Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane induzierte pluripotente Stammzellen mit dem Sendai-Virus zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Fibroblastenzellen für die Transduktion vorbereitet und plattiert werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen mit dem Sendai-Virus zu infizieren.

Dann werden die infizierten Fibroblastenzellen auf frische embryonale Fibroblasten-Feederzellen der Maus übertragen. Der letzte Schritt besteht darin, die neu programmierten manuell auszuwählen. Nun können pluripotente Stammzellen, letztlich die Reprogrammierung von Fibroblastenzellen in I PSCs, ohne den Einsatz von Transgenen, durch Immunmarkierung und R-T-P-C-R nachgewiesen werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der bestehenden Methode besteht darin, dass sie die Reprogrammierungseffizienz erhöht, ohne transaktiv zu bleiben, und zwar auf kostengünstige Weise. Für dieses Protokoll haben humane Fibroblasten in DMEM kultiviert. Mit FBS werden diese Zellen auf 24-Well-Platten für die Experimentplatte übertragen, die Zellen in sechs Reihenverdünnungen, um die beste Dichte für die Zellanhaftung zu bestimmen. Jede Reihe der 24-Well-Platte kann eine Verdünnungsserie von Zellen aufnehmen.

So können vier Zelltypen auf einer Platte getestet werden, die Verdünnung 24 Stunden lang inkubieren. Am nächsten Tag wählen Sie Vertiefungen auf drei Konfluenzebenen für die Transduktion aus. Eine bei einem hohen Konfluenzniveau von 80 bis 90 %, eine bei etwa 60 % Konfluenz und die dritte bei etwa 30 % Konfluenz eine Stunde oder länger vor der Transduktion.

Ersetzen Sie das Medium durch 300 Mikroliter frisches Fibroblastenmedium für das Auftauen der Transduztion. Ein Satz Sendai-Virusröhrchen bei 37 Grad Celsius für ein paar Sekunden, und dann ist es fertig. Tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf.

Zentrifugieren Sie die aufgetauten Viren bei 6.000 g für 10 Sekunden und lagern Sie sie auf Eis in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie eine Mischung der Viren her, die nach der Anzahl der zu transduzierenden Zellen berechnet wird. Details zur Berechnung finden Sie im Textprotokoll.

Mischen Sie die Viren gut mit vorsichtigem Pipettieren. Fügen Sie nun zu den dichtesten Zellen zwei Volumina Virus hinzu. Fügen Sie den Zellen mittlerer Dichte ein Volumen Virus hinzu und fügen Sie der Selektion mit der geringsten Dichte ein halbes Volumen Virus hinzu.

Schwenken Sie die Platte und lassen Sie sie über Nacht inkubieren, damit die Reaktion am nächsten Tag stattfinden kann. Ersetzen Sie das Medium durch 500 Mikroliter frisches Fibroblastenmedium. Wiederholen Sie dies zwei Tage später, drei Tage nach dem zweiten Medienwechsel, der an den transduzierten Zellen vorgenommen wurde.

Bereiten Sie Meth-Zellen in 60-Millimeter-Schalen mit DMEM vor, die 10%FBS-Platte enthalten, 500.000 Zellen pro Schale und inkubieren Sie sie über Nacht. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium auf den Methzellen durch frisches Medium und fahren Sie dann mit dem Einrichten der Co-Kultur fort. Entfernen Sie zunächst das Medium von den transduzierten Fibroblasten und waschen Sie sie einmal mit DPBS.

Geben Sie anschließend innerhalb von fünf Minuten 200 Mikroliter 0,25 % Trypsin-EDTA in jede transduzierte Vertiefung der Zellen. Fassen Sie alle ablösenden Zellen in einem einzigen konischen 15-Milliliter-Röhrchen zusammen. Schleudern Sie die Zellen vier Minuten lang bei 1.350 g herunter.

Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die pelletierten Zellen mit etwa fünf Millilitern frischem Medium, um den Trippin zu neutralisieren. Sammeln Sie nun die Zellen mit einer weiteren vierminütigen Drehung bei 1.350 G.Next Platte. Die meisten Zellen weisen sechs serielle Verdünnungen in Meth auf.

Die erste und letzte Verdünnung sind je nach Sterblichkeitsrate der Zellen möglicherweise nicht erforderlich. Bewahren Sie einige der Zellen für eine RNA-Extraktion auf und inkubieren Sie die Platten über Nacht. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch humane ES-Medien, die mit 10 Mikromolaren des RO-Kinase-Inhibitors Y 2 7 6 3 2 ergänzt wurden.

Um das Überleben der Zellen in den folgenden Tagen zu verbessern, wechseln Sie das Medium auf normales, mit UNSU supplementiertes humanes ES-Medium. Nach einer Woche Kultivierung sollten Sie alle paar Tage die Schalen auf die Bildung von ES-Kolonie-ähnlichen Zellklumpen überprüfen. Sobald sie erscheinen, überwachen Sie das Wachstum.

Drei Wochen nach der Transduktion sollten die Kolonien der ES-Zellklumpen bereit für die Expansion sein. Meth-Feeder-Zellen in 24-Well-Platten vorbereitet, so wie sie für 60-Millimeter-Platten vorbereitet wurden. Bevor Sie Kolonien auswählen, wechseln Sie das Medium auf den Methzellen auf ES-Medien mit 10 Mikrolitern Y 2, 7, 6, 3, 2.

Wählen Sie jeweils eine Kolonie aus den Schalen aus. Übertragen Sie die Kolonie in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit der Lösung, wo es sich befindet. Brechen Sie die Kolonie mit der Pipette auf.

Dann decke einen von mir ab. Nun mit der zerbrochenen Kolonie. Beladen Sie schließlich jeden Brunnen mit einer aufgebrochenen Kolonie und beladen Sie so viele Brunnen wie möglich.

Pflegen Sie die Zellen mit täglichen Medienwechseln und erweitern Sie sie auf Sechs-Well-Platten und dann auf 60-Millimeter-Schalen. Typischerweise zeigen Fibroblasten, die mit dem Sendai-Virus infiziert sind, erst nach fünf Tagen morphologische Veränderungen. Dann nehmen die Zellen eine runde Form mit einem größeren Zellkern und kleinerem Zytoplasma an.

Dieses Protokoll im kleinen Maßstab enthält mehrere Parameter, die optimiert werden können, wie z. B. die Fibroblastendichte, den Virustiter und die Plattierungsdichte des mes. Die Transduktion von Zellen mit unterschiedlicher Kofluenz, die in verschiedenen Farben dargestellt werden, kann ebenfalls optimiert werden. Nach einer Woche Co-Kultur mit Meth-Feeder-Zellen haben teilweise reprogrammierte Fibroblasten eine lockere Form und lassen sich leicht aufheben, anstatt mit Trypsin gesammelt zu werden.

Vollständig reprogrammiert, sind I PSCs eindeutig von teilweise reprogrammierten Zellen zu unterscheiden. Vollständig reprogrammierte Zellen sind dicht gepackt und Kolonien können klare Grenzen haben. Teilweise umprogrammierte Zellen bilden lose Cluster, die sich leicht ablösen lassen.

Nach mehrwöchiger Expansion der IPSC-Klone ist eine Färbung auf Stammzellmarker im Vergleich zu H-Neun-Zellen gerechtfertigt. Die IPCs sind positiv gegenüber mehreren erwarteten Antikörpern, darunter SSEA vier, OCT vier, TRA 81 und Nano G, was ihre pluripotente Qualität unterstützt. Die Transgenexpression unter Verwendung von R-T-P-C-R wurde bei humanen IPSC-Klonen nicht festgestellt.

Nach 10 Primern für exogene OCT vier, SOX zwei, klf vier und Cmic wurden positive Kontrollproben verwendet, die starke Transgenexpressionsniveaus zeigten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man somatische Zellen umprogrammiert, um die polypotenten Stammzellen zu induzieren, und wie man diese auswählt und die Zellen aus den anderen Zellen vollständig neu programmiert.