Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, neuronale Nachkommen direkt und ausschließlich aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mittels niedermolekularer Induktion zu gewinnen. Dies wird durch die Zugabe von Rettinosäure zu undifferenzierten Zellen erreicht, die unter definierten Bedingungen gehalten werden. Als nächstes wird der Differenzierungsprozess fortgesetzt, indem Zellen in einer Suspensionskultur abgelöst werden, wo sie schwimmende zelluläre Cluster bilden, die als Neuroblasten bezeichnet werden.

Wenn man Neuroblasten erlaubt, sich an eine Gewebekulturplatte in Neurodifferenzierungsmedien zu heften, entwickeln sie Eigenschaften reifer Neuronen. Letztendlich können Immunfluoreszenz und Dekonvolutions- oder Konfokalmikroskopie verwendet werden, um die Wirkung der Behandlung mit Rettinosäure in der Morphologie und Markerexpression von behandelten humanen embryonalen Stammzellen zu zeigen. Bei anderen Techniken verfolgt nur ein kleiner Teil der Zellen einen neuronalen Phänotyp, während unsere Methode eine gut kontrollierte, effiziente Induktion von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen ausschließlich zu einer neuronalen Linie durch einfache Bereitstellung kleiner Moleküle ermöglicht.

Es gibt ein paar Schritte, auf die Sie bei der Reparatur von Stammlösungen achten sollten. Achten Sie darauf, das Auftauen von Matrigel und menschlichem Laminin über Nacht von minus 80 Grad Celsius auf vier Grad Celsius zu verlangsamen, Medien bei vier Grad Celsius zu lagern und die Medien vor der Verwendung immer auf 37 Grad Celsius aufzuwärmen. Auch bei der Zubereitung von ESL-Medien für den Menschen werden einige der Nahrungsergänzungsmittel erst kurz vor der Verwendung hinzugefügt.

Dazu gehören BFGF, Ascorbinsäure, Humaninsulin, das in A aktiv ist und überträgt. Stellen Sie anschließend unmittelbar vor der Plattenbeschichtung das Matra-Gel oder die Arbeitslösungen für humanes Laminin her. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad SIUs in 5% Kohlendioxid Nachdem die Gelatine vorbeschichtete Gewebekulturplatten vorbereitet wurden.

Die Gelatine kann durch das Matrigel oder die Laminin-Arbeitslösung ersetzt werden. Beschichten Sie diese Platten, indem Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Lassen Sie zunächst die menschlichen ES-Zellkolonien fünf bis sieben Tage lang wachsen und bereiten Sie sich dann auf die Teilung vor.

Einige von ihnen Selektieren Sie Kolonien mit mehr als 75%Unter differenzierten humanen ES-Zellen sind sie in der Regel leicht undurchsichtig mit definierten Rändern Kolonien, die aufgetürmte Zellen enthalten. Ein Hinweis auf den Beginn der Differenzierung scheinen in der Regel weiße Kolonien mit überwiegend differenzierten Zellen zu sein. Wählen Sie keine weißen oder klaren Kolonien aus.

Halten Sie die Platten gegen das Licht und umreißen Sie mit einem Marker die leicht undurchsichtigen Kolonien auf der Unterseite der Platten entlang der Umrisse. Verwenden Sie den Rand einer sterilen P-Spitze mit zwei Pipetten, um die umgebende Fibroblastenschicht von der menschlichen ES-Zellkolonie zu lösen. Entfernen Sie dann die umgebenden Fibroblastenzellen und entfernen Sie auch alle differenzierten Teile der Kolonie.

Aspirieren Sie nun das alte Medium, das die abgelösten differenzierten Zellen enthält. Als nächstes waschen Sie in jeder Vertiefung die undifferenzierten Zellen einmal mit humanen E-es-Zellmedien, denen BFGF fehlt, und fügen Sie dann drei Milliliter frisches humanes ESL-Medium hinzu, das B-F-G-F-B-F-G-F enthält, und geben Sie unmittelbar vor der Verwendung zu dem frischen Medium. Schneiden Sie nun mit einer sterilen Pipettenspitze P zwei die Kolonien in kleine Stücke und lösen Sie sie von der Platte.

Ziehen Sie die abgelösten Koloniestücke in ihrem Medium in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Ziehe einen zusätzlichen. Spülen Sie mit Milliliter-Medien pro Vertiefung.

Die Zellen sind nun bereit für die weitere Differenzierung mit kleinen Molekülen. Beginnen Sie damit, frisch beschichtete Teller auf 37 Grad Celsius zu erwärmen. Saugen Sie die Beschichtungslösung aus den Platten ab und geben Sie in jede Vertiefung ein Aliquot von vier Millilitern des Mediums, das Koloniestücke enthält, und überführen Sie die Platten dann vorsichtig in einen Inkubator, ohne sie zu schütteln.

Stören Sie die Platten nicht, damit sie aussäen können. Stellen Sie nach dreitägiger Aussaat neue Medien her, die Omicsäure enthalten. Entfernen Sie dann den größten Teil des alten Mediums, und lassen Sie gerade so viel Medium übrig, dass die Zellen untergetaucht bleiben.

Die Zellen sollten niemals zu jeder einzelnen austrocknen. Nun: Fügen Sie vier Milliliter frisches humanes ES-Zellmedium mit BFGF und Rettinosäure hinzu. Tauschen Sie das Medium alle zwei Tage aus und lassen Sie die mit Rettinosäure behandelten menschlichen ES-Zellkolonien wachsen.

Nach sieben oder acht Tagen haben die Zellen morphologische Veränderungen zu großen differenzierten Zellen durchlaufen. Fahren Sie dann mit der Herstellung einer Suspensionszellkultur fort, um eine Suspensionskultur herzustellen, beginnen Sie mit der Ablösung von ESL-Kolonien von Zellen, die sich spontan differenziert und ausgewandert sind, um eine Fibroblastenschicht zu bilden. Verwenden Sie die oben erwähnte Technik mit einer sterilen Pipettenspitze und aspirieren Sie dann das alte Medium, das schwebende, abgelöste Fibroblastenzellen enthält.

Waschen Sie die Zellen einmal mit HESC-Medien und suspendieren Sie sie wieder in drei Millilitern HESC-Medien. Verwenden Sie nun eine sterile P mit zwei Pipettenspitzen. Die Völker in kleine Stücke schneiden und vom Teller lösen.

Ziehen Sie das Medium mit den abgelösten Kolonien in ein einzelnes konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Vertiefungen mit einem Milliliter Medium aus und geben Sie die Spülung in den Pool. Aliquotieren Sie dann vier Milliliter der gepoolten Zellen vier bis fünf Tage lang in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit extrem niedrigem Attachment und bewahren Sie die Platte in einem Inkubator auf.

Während dieser Zeit bilden sich schwebende zelluläre Cluster oder Neuroblasten, um den Neuroblasten weiter zu einem reiferen neuronalen Phänotyp zu entwickeln. Ziehen Sie das Medium, das sie enthält, in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 1.400 U/min.

Aspirieren, so viel wie möglich von den alten Medien wiegen und eine gleiche Menge frischer NSC-Medien hinzufügen, die VEGF N NT drei und BDNF enthalten. Mischen Sie die Zellen durch Pipettieren in eine Suspension und aliquotieren Sie dann vier Milliliter der Suspension pro Vertiefung in sechs. Well-Gewebekulturplatten überführen die Platten in einen 37 Grad Celsius befeuchteten Inkubator.

Der Neuroblast wird über Nacht an den Kulturplatten befestigt, um eine 3D-Kultur bei Matrigel durchzuführen oder ein humanes Laminat an die Neuroblastensuspension zu legen. Und eine 3D-Matrix polymerisiert bei 37 Grad Celsius. Tauschen Sie die Medien jeden zweiten Tag aus.

Innerhalb von zwei Wochen erscheinen ausgedehnte Netzwerke von neuritentragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen. Rettinosäure wird ausreichend gemacht, um humane ES-Zellen, die in dem definierten Kultursystem gehalten werden, zu einem Übergang von ausschließlich Pluripotenz zu einem neuroepidermalen Phänotyp zu veranlassen. Bei Exposition undifferenzierter humaner E-es-Zellen gegenüber Retinsäure veränderten sich alle Zellen innerhalb der Kolonie morphologisch zu großen differenzierten Zellen, die aufhörten, den Pluripotenz-assoziierten Marker OCT 4 zu exprimieren. Die Zellen begannen auch, verschiedene Neuroektoderm-assoziierte Marker wie HNK eins a, P zwei und TRKC zu exprimieren.

Diese großen differenzierten Zellen vermehrten sich weiter und die Kolonien nahmen spontan an Größe zu und exprimierten den frühen neuronalen Marker Beta-3-Tubulin. Die reifere neuronale Markerkarte zwei begann in Bereichen der Kolonien zu erscheinen, in denen sich Zellen aufgetürmt hatten. Zufälligerweise wurde mit dem Auftreten der neuroektodermalen Zellen der neuronale spezifische Transkriptionsfaktor NER one an der dopaminergen neuronalen Differenzierung und Aktivierung des Tyrosinhydroxylase-Gens beteiligt, das in den Zellkern transloziert.

Nach der Ablösung bildeten die mit Rettinosäure behandelten humanen ES-Zellen in einer Suspensionskultur nach Entfernung von basischem FGF einen Neuroblasten, und nachdem der Neuroblast an eine Gewebekulturplatte gebunden war, begannen ausgedehnte Netzwerke von neuritentragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen, die typisch für das ZNS sind, mit einer drastischen Effizienzsteigerung zu erscheinen und konnten über drei Monate kultiviert werden. Diese von humanen ES-Zellen abgeleiteten neuronalen Zellen exprimierten Beta-3-Tubulin im Vergleich zur spontanen Multi-Lineage-Differenzierung von Zellen ohne Rettinosäure-Behandlungen und co-exprimierten Karte zwei Einmal gemeistert. Diese Technik kann verwendet werden, um neuronale Vorläuferzellen in neuronalen Zellen gleichmäßig aus pluripotenten menschlichen embryonalen Stammzellen in etwa vier Wochen zu erzeugen, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Sicherstellung, dass die Zelllinien frei von Krankheitserregern und Mykoplasmen sind, immer getroffen werden sollten, bevor Sie diesen Eingriff durchführen.