollte durchgeführt werden, während das Gehirn größtenteils in Salzlösung eingetaucht ist. Um die Dissektion zu beginnen, lege das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben in die Petrischale und identifiziere die Zirbeldrüse, die sich im kaudalsten ventralen Bereich zwischen den beiden Hemisphären befindet. Unmittelbar kranial zum Kleinhirn und direkt unterhalb oder an der Oberfläche der Hirnhäute.

Über den Kollinen. Entfernen Sie die Zirbeldrüse mit zwei kleinen gebogenen Spitzpinzetten. Beachten Sie, dass die Zirbeldrüse rosa gefärbt ist wie die Hirnrinde, jedoch häufig von Resten von Blut und Blutgefäßen umgeben ist, die bei der Entfernung des Gehirns zurückgeblieben sind.

Drehen Sie das Gehirn anschließend in der Petrischale um, sodass es verkehrt herum liegt. Trennen Sie dann die Arteria vertebralis sowie die kleineren Arterien und die das Pons bedeckenden Meningen von den Meningen und der Gefäßversorgung des Vorderhirns ab. Entfernen Sie danach das MAV.

Es ist wichtig, den Präparationsvorgang ventral mit den großen Arterien des arteriellen Gefäßkreises von Willis, den mittleren Hirnarterien und den vorderen Arterien zu beginnen. Danach wird, ausgehend von einem der beiden Hemisphären, mit einer kleinen gebogenen Pinzette die hintere Verbindungsarterie direkt hinter dem Übergang zur Arteria carotis interna durchtrennt, wodurch die vorderen und hinteren arteriellen Äste des Vorderhirns getrennt werden. Anschließend wird derselbe Vorgang für die kontralaterale Hemisphäre wiederholt.

Jetzt die A. cerebri media und die vordere Arterie mit der Pinzette fassen und vorsichtig in anteriodorsaler Richtung ziehen, sodass die das ventrale vordere Kortexgebiet bedeckende weiche Hirnhaut (MAV) über den Riechnerv und herum angehoben wird. Dadurch wird ein Großteil der das vordere Kortexgebiet bedeckenden MAV gelöst. Drehen Sie das Gehirn um einen Winkel von 45 bis 90 Grad relativ zur Petrischale, sodass die seitlichen, weiter vorne liegenden Bereiche der MAV, die die lateralen kortikalen Regionen umgeben, vom Kortex gelöst werden können; fassen Sie anschließend die A. cerebri media und die zugehörigen Arterien und ziehen Sie vorsichtig dorsal entlang des Kortex.

Gegebenenfalls können die Enden der Pinzette verwendet werden, um die großen Arterien während der Präparation vom Kortex abzuheben und zu lösen. Entfernen Sie nun die weiter posterior gelegenen lateralen Bereiche des MAV. Beachten Sie, dass es empfehlenswert ist, während dieses Gewinnungsprozesses zwischen den Hemisphären zu wechseln, um sicherzustellen, dass der MAV kalt und feucht bleibt; wechseln Sie ebenfalls die Hemisphäre, wenn beim Lösen des MAV vom Kortex ein Widerstand spürbar ist.

Schließlich, um die am stärksten dorsalen Bereiche der MAV, die den primären somatosensorischen und motorischen Kortex umgeben, zu entfernen, drehen Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben, um diesen Bereich vom Gehirn zu lösen, und verwenden Sie die Spitzen der Pinzette entlang des Sinus sagittalis. Dieser Teil der gewonnenen MAV kann vorübergehend in eiskalter Kochsalzlösung aufbewahrt werden, bis er für Tests und Analysen benötigt wird, oder zur späteren Verarbeitung eingefroren werden. Häufig bleibt die MAV, die die am stärksten posterior gelegenen Bereiche des Kortex bedeckt, daran angeheftet.

Die Entfernung wird in einem späteren Abschnitt dieses Videos gezeigt. Um den Plexus choroideus zu entfernen, positionieren Sie zunächst das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben und halten Sie es mit der größeren Pinzette fest. Danach führen Sie die kleinere Pinzette entlang der Mittellinie zwischen den Hemisphären nach unten und nutzen deren Spitzen, um durch die Hirnrinde und den Balken in die obere Mittellinie des Hippocampus einzudringen.

Verwenden Sie anschließend die Pinzette, um den Kortex mit dem Balken vom dorsalen Hippocampus und Septum wegzuziehen, wodurch der größte Teil des lateralen Ventrikels freigelegt wird. Das Plexus choroideus kann anhand der wellenförmigen roten Linie identifiziert werden, die die Hauptarterie markiert, welche sich über seine gesamte Länge erstreckt. Benutzen Sie die beiden Enden der Pinzette, um die seitlichen Wände des dritten Ventrikels aufzuleveren und diesen an seinem am weitesten innen liegenden Ende zu erweitern.

Danach mit der kleinen Pinzette dieses Ende des Plexus choroideus lösen. Anschließend die Pinzette verwenden, um den vordersten Bereich zwischen Septum und Regio putamen caudatum zu erweitern, und den Plexus choroideus auch an diesem Ende lösen. Dieselbe Prozedur zudem am kontralateralen Hemisphäre durchführen, um den zweiten verbleibenden Plexus choroideus zu erhalten.

Auch dieses Gewebe kann vorübergehend auf Eis, in kalter, salzhaltiger Lösung oder eingefroren bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt werden. Um den verbleibenden MAV, der die hintersten Kaudalregionen des Kortex bedeckt, zu entfernen, entfernen Sie zunächst den gesamten Hippocampus aus beiden Hemisphären, wodurch der MAV über dem Thalamus und den Colliculi freigelegt wird. Beachten Sie, dass die Entfernung dieses Teils des MAV deutlich einfacher sein wird als die Entfernung des MAV vom Kortex für den verbleibenden MAV.

Indem man die größeren Blutgefäße erfasst, die den vorderen Teil des Thalamus überlagern, und vorsichtig am Coddly zieht, stellt man fest, dass diese Gefäße mit dem suprakokurrikulären Netzwerk verbunden sind und das dorsale Hippocampus- und dorsale Thalamusnetzwerk durchbluten. Ziehen Sie sanft am Coddly, bis das suprakokurrikuläre Netzwerk gelöst ist und die letzten Abschnitte des coddly arteriellen Kreises erreicht werden können. An diesem Punkt ist besondere Sorgfalt erforderlich, um verbleibende MAV von der Oberfläche der granulären retros linealen primären, auditiven und visuellen Kortexareale zu entfernen.

Jegliche verbleibenden posterior-ventralen kortikalen MAV, die mit diesem zweiten thalamischen und callösen MAV-Abschnitt gewonnen wurden, sollten entfernt und dem ersten, separat analysierten kortikalen MAV-Abschnitt hinzugefügt werden. Als Nächstes kann zum Vergleich der Genexpressionsprofile zwischen Striatum, parietalem Kortex und MAV-Regionen unter Kontrollbedingungen eine Genexpressionsanalyse mittels Agilent 0 1 4 8 7 9 Whole Rat Genome, Four by 44.060-mer-Oligonukleotidarrays durchgeführt werden. Weitere Einzelheiten zur Aufarbeitung, zum Scannen und zur anfänglichen Datenspeicherung finden sich bei Thomas et al.

Wenn die Dissektion korrekt durchgeführt wird, sollten die resultierenden MAV-Gewebe aus zwei intakten Einheiten bestehen, die zusammen etwa 35 bis 45 Milligramm wiegen. Die ursprünglich dissezierte MAV, die größtenteils den Kortex umgibt, sollte etwa 25 Milligramm wiegen, und diejenige, die Thalamus, Calli und okzipitalen Kortex bedeckt, sollte etwa 15 Milligramm wiegen.

Das Gewebe sollte aufgrund des verbliebenen Blutes in der Gefäßstruktur leicht rosa gefärbt sein. Der gewonnene bilaterale Plexus choroideus sollte aus zwei intakten Gewebeproben bestehen, wobei jede ein bis zwei Milligramm wiegt, wie hier dargestellt. Hier sehen wir einen Vergleich der Genexpressionsprofile im Striatum, parietalen Kortex und MAV unter Kontrollbedingungen.

Im oberen Diagramm wird die Expression im Striatum im Vergleich zum Parietalkortex gezeigt. Während im unteren Diagramm die Expression im MAV im Vergleich zum Parietalkortex dargestellt wird, ist erkennbar, dass das Striatum und der Parietalkortex untereinander viel enger verwandt sind als das MAV. Hier sehen wir die differentielle Genexpression im MAV als Reaktion auf Hyperthermie im Vergleich zur Kontrolle, als Reaktion auf Amphetamin im Vergleich zur Kontrolle sowie bei Hyperthermie im Vergleich zu Amphetamin.

Schließlich sehen wir hier Gene mit einem mehr als 15-fach höheren Expressionsniveau in der MAV im Vergleich zum Parietalkortex und Striatum, charakterisiert nach Funktion. Viele dieser Gene stehen im Zusammenhang mit dem vaskulären System und/oder dem Immunsystem. Andere Gene mit sehr hohen Faltungsänderungen sind Proteine der extrazellulären Matrix, SLC-Transporter sowie Gene, die an dem Stoffwechsel von Lipiden und Retinsäure beteiligt sind.

Während des Vorgehens ist es wichtig, bei der Dissektion der MAV Geduld zu bewahren. Ebenso wichtig ist es, das Gehirn während der gesamten Dissektion in isotonischer Salzlösung oder phosphatgepufferter Salzlösung untergetaucht zu halten. Außerdem wird empfohlen, den Abschnitt der MAV an vier oder fünf Ratten zu üben, bevor Gewebeproben zur Erzeugung experimenteller Daten gewonnen werden.