Name: Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten zu transgenfreien induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Sendai-Virus. Diese Methode bietet verbesserte Effizienz und Sicherheit für die regenerative Medizin.

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Wir möchten den Mitgliedern des Lee-Labor für wertvolle Diskussionen zum Manuskript danken. Die Arbeit im Labor Lee wurde durch Zuschüsse von Robertson Investigator Award der New York Stem Cell Foundation und von Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO) unterstützt.

1. Herstellung von Zell und Medien (Tag 1) <ol><li> Kultur und erweitern menschlichen Fibroblasten mit DMEM-Medium mit 10% FBS. </li><li> Teller menschlichen Fibroblasten (Abbildung 1) auf eine 24-Well-Platte auf der entsprechenden Dichte pro Well am Tag vor der Transduktion. HINWEIS: Die folgenden serielle Verdünnungen werden empfohlen (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K und 6.25K), weil verschiedene Zelltypen haben unterschiedliche Befestigungs Fähigkeit. </li><li> Die Zellen für einen Tag Inkubation in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator, wodurch die Zellen vollflächig verklebt und erweitert. </li></ol> 2. Führen Transduction (Tag 2) <ol><li> Am Tag der Transduktion, überprüfen Sie die Zelldichte und wählte die effizientesten Dichte Brunnen (Abbildung 2). Es ist besser, drei verschiedenen Dichten wählen: hoch (80 ~ 90%), Mitte (50 ~ 70%) und niedriger (20 ~ 40%). </li><li> Mindestens 1 Stunde vor Übertragungs absaugen fibroblast Medien aus den Zellen und verändern neue 300 ul von Fibroblasten-Medium. </li><li> Entfernen Sie einen Satz von 4 verschiedenen Sendai-Virus-Rohre von -80 ° C-Lagerung. Auftauen jedes Rohr in der gleichen Zeit in einem 37 ° C Wasserbad für einige Sekunden und dann die Rohre aus dem Wasserbad. Danach auftauen sie auf Raumtemperatur; Zentrifugenröhrchen bei 6000 g für 10 sec und legen sie auf Eis, bis Gebrauch. Wieder einfrieren und auftauen Sie nicht das Virus, da die Titer nicht aufrecht zu erhalten. </li><li> Hinzufügen der angegebenen Mengen von jedem der vier Röhrchen Sendai-Virus (Oct-4, Klf-4, c-Myc und Sox-2) auf den Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung auch durch Pipettieren vorsichtig gemischt. Zum Beispiel, wenn 50K Zellen / ein gut 24-Well-Platte für die Transduktion Lookwell: (Titer auf der Grundlage der Analysezertifikat von Life Technologies, kann von Charge zu Charge sein) Rohr hOct-4 = 6,0 x 10 7 CIU, 3 MOI = 5 ul Rohr hSox-2 = 6,5 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4,6 μ; L Rohr hKlf-4 = 6,3 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4,8 ul U-hc-Myc = 7,8 x 10 7 CIU, 3 MOI = 3,8 ul Total = 18,2 ul von vier Faktoren Virus Mischung / ein gut (50K-Zellen) von 24-Well-Platte </li><li> Je nach Zelldichte; hinzufügen 2X, 1X, 0,5 X und Volumen der Virusgemisch in den Brunnen. Schütteln Sie die Platte von vorne nach hinten, links und rechts (2X: 36,4 ul Virus Mischung, 1X: 18,2 ul 0,5 X und 9,1 ul). </li><li> Platzieren der Zellen in ein 37 º C, 5% CO 2-Inkubator über Nacht inkubieren. </li></ol> 3. Austausch von Kultur-Medium (Tag 3 und Tag 5) <ol><li> 24 Stunden nach der Transduktion, ersetzen Sie das Medium mit 500 ul frisch Fibroblasten-Medium. </li><li> An Tag 5, verändern Medium mit frischen Fibroblasten-Medien. </li></ol> 4. Bereiten MEF Geschirr für die Co-Kultur (Tag 8) <ol><li> Bereiten MEF-Zellen in 60 mm-Kulturschalen mit 10% FBS enthielt DMEM-Medium, da einy vor Passagieren des transduzierten Fibroblasten auf MEF Feeder-Zellen. Hinweis: Wir sind mit 5 x 10 5 von MEF in jedem 60 mm-Schale. </li></ol> 5. Starten Co-Kultur Transduzierte MEF-Zellen mit Feeder-Zellen (Tag 9) <ol><li> Vor der Beschichtung transduzierten Zellen absaugen 10% FBS enthielt DMEM-Medium von MEF Feeder-Gerichte und fügen Sie frisches 10% FBS DMEM-Medium enthalten ist. </li><li> Entfernen des Mediums von den transduzierten Fibroblasten, die in der 24-Well-Platte und wasche die Zellen einmal mit D-PBS. Nach Zugabe von 200 ul 0,25% Trypsin / EDTA in die Fibroblastenzellen inder 24-Well-Platte. Nach weniger als 5 min Inkubation mit Trypsin / EDTA, wenn die Zellen beginnen, von der Platte zu lösen, sammeln Sie die Zellen mit Wachstumsmedium in 15 ml konischen Röhrchen. Dann zentrifugieren in 6000 g für 4 min. HINWEIS: Die Bündelung 2X, 1X und 0,5 X Virus transduzierten Fibroblasten wird empfohlen. </li><li> Entfernen Sie das überstehende Medium und zu waschen, um erneut zu suspendierendas Zellpellet mit 4-5 ml frischem Fibroblasten-Medium für die Neutralisation von Trypsin. Dann zentrifugieren bei 135 × g für 4 min. </li><li> Platte Zellen als serielle Verdünnung Dichte und beginnen zu Kokultur mit Fibroblasten-Medium auf MEF: z. B. 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 und 1/128 pro 60 mm-Schale. Je nach Zellsterberate während der ersten Woche der Transduktion kann man nicht zu auf 1/2 oder 1/128 Dichte zu verdünnen. Beiseite verbleibenden Zellen Gesamt-RNA als Positivkontrolle für Transgene RT-PCR zu extrahieren. </li><li> Platz 60 mm Schalen in 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator über Nacht. </li></ol> 6. Feed-menschlichen embryonalen Stammzellen Medium und Überwachung der Zellen (Tag 10) <ol><li> Am nächsten Tag ändern Fibroblasten-Medien auf menschliche ES-Medien mit 10 uM Y-27632. Danach ändern Medium täglich mit menschlichen ES-Medium: 800 ml + 200 ml DMEM/F12 Knockout Serumersatz + 10 ml L-Glutamin + 10 ml 10 mM MEM Mindest nicht-essentiellen Aminosäuren+ 1 ml 2-Mercaptoethanol + 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor. </li><li> Führen Sie eine tägliche Medienwechsel mit frischen menschlichen ES-Medien. Nach einer Woche, prüfen die Gerichte einmal pro 2 ~ 3 Tage unter einem Mikroskop für die Bildung von ES-Kolonie-wie Zellklumpen. Je nach Zelltyp, wird die Kultur mehr oder weniger Zeit in Anspruch nehmen, bevor Kolonien gefunden. </li></ol> 7. Picking die induzierten pluripotenten Stammzellen Kolonien und erweitern die Zellen (Tag 20 ~) <ol><li> Drei Wochen nach Transduktion, sollte Kolonien richtig für die Kommissionierung gewachsen erscheinen. </li><li> Am Tag vor der Kommissionierung die Kolonien, bereiten MEF Feeder im 24-Well-Platte. HINWEIS: Wir sind mit 12,5 x 10 5 von MEF in einer 24-Well-Platte. </li><li> Am nächsten Tag ändern Medium der MEF Gerichte aus Fibroblasten-Medien auf menschliche ES-Medien mit 10 uM Y-27632. Manuell holen eine Kolonie zu jeder Zeit unter dem Mikroskop in der Kommissionierung-Haube und machen kleinere Klumpen durch Pipettieren und übertragen Sie sieauf neu erstellten MEF dishes.Try mehrere Klone holen. </li><li> Passage und erweitern die jeweils auch von einer 24-Well-Platte mit einer 6-Well-Platte zunächst. Dann aus einer 6-Well-Platte auf eine 60-mm-Schalen, bevor die weitere Vermehrung. </li></ol> 8. Charakterisierung humaner iPS-Zellen (nach 10 Passagen) <ol><li> Immunfluoreszenz <ol><li> Teller menschlichen iPS-Zellen in 24-Well-Platte und Kultur während 4-5 Tage mit täglichen Medienwechsel. </li><li> Zum Starten Immunfluoreszenz-Test, waschen Sie die Platte mit D-PBS einmal. Dann fixieren Sie die Zellen sofort in 0,4% Paraformaldehyd für 30 min. Danach waschen dreimal in D-PBS für 5 min. </li><li> Behandlung von fixierten Zellen mit 0,1% Triton X-100-Lösung in PBS für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Absaugen Permeabilisierung Lösung (0,1% Triton X-100-Lösung), dann mit 0,5% BSA-Blockierungslösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Führen Sie eine Erkennung von Nanog, Oct-4, SSEA (Stufe spezifischen embryonalen Antigde) und TRA-1 bis 81 (Tumorantigen) mit einem Anti-Human-Antikörper in 0,5% BSA-Lösung (überprüfen Sie die Materialtabelle für die Antikörperverdünnungsrate). Inkubieren des primären Antikörpers für 2 h bei Raumtemperatur. Dann waschen dreimal in D-PBS für jeweils 5 min. </li><li> Überprüfen mittels Fluoreszenzmikroskopie nach 1 h Inkubation mit Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus-IgG-Antikörper als 2. Antikörper, der 1:2000 in 0,5% BSA-Lösung bei Raumtemperatur verdünnt. Stain alle Kerne von je MEF Feeder-Zellen und hiPSCs mit DAPI. </li></ol></li><li> RT-PCR von Transgene Bestätigung <ol><li> Auszug Gesamt-mRNA aus Zellpellet durch RNA-Extraktion mit Reagenzien. </li><li> Ein Reverse Transkription von Aliquoten (1 ug) von Gesamt-RNA und die resultierende cDNA für die PCR-Amplifikation durch reverse Transkriptase. </li><li> Die PCR-Gemische zu 2 ul cDNA-Matrize wurden 10 ul 2X PCR-Master-Mix, 2 &amp;mgr; l von 2 pmol Primer enthalten(Vorwärts: 1 ul-und Rückwärts: 1 ul) und 6 ul der DW. Um die Genexpression zu erfassen, führen die RT-PCR mit den in Tabelle 1 angegebenen Primer. </li><li> Führen die RT-PCR mit GAPDH-Gen als Kontrolle für die Effizienz der Amplifikationsreaktionen. Visualisieren und PCR-Produkt analysieren, um 1% Agarose-Gel-Elektrophorese. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Reprogrammierung menschlicher Körperzellen zu hiPSCs hält beispiellosen Versprechungen in Grundlagen der Biologie, persönliche Medizin, Transplantation und 12. Zuvor benötigte menschlichen iPS Generationen DNA-Virus, das Integrationsrisiko in das Wirtsgenom, die unerwünschte genetische Mutationen, die weitere klinische Anwendungen wie Arzneimittelentwicklung und Transplantationstherapien 13 begrenzen erstellen hat. Mit aus diesem Grund haben viele Studien wurde berichtet, Vektor-und gentechnikfreie...

Menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) haben eine Kapazität zur Selbsterneuerung in vitro und haben Pluripotenz, die potenziell nützlich für Krankheit Modellierung sein könnte, für Wirkstoff-Screening, und zellbasierte Therapien zu entwickeln, um Krankheiten und Gewebeverletzungen zu behandeln. Allerdings haben hESCs eine Beschränkung für die Zell-Ersatztherapie wegen der immunologischen, onkologischen und ethischen Schranken, und im Zusammenhang mit Krankheit Gene studieren, konnte krankheitsspezifische hESCs durch Präimplantations-Diagnostik (PID) Ansätze isoliert werden, aber es ist immer noch eine technische Herausforderung und die Embryo-Spenden sind ziemlich selten. Diese Fragen werden an die Fortschritte in der Stammzellbiologie, die zur Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) geführt hat, zusammen. Menschliche iPS sind genetisch aus menschlichen adulten somatischen Zellen umprogrammiert und Hafen pluripotente Stammzelle-ähnliche Funktionen ähnlich hESCs, der sie macht eine nützliche Quelle für die regenerative Medizin wie dTeppich Entdeckung, Krankheit Modellierung und Zelltherapie in Patienten-spezifischen Weise 1,2. Bis jetzt gibt es mehrere Methoden, um menschliche iPS-Zellen zu generieren, einschließlich Virus-vermittelte (Retrovirus und Adenovirus) 3, nicht-Virus-vermittelte (BAC-System und Vektoren Transfektion) 4-Gen Transduktionen und Protein-Liefersystem 7.5. Obwohl eine Lieferung von Virus-vermittelte Gene können ein gewisses Maß an Effizienz zu gewährleisten, konnte virale Vektoren genetischen Fußabdruck zu verlassen, weil sie in Wirts Chromosomen zu integrieren, um eine Anpassung Gene unkontrolliert auszudrücken. Selbst wenn virale Integration Transkriptionsfaktoren aktivieren oder inaktivieren Wirtsgene 8 kann eine unerwartete genetische Aberration und das Risiko von Tumorgenese 5,9 verursachen. Auf der anderen Seite wurden die direkte Einführung von Proteinen oder RNA in somatische Zellen berichtet, haben aber einige Nachteile, wie arbeitsintensiv, wiederholt transfbschnitt, und niedrige Niveau der Umprogrammierung 7,10. Auch episomal und nicht-integrierenden Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und Plasmid-Vektoren sind noch relativ weniger effizient 11. Aus diesen Gründen ist es plausibel, Nicht-Integration Umprogrammierung Verfahren mit hoher Wirksamkeit iPSC Erzeugung und weniger genetische Anomalien zu wählen. In dieser Studie verwenden wir ein Sendai-Virus-basierten Neuprogrammierung. Diese Methode ist bekannt, dass in das Wirtsgenom nicht integrierten und konsequent produziert menschlichen iPS-Zellen ohne Transgen-Integrationen.

<table><tbody><tr><td>CytoTune-iPS Reprogrammierungskit</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6,MEFs, Neomycin-resistent, Mitomycin C behandelt&nbsp;</td><td>Globaler Stiel</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105/6 cm oder 12,5 x 105/24-Well-Platte</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0,25 % Trypsin mit EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte, flacher Boden mit Deckel</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &#956; M (Lagerbestand: 10 mM)</td></tr><tr><td>basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Lagerbestand: 100 μg)</td></tr><tr><td>Knock-out-Serumersatz</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Modifiziertes Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), flüssig (hoher Glukose)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071,03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin-200 mM (100X), flüssig</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Lösung nicht-essentieller Aminosäuren, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 11140050 <td>1/100</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1.000X), flüssig</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Hausser Phasenkontrast-Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Gelatinelösung</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Cell Signaling</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Maus monoklonaler Oct4 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>R& D</td><td>AF1997</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 Anti-Maus für Ziegen</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2.000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung), 1X ohne Kalzium & magnesium</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Transkriptionskit</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Zupfhaube</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>Präparierfernrohr&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente erzeugung menschen induzierten pluripotenten stammzellen aus menschlichen körperzellen mit sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Vor ein paar Jahren, die Einrichtung des menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) in eine neue Ära in der Biomedizin eingeläutet. Mögliche Verwendung von menschlichen iPS-Zellen umfassen Modellierung Pathogenese der menschlichen genetischen Erkrankungen, autologe Zelltherapie nach der Gen-Korrektur und personalisierte Wirkstoff-Screening durch eine Quelle von Patienten-spezifischen und Symptom relevanten Zellen. Allerdings gibt es einige Hürden zu überwinden, wie die Beseitigung der verbleibenden Umprogrammierung Faktor Transgen-Expression nach menschlichen iPS-Zellen-Produktion. Noch wichtiger ist, könnte Rest Transgen-Expression in undifferenzierten menschlichen iPS richtige Differenzierungen behindern und verleiten die Auslegung von krankheitsrelevanten In-vitro-Phänotypen. Mit diesem Grund haben die Integration frei und / oder Transgen-freien menschlichen iPS-Zellen mit verschiedenen Methoden, wie z. B. Adenovirus, der piggyBac System, Minicircle-Vektor, episomaler Vektoren, direkte Lieferung Protein entwickelt und synthetisiert mRNA. Jedoch Effizienz reprogrammierung mit Integration freie Verfahren ist in den meisten Fällen sehr gering. Hier präsentieren wir eine Methode, um menschliche iPS-Zellen unter Verwendung von Sendai-Virus (RNA-Virus) auf der Basis Umprogrammierung System zu isolieren. Diese Umprogrammierung Methode zeigt, konsistente Ergebnisse und eine hohe Effizienz in kostengünstiger Weise.

Normalerweise infizierten Fibroblasten keine morphologischen Veränderungen in mehrere Tage nach Sendai-Virus-Transduktion zu zeigen, aber fünf Tage später, beginnen sie zu verschiedenen Formen (Abbildung 1) zu haben. Wie im rechten Teil der Abbildung 1 beschrieben, funktionieren Zellen nicht typisch Fibroblastenmorphologie mehr. Sie haben eine runde Form und größeren Kern als Zytoplasma. Auch bei Übertragungs wird in 80% zellulären Konfluenz durchgeführt wird, sieht es aus wie sie sind ...

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane induzierte pluripotente Stammzellen mit dem Sendai-Virus zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Fibroblastenzellen für die Transduktion vorbereitet und plattiert werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen mit dem Sendai-Virus zu infizieren.Dann werden die infizierten Fibroblastenzellen auf frische embryonale Fibroblasten-Feederzellen der Maus übertragen. Der letzte Schritt besteht darin, die neu programmierten manuell auszuwählen. Nun können pluripotente Stammzellen, letztlich die Reprogrammierung von Fibroblastenzellen in I PSCs, ohne den Einsatz von Transgenen, durch Immunmarkierung und R-T-P-C-R nachgewiesen werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der bestehenden Methode besteht darin, dass sie die Reprogrammierungseffizienz erhöht, ohne transaktiv zu bleiben, und zwar auf kostengünstige Weise. Für dieses Protokoll haben humane Fibroblasten in DMEM kultiviert. Mit FBS werden diese Zellen auf 24-Well-Platten für die Experimentplatte übertragen, die Zellen in sechs Reihenverdünnungen, um die beste Dichte für die Zellanhaftung zu bestimmen. Jede Reihe der 24-Well-Platte kann eine Verdünnungsserie von Zellen aufnehmen.So können vier Zelltypen auf einer Platte getestet werden, die Verdünnung 24 Stunden lang inkubieren. Am nächsten Tag wählen Sie Vertiefungen auf drei Konfluenzebenen für die Transduktion aus. Eine bei einem hohen Konfluenzniveau von 80 bis 90 %, eine bei etwa 60 % Konfluenz und die dritte bei etwa 30 % Konfluenz eine Stunde oder länger vor der Transduktion.Ersetzen Sie das Medium durch 300 Mikroliter frisches Fibroblastenmedium für das Auftauen der Transduztion. Ein Satz Sendai-Virusröhrchen bei 37 Grad Celsius für ein paar Sekunden, und dann ist es fertig. Tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf.Zentrifugieren Sie die aufgetauten Viren bei 6.000 g für 10 Sekunden und lagern Sie sie auf Eis in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie eine Mischung der Viren her, die nach der Anzahl der zu transduzierenden Zellen berechnet wird. Details zur Berechnung finden Sie im Textprotokoll.Mischen Sie die Viren gut mit vorsichtigem Pipettieren. Fügen Sie nun zu den dichtesten Zellen zwei Volumina Virus hinzu. Fügen Sie den Zellen mittlerer Dichte ein Volumen Virus hinzu und fügen Sie der Selektion mit der geringsten Dichte ein halbes Volumen Virus hinzu.Schwenken Sie die Platte und lassen Sie sie über Nacht inkubieren, damit die Reaktion am nächsten Tag stattfinden kann. Ersetzen Sie das Medium durch 500 Mikroliter frisches Fibroblastenmedium. Wiederholen Sie dies zwei Tage später, drei Tage nach dem zweiten Medienwechsel, der an den transduzierten Zellen vorgenommen wurde.Bereiten Sie Meth-Zellen in 60-Millimeter-Schalen mit DMEM vor, die 10%FBS-Platte enthalten, 500.000 Zellen pro Schale und inkubieren Sie sie über Nacht. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium auf den Methzellen durch frisches Medium und fahren Sie dann mit dem Einrichten der Co-Kultur fort. Entfernen Sie zunächst das Medium von den transduzierten Fibroblasten und waschen Sie sie einmal mit DPBS.Geben Sie anschließend innerhalb von fünf Minuten 200 Mikroliter 0,25 % Trypsin-EDTA in jede transduzierte Vertiefung der Zellen. Fassen Sie alle ablösenden Zellen in einem einzigen konischen 15-Milliliter-Röhrchen zusammen. Schleudern Sie die Zellen vier Minuten lang bei 1.350 g herunter.Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die pelletierten Zellen mit etwa fünf Millilitern frischem Medium, um den Trippin zu neutralisieren. Sammeln Sie nun die Zellen mit einer weiteren vierminütigen Drehung bei 1.350 G.Next Platte. Die meisten Zellen weisen sechs serielle Verdünnungen in Meth auf.Die erste und letzte Verdünnung sind je nach Sterblichkeitsrate der Zellen möglicherweise nicht erforderlich. Bewahren Sie einige der Zellen für eine RNA-Extraktion auf und inkubieren Sie die Platten über Nacht. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch humane ES-Medien, die mit 10 Mikromolaren des RO-Kinase-Inhibitors Y 2 7 6 3 2 ergänzt wurden.Um das Überleben der Zellen in den folgenden Tagen zu verbessern, wechseln Sie das Medium auf normales, mit UNSU supplementiertes humanes ES-Medium. Nach einer Woche Kultivierung sollten Sie alle paar Tage die Schalen auf die Bildung von ES-Kolonie-ähnlichen Zellklumpen überprüfen. Sobald sie erscheinen, überwachen Sie das Wachstum.Drei Wochen nach der Transduktion sollten die Kolonien der ES-Zellklumpen bereit für die Expansion sein. Meth-Feeder-Zellen in 24-Well-Platten vorbereitet, so wie sie für 60-Millimeter-Platten vorbereitet wurden. Bevor Sie Kolonien auswählen, wechseln Sie das Medium auf den Methzellen auf ES-Medien mit 10 Mikrolitern Y 2, 7, 6, 3, 2.Wählen Sie jeweils eine Kolonie aus den Schalen aus. Übertragen Sie die Kolonie in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit der Lösung, wo es sich befindet. Brechen Sie die Kolonie mit der Pipette auf.Dann decke einen von mir ab. Nun mit der zerbrochenen Kolonie. Beladen Sie schließlich jeden Brunnen mit einer aufgebrochenen Kolonie und beladen Sie so viele Brunnen wie möglich.Pflegen Sie die Zellen mit täglichen Medienwechseln und erweitern Sie sie auf Sechs-Well-Platten und dann auf 60-Millimeter-Schalen. Typischerweise zeigen Fibroblasten, die mit dem Sendai-Virus infiziert sind, erst nach fünf Tagen morphologische Veränderungen. Dann nehmen die Zellen eine runde Form mit einem größeren Zellkern und kleinerem Zytoplasma an.Dieses Protokoll im kleinen Maßstab enthält mehrere Parameter, die optimiert werden können, wie z. B. die Fibroblastendichte, den Virustiter und die Plattierungsdichte des mes. Die Transduktion von Zellen mit unterschiedlicher Kofluenz, die in verschiedenen Farben dargestellt werden, kann ebenfalls optimiert werden. Nach einer Woche Co-Kultur mit Meth-Feeder-Zellen haben teilweise reprogrammierte Fibroblasten eine lockere Form und lassen sich leicht aufheben, anstatt mit Trypsin gesammelt zu werden.Vollständig reprogrammiert, sind I PSCs eindeutig von teilweise reprogrammierten Zellen zu unterscheiden. Vollständig reprogrammierte Zellen sind dicht gepackt und Kolonien können klare Grenzen haben. Teilweise umprogrammierte Zellen bilden lose Cluster, die sich leicht ablösen lassen.Nach mehrwöchiger Expansion der IPSC-Klone ist eine Färbung auf Stammzellmarker im Vergleich zu H-Neun-Zellen gerechtfertigt. Die IPCs sind positiv gegenüber mehreren erwarteten Antikörpern, darunter SSEA vier, OCT vier, TRA 81 und Nano G, was ihre pluripotente Qualität unterstützt. Die Transgenexpression unter Verwendung von R-T-P-C-R wurde bei humanen IPSC-Klonen nicht festgestellt.Nach 10 Primern für exogene OCT vier, SOX zwei, klf vier und Cmic wurden positive Kontrollproben verwendet, die starke Transgenexpressionsniveaus zeigten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man somatische Zellen umprogrammiert, um die polypotenten Stammzellen zu induzieren, und wie man diese auswählt und die Zellen aus den anderen Zellen vollständig neu programmiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir zeigen das Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Lentivirus-vermittelte Lieferung der menschlichen Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Pluripotenz von Morphologie und die Anwesenheit von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-spezifische Marker bestätigt.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Ein Verfahren für die menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) über Retrovirus-vermittelte ektopische Expression von Oct4 generieren, wird Sox2, Klf4 und MYC beschrieben. Ein praktischer Weg, um menschliche iPSC Kolonien auf GFP-Expression zu identifizieren Basis wird ebenfalls diskutiert.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung von lentiviral basierten, reprogrammierten und charakterisierten faktorfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und zur Umwandlung in mutmaßliche klinische Bedingungen.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Protokoll für die Reprogrammierung von Melanomtumor-infiltrierenden Lymphozyten in induzierte pluripotente Stammzellen zu zeigen.

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

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Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Erfahren Sie die effiziente Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten zu transgenfreien induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Sendai-Virus. Diese Methode bietet verbesserte Effizienz und Sicherheit für die regenerative Medizin.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

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