Name: Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Lernen Sie die effiziente Ableitung neuronaler Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen durch Small-Molecule-Induktion mit Retinsäure. Diese Methode ermöglicht kontrollierte neuronale Differenzierung für regenerative Anwendungen.

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XHP wurde von National Institute of Health (NIH) Zuschüsse aus National Institute on Aging (NIHK01AG024496) und The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530) unterstützt.

1. Lösungs-und Medien-Vorbereitung <ol><li> Gelatin Beschichtungslösung: 0,1% (w / v) Gelatine in ddH 2 O, autoklaviert und bei 4 ° C. </li><li> Matrigel Beschichtungslösungen. Stammlösung: langsam auftauen Matrigel (10 ml) bei 4 ° C über Nacht, 10 ml eiskaltem DMEM oder DMEM/F12, gut mischen und aliquoten 1 ml / Rohr unter sterilisiert Gewebekultur Kapuze, lagern bei -20 ° C. Working-Lösung: langsam auftauen 1 ml Matrigel Aliquot bei 4 ° C für 1-2 Stunden, Transfer zum 14 ml gekühltes DMEM oder DMEM/F12 und gut mischen unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. </li><li> Menschliche Laminin Beschichtungslösung: Verdünnen Sie 1 ml menschlichen Laminin-Lösung (0,5 mg / ml in Tris Buffered NaCl, Lagerung bei -80 ° C, langsam auftauen bei 4 ° C für 1-2 Stunden) mit eiskaltem DMEM oder DMEM/F12 zu 12,5 ml Arbeitslösung (40 ug / ml) unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. </li><li> Wachstumsfaktor Stammlösungen (500-1000X): Man löst growth factor bei 10 ug/ Ml in sterilisierte Puffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% Glycerin, 1XPBS) und speichern als 50-100 &amp;mgr; l / Röhrchen aliquotiert bei -80 ° C. </li><li> All-trans-Retinsäure Arbeitslösung (1000X): 10 mM in DMSO, speichern in Aliquots bei -80 ° C. </li><li> HESC Medien: DMEM/F12 oder KO-DMEM (80%), KO Serumersatz (20%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MEM nicht essentielle Aminosäuren (MNAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C mit 20 ng / ml bFGF vor der Verwendung ergänzt. Oder ersetzen Sie "knock out (KO) Serum-Ersatz" mit definierten Komponenten: DMEM/F12 oder KO-DMEM (100%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MNAA (1X), MEM wesentliche Aminosäuren (MEAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C, mit bFGF (20 ng / ml), Insulin (20 ug / ml), Ascorbinsäure (50 ug / ergänzt ml), Human Aktivin A (50 ng / ml), Humanalbumin / Albumax (10 mg / ml), und menschliches Transferrin (8 pg / ml) vor der Verwendung. </li><li> NSC Medien: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), Heparin (8 pg / ml). </li></ol> 2. Plattenbeschichtung <ol><li> Coat-Platten mit Gelatine: 2,5 ml / well der Gelatine-Lösung bis 6-Well-Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator. </li><li> Coat-Platten mit Laminin: chill Gelatine beschichteten Platten und entfernen Gelatine, 2,5 ml / well Matrigel oder menschliche Laminin-Beschichtung funktionierende Lösung zu vorgekühlte verkleistert 6-Well-Platten und Inkubation bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 3. Passagieren und Seeding Undifferenzierte hESCs unter definierten Bedingungen <ol><li> Lassen hESC Kolonien wachsen auf 5-7 Tage alt, und nehmen Sie hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. </li><li> Wählen Sie hESC Kolonien aufgeteilt werden. Morphologisch sind diese Kolonien&gt; 75% undifferenzierte hES (kleine kompakte Zellen), in der Regel leicht opake (nicht weißen aufgehäuften Zellen nicht klar differenzierten Zellen) mit definierten Rand un habenderneath dem Binokular. Vorsichtig einen Überblick über die ausgewählten Kolonien und entfernen differenzierten Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie und alle differenzierten Teile (falls vorhanden) der Kolonie mit der Schärfe des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. (Bitte beachten Sie, pluripotenten hES auf eine vorübergehende Phase, eine spontane Differenzierung selbst unter optimalen Bedingungen, obwohl bevorzugt, es schwierig festzustellen, Thesen Zellen sind 100% undifferenzierte unter Binokular,&gt; 75% undifferenziert sind in der Regel als der Pass Punkt betrachtet. Die differenzierten Zellen in der Regel nicht Samen und weiter wachsen, beseitigt in der Passage-Prozess) </li><li> Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende differenzierten Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF. </li><li> Schneiden Sie die undifferenzierte hES-Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare.</li><li> Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und Pool zusammen. </li><li> Saugen Sie das Matrigel oder menschliche Laminin-Lösung von dem beschichteten frischen Platten. Aliquot 4 ml / well hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-Well-Platte. Gently Transfer der Platte Inkubator ohne Schütteln und lassen Kolonie Stücke Samen über Nacht, ohne zu stören in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li></ol> 4. Neuronale Induktion von hESCs unter definierten Kultur-System mit Retinsäure <ol><li> Am Tag 3 nach der Aussaat, die Abschaffung der meisten alten Medien aus jedem Well der Platte und lassen genug Medien zu ermöglichen hESC Kolonien unter Wasser (niemals zulassen hESCs austrocknen) werden. Ersetzen mit 4 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und 10 uM Retinsäure. </li><li> Ersetzen Sie die alten Medien mit frischen hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und10 uM Retinsäure jeden zweiten Tag, und lassen neural-induzierten embryonalen Stammzellen Kolonien wachsen zu Tag 7 oder 8. Alle Zellen innerhalb der Kolonie zu unterziehen Morphologie Änderungen an großen differenzierten Zellen, die auch weiterhin vermehren wird. Die Kolonien werden in der Größe zu erhöhen, um die Platte am Tag 7 oder 8 abdecken, und die Zellen beginnen, häufen sich in einigen Gebieten der Kolonien. </li></ol> 5. Continuing Neuronale Differenzierung in Suspensionskultur <ol><li> Nehmen hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. Vorsichtig einen Überblick über die Kolonien und entfernen Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie (differenzierte Zellen aus der Kolonie eingewandert) mit dem Rand des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende Fibroblasten-Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien (ohne bFGF). </li><li> Schneiden Sie die neural-induced hESC Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien (ohne bFGF) und Pool zusammen. </li><li> Aliquot 4 ml / well serumfreiem hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte und inkubieren bei 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit schwimmende zellulären Clustern (Neuroblasten) für 4-5 Tage zu bilden. </li></ol> 6. Neuronalen Phänotyp Reifung in Adhesive Kultur <ol><li> Pool der Medien mit schwimmenden Neuroblasten zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugation bei 1400 rpm für 5 min. Saugen Sie die alten Medien so viel wie du kannst, und fügen Sie die gleiche Menge frischen NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml). </li><li> Pipette auf und ab zu schweben Neuroblasten und aliquoten 4 ml / well bis 6-Well-Platten mischen. Die Neuroblasten können auch an sich seineded in einem Laminin / Kollagen (Matrigel) oder menschliche Laminin polymerisiert 3-dimensionale Matrix in serum-freien NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml) . Übertragen Sie die Platten auf eine 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit Neuroblasten zu befestigen Nacht. </li><li> Ersetzen NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml) jeden zweiten Tag. Umfangreiche Netzwerke von Neuriten tragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen beginnen, innerhalb von 2 Wochen kontinuierlichen Kultivierung und Erhöhung der Zahl mit der Zeit auftreten, und könnten für über 3 Monate aufrechterhalten werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Retinsäure (RA) dargestellt wird ausreichen, um hESCs in den definierten Kultur-System zum Übergang erhalten von Pluripotenz ausschließlich auf eine neuroektodermalen Phänotyp (Abb. 2A) zu induzieren. Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu RA werden alle Zellen innerhalb des Koloniemorphologie Veränderungen zu unterziehengroßen differenzierten Zellen, die zum Ausdruck Pluripotenz-assoziierter Marker nicht mehr, wie durch Oct-4, und beginnen Ausdruck verschiedener Neuroektoderms-assoziierte Marker wie HNK1, AP2, und TrkC (Abb. 2B). Diese großen differenzierten Zellen wird auch weiterhin zu vermehren und die Kolonien an Größe zunehmen, ausgehend spontan auf den frühen neuronalen Marker β-III-Tubulin (Abb. 2B) auszudrücken. Die reiferen neuronalen Marker MAP-2 beginnen, in den Gebieten der Kolonien, in denen Zellen auf (Abb. 2B) angehäuft haben scheinen. Gleichzeitig mit dem Erscheinen der neuroektodermalen Zellen und neuronalen Differenzierung wird die neuronale spezifische Transkriptionsfaktor Nurr1, in dopaminergen neuronalen Differenzierung und Aktivierung der Tyrosin-Hydroxylase (TH) Gen 16 verwickelt, in den Zellkern (Abb. 2B) zu verlagern. Nach losgelöst, wird der RA-Behandlung hESCs schwimmenden zellulären Clustern (Neuroblasten) in einer Suspension Kult Formure auf die neuronale Differenzierung fortzusetzen. Nach dem Entfernen von bFGF und nach erlaubt die Neuroblasten zu einer Gewebekultur Platte oder in einem Laminin / Kollagen polymerisiert 3-dimensionale Matrix in einem serumfreien Medium definiert, β-III-Tubulin-und Map-2-Expression, Neuriten ausgesät legen -tragenden Zellen und pigmentierten Zellen werden beginnen, mit einer drastischen Steigerung der Effizienz als die spontane multi-lineage Differenzierung von hES ohne Behandlung über den gleichen Zeitraum im Vergleich erscheinen und könnte für mehr als 3 Monate (Abb. 2C) aufrechterhalten werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Eine schematische Darstellung gut kontrollierten effiziente Induktion von menschlichen pluripotenten Stammzellen ausschließlich zu einem bestimmten klinisch relevanten Linie durch eine einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 (A) Schematische Darstellung des Protokolls Zeit Linie gerichtet neuronalen Differenzierung von hES. (B) Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu Retinsäure (RA) unter den definierten Kultur, großer differenzierte Oct-4 (rot)-negativen Zellen innerhalb der Kolonie begann zu entstehen, im Vergleich zu mock-behandelt (DMSO) hESCs als Kontrolle . RA-induzierte differenzierte Oct-4-negativen Zellen begannen sich zu äußern HNK-1 (rot), AP2 (rot), TrkC (grün), und dann β-III-Tubulin (rot), im Einklang mit frühen neuroektodermalen Differenzierung. Diese Zellen weiter zu reifen letztlich Ausdruck der neuronalen Marker Map-2 (grün), in der Regel in Bereichen, in denen Zellen begannen sich zu häufen. Gleichzeitig mit dem Erscheinen der neuroektodermalen Zellen und neuronalen Differenzierung, die neuronale spezifische Transkriptionsfaktor Nurr1 (grün), in Verbindung gebrachtdopaminergen neuronalen Differenzierung und Aktivierung der Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Gen, in den Zellkern transloziert. Alle Zellen sind durch DAPI-Färbung ihrer Kerne (blau dargestellt). (C) RA-Behandlung induziert die Differenzierung in Richtung eines neuronalen Linie mit hoher Effizienz durch umfangreiche Netzwerke von Neuriten-tragenden Zellen, die β-III-Tubulin (rot) und Map-2 (grün, in einem 3-dimensionale Matrix dargestellt) beurteilt. Die Pfeile zeigen die pigmentierten Zellen typisch für jene im ZNS. Alle Zellen sind durch DAPI-Färbung ihrer Kerne (blau) in den Einsätzen gezeigt. Maßstabsbalken: 0,1 mm.

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Die Autoren erklären, konkurrierende Interessen. XHP ist der Gründer der Xcelthera. XHP und EYS haben geistigem Eigentum im Zusammenhang mit hESCs.

Eine der großen Herausforderungen für Entwicklungs-Studie und klinische Umsetzung wurde, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten menschlichen Stammzellen zu einem gewünschten Phänotyp effizient und vorhersagbar Kanal. Obwohl diese Zellen spontan differenzieren können in vitro in Zellen aller Keimblätter, indem Sie durch ein Multi-Linie aggregierte Bühne, verfolgen nur ein kleiner Teil der Zellen einer bestimmten Abstammungslinie 1,4. In diesen hESC-derived Aggregate, das gleichzeitige Auftreten einer erheblichen Menge von sehr unterschiedlichen unerwünschten Zelltypen, die in drei embryonalen Keimblätter aufhalten dürfen oft macht die Entstehung des gewünschten Phänotypen nicht nur ineffizient, sondern unkontrollierbare und unzuverlässig als auch. Obwohl Herz-und neuronalen Linien in früheren Berichten abgeleitet worden, aber nach der Ineffizienz bei der Erzeugung von spezialisierten Zellen durch Keimblattes-Induktion von pluripotenten Zellen und das hohe Risiko der Tumorigenität transplantation haben weitere klinische Übersetzung behindert. Die hESC Linien zunächst abgeleitet wurden und gepflegt in Co-Kultur mit Wachstum verhaftet embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) 4. Obwohl mehrere Menschen Feeder, Feeder-frei, und chemisch formulierter Kultur für hESCs 11-13, die entwickelt wurden, die Elemente notwendig und hinreichend für die Erhaltung der Selbst-Erneuerung der menschlichen pluripotenten Zellen bleiben ungelöst. Diese exogenen Feeder-Zellen und biologischen Reagenzien helfen, die langfristig stabile Wachstum der undifferenzierte hES während Maske die Fähigkeit von pluripotenten Zellen zu Entwicklungsstörungen Signale zu reagieren. Die Aufrechterhaltung undifferenzierten Zellkulturen in einem definierten Biologika-freien Kultur, das treue Expansion und steuerbare Differenzierung erlaubt ist einer der Schlüssel zu ihrem therapeutischen Nutzen und Potential. RA war nicht ausreichend, um die neuronale Differenzierung von undifferenzierten hES unter zuvor berichtet condit gepflegt induzierenIonen mit exogenen Feeder-Zellen. Obwohl neuronale Linien in einem relativ frühen Stadium in hESC Differenzierung erscheinen, Behandlung hESC differenzierte multi-lineage Aggregate (Embryoidkörpern) mit RA nur geringfügig erhöht die geringe Ausbeute von Neuronen 1, 14, 15. Um einheitlich Umwandlung von menschlichen pluripotenten Stammzellen zu einer bestimmten Linie zu erreichen, verwendeten wir eine definierte Kultur System in der Lage für die Versicherung der Proliferation von undifferenzierten hES, die Bedingungen für gut kontrollierte effiziente Induktion von pluripotenten hES ausschließlich zu identifizieren, um eine bestimmte klinisch relevante Linie durch einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen (Abb. 1, Abb. 2).. Zukünftige Studien werden genetische und epigenetische Kontrolle Moleküle in menschlichen ZNS-Entwicklung zeigen, als Alternativen, die den Weg für kleines Molekül-vermittelten direkten Kontrolle und Modulation der hESC pluripotent Schicksal bereiten bei der Ableitung von klinisch relevanten Linien für regenerative Therapien. Ohne RA-Behandlung, 1-5% HESCs wird spontane Differenzierung in Neurone 1, 14, 15 zu unterziehen. Mit RA-Behandlung haben wir in der Lage,&gt; 95% embryonalen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus hES unter define Kultur in einem Prozess, menschliche embryonale Entwicklung 14 emulieren könnte aufrechterhalten zu generieren. Kürzlich haben die bekannten neuronalen Schicksal bestimmen Gene verwendet worden, um Maus-Fibroblasten in adulten neuralen Vorläuferzellen und Neuronen mit einem niedrigen Wirkungsgrad von 0,5-8% 17, 18 transdifferenzieren. Allerdings haben umprogrammiert Körperzellen historisch mit abnormen Genexpression und beschleunigte Seneszenz mit eingeschränkter therapeutischen Nutzen 19-21 in Verbindung gebracht. Schließlich das Protokoll gründeten wir hier zu pluripotenten hES aus der inneren Zellmasse (ICM) oder Epiblast des menschlichen Blastozyste 4 abgeleitet begrenzt, darf nicht auf andere pluripotente Zellen, einschließlich Tier-Ursprung WSR WSR aus früheren Morula gewonnen (acht gelten -cell)-Embryonen 22 und Artificially umprogrammiert Zellen 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356231 </td><td> Growth Faktor reduziert </td></tr><tr><td> Menschliche Laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> all-trans-Retinsäure </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM nicht essentielle Aminosäure-Lösung (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM einminosäuren Lösung (MEAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliches Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Human-Insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche Activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche BDNF </td><td> PeproTech </td><td> AF-450 bis 02 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche VEGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-1 bis 200 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche NT-3 </td><td> PeproTech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td&gt; <td> Sigma </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 Supplement (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente ableitung von humanen neuronalen vorläuferzellen und neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen stammzellen mit small molecule induction

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Es gibt einen großen unerfüllten Bedarf an einer klinisch-geeigneten menschlichen Nervenzellen Quelle für die Reparatur oder Regeneration des geschädigten zentralen Nervensystems (ZNS) Struktur und Schaltungen in der heutigen Healthcare-Industrie. Zell-basierte Therapien vielversprechend, um die verlorenen Nervengewebe und Funktion für ZNS-Störungen wiederherzustellen. Allerdings haben Zelltherapien auf ZNS-derived neuralen Stammzellen Supply Einschränkung und Schwierigkeit, im klinischen Umfeld aufgrund ihrer begrenzten Expansion in Kultur und mangels Plastizität nach umfangreichen Passage 1-3 anzutreffen sind. Trotz einiger positiven Ergebnisse, werden die ZNS-derived menschliche neurale Stammzellen (hNSCs), um ihre therapeutische Wirkung vor allem durch ihre nicht-neuronalen Nachkommen ausüben durch die Herstellung von trophischen und neuroprotektive Moleküle zur Rettung des körpereigenen Zellen 1-3. Alternativ pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen (hES) anbieten Heilmittel für eine Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, die durch supplying die Vielfalt der menschlichen neuronalen Zelltypen im ZNS für die Regeneration 1,4-7. Allerdings hat, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten hES effizient und vorhersagbar Kanal zu einem gewünschten Phänotyp eine große Herausforderung sowohl für Entwicklungs-Studie und klinische Übersetzung worden. Herkömmliche Ansätze beruhen auf multi-lineage Neigung von pluripotenten Zellen durch spontane Keimblatt Differenzierung, was ineffizient und unkontrollierbare Linie-Engagement, das oft durch phänotypische Heterogenität und Instabilität, damit ein hohes Risiko für Tumorigenität 7-10 gefolgt. Darüber hinaus können ausländische undefined / Tier biologische Zusatzstoffe und / oder Anleger, die typischerweise für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von hES verwendet wurden um direkte Verwendung solcher Zellen spezialisiert Transplantaten in Patienten problematisch 11-13. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir die Elemente einer definierten Kultur-System gelöst notwendig und ausreichend für sustaining Epiblast Pluripotenz von hES und dient als Plattform für die de novo Ableitung von klinisch-geeignet hESCs und effektiv leiten wie hESCs gleichmäßig in Richtung klinisch relevanter Linien durch kleine Moleküle 14 (siehe schematischer in Abb. 1).. Retinsäure (RA) nicht induziert neuronale Differenzierung von undifferenzierten hES am Anleger 1, 14 gehalten. Und im Gegensatz zu Maus ES-Zellen, die Behandlung hESC differenzierte Embryoidkörpern (EVG) nur geringfügig erhöht die geringe Ausbeute von Neuronen 1, 14, 15. Doch nach Screening einer Vielzahl von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren, fanden wir, dass solche definierten Bedingungen Retinsäure (RA) ausreichen, um die Spezifikation von Neuroektoderms direkt aus pluripotenten hES, die weiter zu Neuroblasten, dass menschliche neuronale Vorläuferzellen und Neuronen in der generierten fortgeschritten induzieren gemacht ZNS mit hohem Wirkungsgrad (Abb. 2). Wir definierten Bedingungen für die Induktion von neuroBlasten direkt aus pluripotenten hES ohne Zwischenschaltung einer multi-lineage Embryoidkörper Bühne, so dass gut kontrollierte effiziente Ableitung der einen großen Vorrat an menschlichen Nervenzellen im gesamten Spektrum der Entwicklungsstadien für die Zell-basierter Therapeutika.

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Es besteht ein großer, ungedeckter Bedarf an einer klinisch geeigneten menschlichen neuronalen Zellquelle für die Reparatur oder Regeneration des geschädigten zentralen Nervensystems ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, neuronale Nachkommen direkt und ausschließlich aus pluripotenten menschlichen embryonalen Stammzellen mittels Induktion durch kleine Moleküle zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem Retinsäure zu undifferenzierten Zellen hinzugefügt wird, die unter definierten Bedingungen kultiviert werden. Anschließend wird der Differenzierungsprozess fortgesetzt, indem die Zellen abgelöst und in einer Suspensionskultur weitergezüchtet werden, in der sie schwimmende zelluläre Aggregate bilden, die als Neurosphären bezeichnet werden.Wenn Neuroblasten in einem neuronalen Differenzierungsmedium die Möglichkeit haben, sich an eine Zellkulturschale anzulagern, entwickeln sie Merkmale ausgereifter Neuronen. Letztendlich können Immunfluoreszenz und Dekonvolutions- oder konfokale Mikroskopie verwendet werden, um die Wirkung einer Behandlung mit Retinsäure auf die Morphologie und die Markerausprägung behandelter humaner embryonaler Stammzellen darzustellen. Bei anderen Verfahren entwickelt nur ein kleiner Teil der Zellen ein neuronales Phänotyp, während unsere Methode eine gut kontrollierte und effiziente Induktion pluripotenter humaner embryonaler Stammzellen ausschließlich in eine neuronale Linie durch die einfache Zugabe von kleinen Molekülen ermöglicht.Bei der Herstellung von Stammlösungen ist auf einige Schritte besondere Vorsicht geboten. Gehen Sie sorgfältig vor, wenn Matrigel und humanes Laminin langsam von minus 80 Grad Celsius auf vier Grad Celsius über Nacht aufgetaut werden. Lagern Sie das Medium bei vier Grad Celsius und erwärmen Sie es stets vor der Verwendung auf 37 Grad Celsius. Außerdem werden beim Herstellen des humanen ESL-Mediums einige der Zusatzstoffe erst unmittelbar vor Gebrauch zugegeben.Dazu gehören BFGF, Ascorbinsäure, humanes Insulin, das in A aktiv ist, und Transferrin. Danach die Matrigel- oder humanes Laminin-Arbeitslösung unmittelbar vor der Beschichtung der Platten herstellen. Die Platten nach der Herstellung der mit Gelatine vorgeschichteten Zellkulturplatten bei 37 Grad SIU in 5 % Kohlendioxid inkubieren.Die Gelatine kann durch die Matrigel- oder Laminin-Arbeitslösung ersetzt werden. Beschichten Sie diese Platten, indem Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Beginnen Sie damit, humane ES-Zellkolonien fünf bis sieben Tage wachsen zu lassen, und bereiten Sie dann die Teilung vor.Wählen Sie Kolonien aus, die mehr als 75 % undifferenzierte humane ES-Zellen enthalten; diese sind gewöhnlich leicht trüb mit scharf abgegrenzten Rändern und enthalten aufgehäufte Zellen. Ein Hinweis auf den Beginn der Differenzierung ist typischerweise das Auftreten weißer Kolonien; Kolonien, die überwiegend differenzierte Zellen enthalten, erscheinen gewöhnlich klar. Wählen Sie keine weißen oder klaren Kolonien aus.Halten Sie die Platten gegen das Licht und umreißen Sie mit einem Stift die leicht opaken Kolonien auf der Unterseite der Platten entlang der Konturen. Nutzen Sie die Kante einer sterilen P2-Pipettenspitze, um die umgebende Fibroblastenschicht von der humanen ES-Zellkolonie zu lösen. Entfernen Sie anschließend die umgebenden Fibroblastenzellen sowie alle differenzierten Anteile der Kolonie.Aspirieren Sie nun das alte Medium, das die abgelösten differenzierten Zellen enthält. Waschen Sie anschließend in jedem Wells die undifferenzierten Zellen einmal mit humanem EES-Zellmedium ohne BFGF und geben Sie dann drei Milliliter frisches humanes ESL-Medium mit B-F-G-F hinzu, wobei B-F-G-F unmittelbar vor der Anwendung dem frischen Medium zugesetzt wird. Verwenden Sie nun eine sterile P2-Pipettenspitze, um die Kolonien in kleine Stücke zu schneiden und sie von der Platte zu lösen.Ziehen Sie die abgetrennten Koloniestücke zusammen mit ihrem Medium in ein 50-Milliliter-Kegelrohr. Ziehen Sie zusätzlich ein weiteres Milliliter Medium zur Spülung pro Vertiefung auf. Die Zellen sind nun bereit für eine weitere Differenzierung unter Verwendung von kleinen Molekülen. Erwärmen Sie frisch beschichtete Platten zunächst auf 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung von den Platten und geben Sie einen vier Milliliter großen Aliquot Medium, der Koloniestücke enthält, in jede Vertiefung. Überführen Sie die Platten anschließend vorsichtig, ohne sie zu schütteln, in einen Inkubator.Stören Sie die Platten nicht, damit sie ansetzen können. Nach dreitägigem Ansetzen frisches Medium herstellen, das Omicsäure enthält. Danach den größten Teil des alten Mediums entfernen, wobei gerade so viel Medium zurückbleibt, dass die Zellen weiterhin überdeckt sind.Die Zellen dürfen niemals austrocknen. Geben Sie vier Milliliter frisches humanes ES-Zellmedium mit BFGF und Retinsäure hinzu. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag und lassen Sie die mit Retinsäure behandelten humanen ES-Zellkolonien wachsen.Nach sieben oder acht Tagen haben die Zellen morphologische Veränderungen zu großen differenzierten Zellen durchlaufen. Danach fortfahren, indem eine Suspensionkultur angelegt wird. Um eine Suspensionkultur zu erstellen, beginnen Sie damit, ESL-Kolonien von Zellen abzulösen, die spontan differenziert und sich zu einer Fibroblastenschicht ausgebreitet haben. Verwenden Sie dazu die oben genannte Technik mit einer sterilen Pipettenspitze und saugen Sie anschließend das alte Medium ab, das freischwimmende, abgelöste Fibroblastenzellen enthält.Waschen Sie die Zellen einmal mit HESC-Medium und resuspendieren Sie sie in drei Milliliter HESC-Medium. Verwenden Sie nun eine sterile P-2-Pipettenspitze, um die Kolonien in kleine Stücke zu schneiden und sie von der Platte zu lösen.Ziehen Sie das Medium mit den abgelösten Kolonien in ein einzelnes kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Vertiefungen mit einem Milliliter Medium und geben Sie die Abwässerung zum gemeinsamen Pool hinzu. Anschließend portionieren Sie vier Milliliter der gepoolten Zellen in jede Vertiefung einer sechs-Vertiefungs-Platte mit ultra-niedriger Anhaftung und inkubieren Sie vier bis fünf Tage lang; stellen Sie die Platte in einen Inkubator.Während dieser Zeit bilden sich schwimmende zelluläre Aggregate oder Neuroblasten, wodurch die Neuroblasten zu einem reiferen neuronalen Phänotyp weiterentwickelt werden. Überführen Sie das enthaltende Medium in einen 50-Milliliter-Konischgefäß. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 1.400 U/min fünf Minuten lang.Aspirieren, wiegen Sie so viel wie möglich des alten Mediums ab und geben Sie eine gleiche Menge frisches NSC-Medium mit VEGF N NT drei und BDNF hinzu. Bringen Sie die Zellen durch Pipettieren in eine Suspension und portionieren Sie dann vier Milliliter der Suspension pro Vertiefung in eine sechs-Vertiefungs-Zellkulturplatte. Überführen Sie die Platten in einen feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius.Die Neuroblasten heften sich über Nacht an die Kulturschalen für eine 3D-Kultur an Matrigel oder menschliches Laminin in der Neuroblastensuspension an. Und eine 3D-Matrix polymerisiert bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag.Binnen zwei Wochen erscheinen ausgedehnte Netzwerke aus Neuriten tragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen. Retinsäure ist ausreichend, um menschliche ES-Zellen, die in einem definierten Kultursystem gehalten werden, vom pluripotenten Zustand ausschließlich in ein neuroektodermales Phänotyp zu überführen. Nach der Exposition undifferenzierter menschlicher ES-Zellen gegenüber Retinsäure gingen alle Zellen der Kolonie morphologische Veränderungen ein und entwickelten sich zu großen differenzierten Zellen, die die Expression des mit Pluripotenz assoziierten Markers OCT4 einstellten. Die Zellen begannen zudem, verschiedene mit dem Neuroektoderm assoziierte Marker wie HNK-1a, P2 und TRKC zu exprimieren.Diese großen differenzierten Zellen teilten sich weiterhin, und die Kolonien vergrößerten sich spontan unter Expression des frühen neuronalen Markers Beta-tubulin-3. Der differenziertere neuronale Marker Map-2 erschien in Bereichen der Kolonien, in denen sich die Zellen angehäuft hatten. Zeitgleich mit dem Auftreten der neuroektodermalen Zellen translozierte der neuronenspezifische Transkriptionsfaktor NER-1, der an der dopaminergen Differenzierung und der Aktivierung des Tyrosin-Hydroxylase-Gens beteiligt ist, in den Zellkern.Nach der Ablösung bildeten die mit Retinsäure behandelten humanen ES-Zellen in einer Suspensionkultur nach Entfernung von basischem FGF Neuroblasten, und nachdem die Neuroblasten an eine Gewebekulturplatte angeheftet wurden, begannen ausgedehnte Netzwerke aus Neuriten tragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen, typisch für das ZNS, mit einer drastischen Steigerung der Effizienz zu erscheinen und konnten über drei Monate kultiviert werden. Diese aus humanen ES-Zellen abgeleiteten neuronalen Zellen exprimierten Beta-3-Tubulin im Vergleich zur spontanen multiliniearen Differenzierung von Zellen ohne Retinsäurebehandlung und coexprimierten MAP2, sobald beherrscht. Diese Technik kann verwendet werden, um neuronale Vorläuferzellen innerhalb von etwa vier Wochen einheitlich aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen zu erzeugen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann, und Maßnahmen wie die Sicherstellung, dass Zelllinien frei von Krankheitserregern und Mykoplasmen sind, sollten stets getroffen werden, bevor dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Dieses Video zeigt die Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus nicht-transgenen und transgenen humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). hPSCs werden unter Verwendung eines neuronalen Differenzierungsmediums zu neuralen Vorläuferzellen differenziert. Während die Differenzierung in nicht-transgenen Zellen mit kleinen Molekülen induziert wird, werden die transgenen hPSCs durch Zugabe eines Antibiotikums differenziert, das den Promotor für einen neuronalen differenzierungsspezifischen...

Differenzierung von nicht-transgenen und transgenen humanen pluripotenten Stammzellen in neurale Vorläuferzellen

Wir, basierend auf Erkenntnissen aus der Entwicklungsbiologie und veröffentlichten Forschungsergebnissen, haben ein optimiertes Protokoll entwickelt, um effizient A9-Mittelhirn-dopaminerge Neuronen sowohl aus menschlichen embryonalen Stammzellen als auch aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, was für die Krankheitsmodellierung und Zellersatztherapie bei der Parkinson-Krankheit nützlich wäre.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Wir modifizieren und Umsetzung eines bereits veröffentlichten Protokoll beschreibt die schnelle, reproduzierbare und effiziente Differenzierung von humanen 12 pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in exzitatorischen kortikalen Neuronen induziert. Insbesondere ermöglicht unsere Modifikation zur Steuerung neuronaler Zelldichte und der Verwendung auf Mikroelektrodenarrays elektrophysiologischen Eigenschaften auf Netzwerkebene zu messen.

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Die Modellierung der menschlichen Gehirnentwicklung wurde aufgrund der beispiellosen Komplexität des neuronalen Epithelgewebes behindert. In dieser Arbeit wird eine Methode zur robusten Generierung von Hirnorganoiden beschrieben, um frühe Ereignisse der menschlichen Gehirnentwicklung abzugrenzen und Mikrozephalie in vitro zu modellieren.

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Wir zeigen die Automatisierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellkulturen (hiPSC) und neuronalen Differenzierungen, die mit automatisierter Bildgebung und Analyse kompatibel sind.

Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Lernen Sie die effiziente Ableitung neuronaler Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen durch Small-Molecule-Induktion mit Retinsäure. Diese Methode ermöglicht kontrollierte neuronale Differenzierung für regenerative Anwendungen.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction (Video) | JoVE Journal

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

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