Chirurgische Verfahren für eine Ratte Modell Teilweise Lebertransplantation mit arteriellen Rekonstruktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine partielle orthotopische Lebertransplantation bei Ratten als reproduzierbares experimentelles Modell für die Transplantationsforschung durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Leber aus der spendenden Ratte entnommen wird. Der zweite Schritt ist die ex vivo-Präparation des Lebertransplantats, einschließlich einer 50 %igen Leberresektion.

Anschließend wird die native Leber der Empfängerratte entfernt. Der letzte Schritt ist die Implantation des teilweisen Lebertransplantats in die Empfängerratte. Abschließend werden die Serumspiegel der Alaninaminotransferase gemessen, um die hepatocelluläre Schädigung des Lebertransplantats nach der Transplantation zu bewerten.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in diesem Verfahren sind, aufgrund der Komplexität, die fortgeschrittene mikrochirurgische Fähigkeiten erfordert, Schwierigkeiten. Um dieses Verfahren zu beginnen, stellen Sie die anästhetisierte Spender-Ratte auf eine Heizplatte, nachdem Sie durch einen Zehenquetschtest bestätigt haben, dass das Tier vollständig anästhesiert ist, und fixieren Sie die Vorderbeine mithilfe des magnetischen Fixators zur Retraktion. Rasieren Sie das Fell aus dem gesamten Bauchbereich der Ratte und desinfizieren Sie die entsprechende Haut mit einer Povidon-Jod-Lösung.

Öffnen Sie den Bauchraum durch eine mediane Inzision mit beidseitigen Erweiterungen. Legen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze unter den Rücken der Ratte, sodass die vena cava suprahepatica mit einer feinen Pinzette ventral angehoben wird; ziehen Sie den Vorgang in Richtung Kopf und setzen Sie die subkostalen Retraktoren ein, um das Operationsfeld freizulegen. Da die Retraktoren und die Fünf-Milliliter-Spritze während des Eingriffs häufig manipuliert werden müssen, werden keine chirurgischen Tücher um die Inzision verwendet. Unter einem Operationsmikroskop mit 16-facher Vergrößerung arbeitet man das falciforme Ligament und das linke dreieckige Ligament wie eine Acht aus, durchtrennt die linke phrenische Vene und hebt die mediale und linke laterale Leberlappen mit einem feuchten Gazetupfer nach oben.

Die paraösophagealen Gefäße zwischen dem linken lateralen und dem vorderen koordinaten Lappen mit bipolaren Pinzetten koagulieren und durchtrennen. Den Darm außerhalb des Abdomens nach links verlagern und mit einem feuchten Mulltupfer abdecken. Mit einem feuchten Mulltupfer abtupfen und den rechten lateralen Lappen mit einem feuchten Mulltupfer nach oben reponieren.

Isolieren Sie die infrahepatische Vena cava aus dem retroperitonealen Gewebe und ligieren Sie die rechte Nebennierenvene, die später unmittelbar vor der Entnahme des Transplantats durchtrennt wird, um einen Stent in den Ductus choledochus einzubringen. Ligieren Sie zunächst den Ductus choledochus auf der Höhe der Abzweigung der Arteria gastroduodenalis. Führen Sie einen kleinen Schnitt in die vordere Wand des Ductus choledochus proximal zum ligierten Punkt ein. Halten Sie dann mit einer geraden Mikrozange in der linken Hand die vordere Wand der Schnittstelle fest und führen Sie mit einer gebogenen Mikrozange in der rechten Hand einen Stent in den Ductus ein. Sichern Sie diesen mit einem Seidenfaden der Stärke 6-0.

Belassen Sie eines der abgeschnittenen Enden des Fadens an der Gallenblase in einer Länge von vier Millimetern, damit der Faden während der späteren Anastomose gehalten werden kann. Freilegen der Pfortader von den Poren- und Milzvenen, indem diese abgebunden und durchtrennt werden; ligieren und durchtrennen Sie die Arteria gastroduodenalis. Isolieren Sie dann die Arteria hepatica communis vom Pankreaskopf bis zu ihrer Wurzel.

Drehen Sie die Leber mit Wattestäbchen nach rechts und dissezieren Sie das Band hinter der Leber und der Speiseröhre zum Abschluss der Vorbereitungen. Zur Leberexzision entfernen Sie die Retraktoren, die Moskito-Forceps am Xiphoidprozess und die Fünf-Milliliter-Spritze unter dem Hinterende der Ratte.

Bringen Sie die Därme in die Bauchhöhle zurück. Injizieren Sie 500 IE Heparin natrium in zwei Milliliter physiologischer Kochsalzlösung durch die Penisvene. Etwa drei Minuten später setzen Sie die Fünf-Milliliter-Spritze, die feine Pinzette und den Retraktor ein, um die Arteria hepatica communis proximal ihrer Wurzel zu ligieren.

Halten Sie eines der abgeschnittenen Enden des Fadens für die A. hepatica communis ligiert. Lange nach dem Abklemmen der vena cava inferior hepatica. In der Nähe der V. renalis dextra mit einer feinen Pinzette verschließen.

Die Vena portae mit einer Einweg-Mikrogefäßklemme unterhalb des Stumpfes der Vena lienalis abklemmen. Die vordere Wand der Vena portae eröffnen und einen 18-Gauge-Katheter in die Vena portae einführen. Die Leber *in situ* mit 60 Milliliter kalter Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Lösung über die Vena portae perfundieren.

Bei einem hydrostatischen Druck von 20 Zentimetern durchtrennte das Wasser sofort das Zwerchfell, die intrathorakale Vena cava und die vordere Wand der infrahepatischen Vena cava, wodurch die Perfusionslösung aus der Leber ausgespült werden konnte. Klemmen Sie die infrahepatische Vena cava mit einer Mikrogefässklemme direkt unterhalb der Leber ab. Entfernen Sie die Leber, indem Sie die infrahepatische Vena cava freilegen und durchtrennen.

Die Pfortader, das Zwerchfell, die verbleibenden Bänder, die rechte Nebennierenvene und die A. hepatica communis. Legen Sie die entnommene Leber in kalte HTK-Lösung in einem Metallbecher, der in einer Kunststoffbox voller zerstoßenen Eiswürfel steht. Die Verfahren am Lebertransplantat werden in dem Metallbecher durchgeführt, der mit eiskalter HTK-Lösung gefüllt ist, um eine Manschette an der Pfortader anzubringen. Klemmen Sie den pfortadervenösen Stamm mit einer DeBakey-Bulldog-Klemme ab und platzieren Sie die Klemme in einer Überbrückungsposition über dem Becher.

Führen Sie die Pfortader durch die Manschette und klemmen Sie die Arteria lienalis erneut zusammen mit der Verlängerung der Manschette in der 12-Uhr-Position. Schlagen Sie die Wand der Pfortader über die Manschette, um den Stumpf der Vena lienalis außerhalb der Manschette in der 7-Uhr-Position zu positionieren, und sichern Sie die Pfortader mit einem Seidenfaden der Stärke 6-0, um einen Stent in die A. hepatica einzubringen. Fixieren Sie die Leber, indem Sie mit einer Pinzette beide Ränder des Zwerchfells klemmen, und ziehen Sie die Arteria hepatica communis gerade, indem Sie den ligierten Faden mit der DeBakey-Clampzange mit geraden Mikroscheren festhalten. Führen Sie mit der linken Hand einen kleinen Schnitt in die vordere Wand der Arteria hepatica communis ein.

Halten Sie die vordere Wand des Schnittes mit einer geraden Mikrozange fest und führen Sie mit der rechten Hand einen Stent in die Arteria hepatica communis ein. Befestigen Sie den Stent mit einer Seidennaht der Stärke sechs Null mithilfe einer gebogenen Mikrozange und lassen Sie eines der abgeschnittenen Enden der Naht mit einer Länge von vier Millimetern stehen. Spülen Sie die Leber über den arteriellen Katheter mit fünf Millilitern kalter HTK-Lösung für die 50 %-Leberresektion aus.

Zunächst klemmen Sie den hinteren Koordinatenlappen mit einer feinen Pinzette, um ihn zu fixieren. Danach ligieren Sie seinen Stiel mit einem 4-0-Seidenfaden und resezieren den Lappen.

Der vordere corate Lappen wird auf die gleiche Weise entfernt. Drehen Sie als Nächstes die Plastikbox um 90 Grad. Klemmen Sie den rechten Rand des Zwerchfells und den linken Teil des mittleren Lappens.

Erstellen Sie einen kleinen Einschnitt am oberen Rand der Grenze der bilateralen Anteile des medialen Lappens und entfernen Sie danach den linken Anteil nach Ligatur. Nach der Ligatur des Pedikels mit einer 4-0-Seidennaht wird der linke laterale Lappen entfernt; die resezierte Leberoberfläche wird sorgfältig mit bipolarer Pinzette koaguliert. Die Lebermasse ist nun um etwa 50 % reduziert, um die Plastik der suprahepatischen Vena cava durchzuführen.

Zunächst fixieren Sie die Position der Leber, indem Sie beide Ränder des Zwerchfells mit einer feinen Pinzette klemmen. Anschließend beschneiden Sie die vordere Wand der suprahepatischen Vena cava, indem Sie das entsprechende Zwerchfell entfernen. Bringen Sie von außen nach innen je eine 7-0-Polypropylonnaht an beiden Ecken als Haltenähte für die spätere Anastomose an.

Anschließend wird die hintere Wand der suprahepatischen Vena cava abgetragen. Der Lebertransplantat wird bei vier Grad Celsius in HTK-Lösung in einem kalten Wasserbad aufbewahrt. Der Empfänger wird auf die Operation in ähnlicher Weise wie beim Spender vorbereitet und der Bauchraum durch einen medianen Schnitt geöffnet.

Legen Sie einen feuchten Tupfer auf die rechte Seite des Duodenums und des gesamten Darmes. Um ein chirurgisches Feld um die unterhalb der Leber gelegene Vena cava zu erhalten, bringen Sie die linke laterale und mediale Leberlappen in die linke Subphrenikhöhle und ziehen Sie den rechten lateralen Leberlappen mit einem feuchten Gaze-Tupfer nach oben.

Isolieren Sie die infrahepatische Vena cava aus dem retroperitonealen Gewebe, ligieren und durchtrennen Sie die rechte Nebennierenvene mit feuchtem Mull und Wattestäbchen. Drehen Sie die Leber nach links und dissezieren Sie das Bandgewebe um die Hinterseite der Leber herum. Durchtrennen Sie den Ductus choledochus direkt unterhalb des Abzweigs vom Chorda-Lobus.

Halten Sie eines der durchtrennten Enden des Fadens für den Gallengang, der vier Millimeter lang ligiert wird; ligieren und durchtrennen Sie die Arteria gastroduodenalis und die Arteria hepatica propria im Abstand von drei Millimetern zur Abzweigung von der Arteria hepatica communis, um eine weite arterielle Struktur am Ende der Arteria hepatica communis zu schaffen. Klemmen Sie die infrahepatische Vena cava mit einer metallischen Mikrogefässklemme direkt oberhalb der rechten Nierenvene und die Vena portae auf Höhe ihrer Aufzweigung im Leberhilus mit einer feinen Pinzette. Klemmen Sie die suprahepatische Vena cava zusammen mit dem Zwerchfell mithilfe einer peripheren Gefäßklemme und befestigen Sie die Klemme in einem Klumpen ölbasiertem Ton. Reduzieren Sie die Anästhesie mit Isofluran auf 0,4 Volumenprozent. Entfernen Sie die native Leber des Empfängers, indem Sie die suprahäpatische Vena cava am Übergang zwischen der suprahepatischen Vena cava und der Leber präparieren.

Die Pfortader knapp oberhalb der Kieferspitze der Moskito-Klemme und die infrahepatische Vena cava leicht unterhalb des Mittelpunkts zwischen Leber und rechter Nierenvene. Platzieren Sie das Lebertransplantat orthotop. Die Rekonstruktion der Gefäße ist der schwierigste und wichtigste Teil dieses Verfahrens.

Es muss sehr sorgfältig, aber schnell erfolgen – für die Anastomose der suprahäpatischen Vena cava mittels kontinuierlicher Naht. Setzen Sie die Haltenaht an der suprahäpatischen Vena cava des Empfängers von innen nach außen mit der beigefügten 7-0-Polypropylennaht an der rechten Ecke des Transplantats und verknoten Sie sie auf die gleiche Weise. Setzen Sie die zweite Haltenaht an der linken Ecke.

Dies wird der Ausgangsstich einer Laufnaht sein. Um die Anastomose zu erweitern, fassen Sie die Nähte an beiden Ecken mit DeBakey-Clamps unter leichter lateraler Zugkraft nach kranial und halten Sie sie fest. Stechen Sie anschließend am linken Eckpunkt von außen nach innen dicht neben dem Knoten außerhalb durch die Wand auf der Graft-Seite und nähen Sie die hintere Nahtreihe der vena cava saphena intraluminal mit sieben bis acht Stichen bis zum rechten Eckpunkt.

Führen Sie die ersten Nähte sorgfältig aus, sodass die inneren Lumina sich an der rechten Ecke gegenüberliegen. Führen Sie das Sieben-Null-Polypropylen von der Gefäßseite der Transplantatseite nach außen durch das Gefäß. Nähen Sie die vordere Reihe von außen von rechts nach links mit etwa 10 Stichen.

Spülen Sie das Innere mit Ringer-Laktat-Lösung aus. Um Luftblasen zu entfernen, setzen Sie den letzten Stich nahe der Haltenaht und verknoten Sie beide anschließend zusammen. Zur Rekonstruktion der Pfortader klemmen Sie die Pfortader mit einer Mikrogefässklemme ab und befestigen die Moskitoklemme in der Tonmasse. Schneiden Sie danach die vordere Wand der Pfortader direkt unterhalb der Backe der Moskitoklemme an.

Spülen Sie das Innere der Empfänger-Pfortader und der Manschette mit Ringer-Laktat-Lösung. Führen Sie die Manschette in die Pfortader ein und befestigen Sie sie mit einem umlaufenden Sechser-Seidensamt-Faden. Schließlich reperfundieren Sie die Leber.

Entfernen Sie die Fünf-Milliliter-Spritze vom Hinterende der Ratte und erhöhen Sie die Konzentration von Isofluran auf 0,8 Volumenprozent zur Rekonstruktion der Leberarterie mittels Stent-Technik. Halten Sie zunächst den Faden der A. hepatica propria mit einer feinen Pinzette fest und fixieren Sie ihn in der Tonmasse. Danach klemmen Sie die gemeinsame Leberarterie des Empfängers ab.

Erstellen Sie einen kleinen Einschnitt an der Gabelung der Y-Struktur am Ende der Arteria hepatica communis, um eine trichterförmige Öffnung zu bilden. Halten Sie den im Transplantat der Arteria hepatica communis platzierten Stent mit einer gebogenen Mikrozange fest. Führen Sie den Stent in die Arteria hepatica communis des Empfängers ein und sichern Sie ihn mit einem Seidenfaden der Stärke 6-0; knoten Sie ein Ende dieses Fadens zusammen mit dem vier Millimeter langen Faden am Transplantat der Arteria hepatica communis, sodass sich beide Arteriae hepaticae communes annähern und die Spannung an der Anastomosestelle verringert wird.

Danach lösen Sie die Klemme für die Anastomose der infrahepatischen Vena cava mittels kontinuierlicher Naht in der gleichen Weise wie bei der suprahepatischen Vena cava, verwenden jedoch mehr Stiche mit feineren Bissen. Nach der Entklemmung erhöhen Sie die Anästhetikakonzentration auf 1,0 Volumenprozent für die Rekonstruktion des Ductus choledochus. Halten Sie den Faden des Empfänger-Gallengangs mit einer feinen Pinzette fest und fixieren Sie ihn in der Wachspfanne.

Führen Sie einen kleinen Schnitt in den Gallengang auf der geeigneten Höhe durch, sodass der rekonstruierte Gallengang nicht zu lang wird. Führen Sie den Stent ein und befestigen Sie ihn mit einem Seidenfaden der Stärke sechs Null. Knoten Sie diesen Faden zusammen mit dem Faden am Transplantatgang.

Nun sind alle Rekonstruktionsverfahren abgeschlossen. Schließen Sie die Bauchdeckeninzision durch fortlaufende Vier-Null-Vicryl-Nähte in Schichten. Unmittelbar nach der Operation behandeln Sie die Empfängerratte mit einer subkutanen Injektion von Sphero-Natrium und Buprenorphin in insgesamt 1,5 Milliliter physiologischer Kochsalzlösung.

Lassen Sie die Ratte 60 Minuten lang in einem speziellen Käfig für die Intensivpflege mit Warmluft und Sauerstoffversorgung regenerieren, bevor sie in einen normalen Käfig zurückgebracht wird. Alle Empfängerratten überlebten bis zur geplanten Euthanasie zur Blutentnahme nach 1, 3, 24 und 168 Stunden nach portaler Reperfusion. Die Serumproben wurden auf Alanin-Aminotransferase-Spiegel analysiert, die das Ausmaß der hepatocellulären Schädigung der Lebertransplantate nach der Transplantation widerspiegeln.

Wie in diesem Transplantat gezeigt, erreichten die LT-Spiegel nach 24 Stunden ein Maximum und gingen danach bis zur 168. Stunde auf normale Werte zurück. Nach diesem Video sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine partielle orthotopische Lebertransplantation an Ratten als reproduzierbares experimentelles Modell für die Transplantationsforschung durchführt.