Name: Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Lernen Sie die Modulation von Genfunktionen in der Kupffer-Vesicle von Danio rerio Embryonen zur Analyse asymmetrischer Flüssigkeitsströmung. Diese Methode nutzt fluoreszierende Mikroperlen und Videomikroskopie.

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Wir danken Fiona Foley für exzellente lab Unterstützung und Zebrafisch Pflege. Diese Arbeit wurde eine AHA Promotionsstipendium GW (11PRE5730027) und NHLBI Zuschüsse HJY (R01HL66292) und JDA (R01HL095690) unterstützt.

Übersicht der Stage-Specific Zebrafisch Embryo Injections Antisense Oligonukleotide Morpholino (MO), die zu einer gezielten mRNA binden und stören Proteinexpression von diesem Transkript, sind weit verbreitet in Knockdown Gen verwendet (Loss-of-function) Studien im Zebrafisch 13,14. Gene Tools, LLC bietet MOs, die entweder mit Carboxyfluorescein (emittiert grüne Fluoreszenz) oder Lissamin (emittiert rote Fluoreszenz) getaggt sind, MO in injizierten Embryonen durch Fluoreszenzmikroskopie zu erkennen. Durch Einspritzen von MO in den Dotter Zelle in verschiedenen Stadien des Zebrafisches Entwicklung ist es möglich, die MO nach bestimmten Kompartimenten des Embryos (1A-F) zu liefern. MO in den Dotter zwischen den Zellstadien 1-4 (0-1 hpf) tritt alle embryonalen Zellen (1A, D, D &#39;) über die Anschlüsse, die mit dem Eigelb, bis das 32-Zellen-Stadium 15 globalen Knockdown erleichtern fortbestehen injiziert. MO injiziert in den Dotter in midblastula Stufen (2.5-3 hpf) können die Vorfahren der DFCs (1B, E, E &#39;) wahrscheinlich durch cytoplasmatische Brücken 8 und knockdown Genfunktion speziell in der DFC / KV Zelllinie 12, ohne Eingabe meisten anderen embryonalen Zelllinien geben . Als wichtige Kontrollfunktion zu testen, ob Genfunktion in DFC / KV oder auch im Eigelb 12,16 erforderlich ist, ist es auch möglich, MO nach dem Eigelb-Zelle zu beschränken durch Einspritzen zwischen den kuppelartigen 30% epiboly Stufen (~ 4,5 hpf) nach alle zytoplasmatische Brücken geschlossen (1C, F, F &#39;). Diese Injektionen wurden in Kombination verwendet werden, um Genfunktion in DFC / KV Zellen 17-24 analysieren. Um den Fluidstrom in KV beurteilen, werden fluoreszierenden Mikrokugeln in das Lumen zwischen den KV 6-10 somite Stufen (12-14 hpf) abgebildet und dann sofort mit Videomikroskopie (Abbildungen 1G-J). Eingespritzt Mikroperlen sind verfügbar, rot oder grün emittieren Fluoreszenz (oder beides), so ist es möglich, unterschiedliche verwendenKanäle Bild fluoreszierenden Mikrokügelchen und MO. Ein. Stage-spezifische Injektion von Morpholinos (MO) Die Injektion von MO in Zebrafisch-Embryonen wurde zuvor 25,26 demonstriert. Hier beschreiben wir kurz stage-spezifische MO-Injektionen. Nach aller Injektionen, werden Embryonen in eine Petrischale überführt und bei 28,5 ° C. <ol><li> Globale MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und laden Sie sie in einer Injektion Platte. Legen fluoreszierende MO in eine Kapillare Nadel und montieren Sie die Nadel auf einer Mikroinjektor (zB Harvard Apparatus PLI-90 Pico-Injektor). Brechen die Nadelspitze und justieren Injektionseinstellungen (Druck und / oder Zeit), um eine Injektion Tropfen, der ein Volumen von 1 nl beschriebenen 25,26 weist erstellen. Verwenden eines Sezieren Stereomikroskop injizieren 1 nl von MO in den Dotter (1A) von ≥ 50 Embryonen pro Versuch. Arbeiten Sie schnell zu Injektionen mit dem 4-Zellen stag abzuschließenE. </li><li> DFC-gezielte MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und bei 28,5 ° C inkubieren Wenn die Embryonen haben die 256-Zell-Stadium (~ 2,5 hpf) erreicht, schnell laden Sie sie in einer Injektion Platte und dann spritzen 1 nl von fluoreszierenden MO in den Dotter von ≥ 100 Embryonen zwischen den 256-Zell-und 1.000-Zell-Stadium (Abbildung 1B). </li><li> Yolk-gezielte MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und inkubieren bei 28,5 ° C. Auf die Kuppel Stufe (~ 4 hpf), laden die Embryonen in eine Einspritzplatte und dann einzuspritzen 1 nl fluoreszierender MO im Eigelb von ≥ 100 Embryonen zwischen der Kuppel und 30% epiboly Stufen (Abbildung 1C). </li></ol> 2. Auswahl injizierten Embryonen für die Analyse <ol><li> Wenn MO Embryonen erreichen die 75%-epiboly Stufe (8 hpf) eingespritzt wird, zu entfernen und tote unbefruchteten Eizellen und dann Bildschirm lebenden Embryonen unter Fluoreszenz Präpariermikroskop zur Verteilung der fluoreszierenden MO. Dann allow gewählt Embryonen bei 28,5 entwickeln ° C. <ol><li> Für globale MO-Injektionen, wählen Embryonen, die Fluoreszenz gleichmäßig in in allen embryonalen Zellen (Abbildung 1D; 2A) verteilt. </li><li> Für gezielte DFC-MO Injektionen, auszuwählen, in denen Embryonen fluoreszierende MO gesamten Dotter diffundiert ist und scheint an der dorsalen Blastoderm Marge (DFCs) (1E; 2B) eingeengt. In dieser Phase kann es schwierig sein, fluoreszierenden DFCs durch helle Fluoreszenz in der darunterliegenden Dotter visualisieren. Achten Sie darauf, Embryonen, in denen das fluoreszierende MO in embryonale Zellen außer DFCs eingebaut wurde oder bleibt aggregiert an der Injektionsstelle (Abbildung 2D) auszuschließen. </li><li> Für yolk-gezielte MO-Injektionen, wählen Embryonen, in denen MO Fluoreszenz gleichmäßig über das Eigelb verteilt wird und nicht in einem embryonalen Zellen (1F, 2C) beobachtet. Wiederum entfernen Embryonen in der die fluoreszierende MO bleibtaggregiert an der Injektionsstelle. </li></ol></li><li> Zwischen den 2-4-somite Stufen (~ 11 hpf), Embryonen Bildschirm ein zweites Mal unter einem Fluoreszenzmikroskop mit stärkerer Vergrößerung. Dann lassen ausgewählten Embryonen bei 28,5 entwickeln ° C. <ol><li> Für globale MO Injektionen, sicherzustellen ausgewählten Embryonen MO Fluoreszenz gleichmäßig in KV und alle embryonalen Zellen (1D &#39;; Abbildung 2E) verteilt. </li><li> Für DFC-gezielte MO Injektionen, sorgfältig auszuwählen Embryonen, MO Fluoreszenz nur in KV-Zellen und das Eigelb (1E) haben. Transgenen Embryos, die Ausdruck GFP in KV Zellen wie Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, bei der Identifizierung von Embryonen in der MO erfolgreich an KV Zellen (2F) geliefert unterstützen kann. Verwerfen von Embryonen mit MO Fluoreszenz in embryonalen Zellen anderen, dass KV-Zellen. </li><li> Für yolk-gezielte MO-Injektionen, wählen Embryonen, die MO-Fluoreszenz haben ausschließlich im Eigelb (1F &#39;: Abbildung2G). </li></ol></li></ol> 3. Montage Embryonen Fluid Flow in KV Analysieren <ol><li> Um asymmetrische Strömung in KV der globalen MO analysieren, MO oder Eigelb-gezielte MO injizierten Embryonen DFC-gezielte, sorgfältig dechorionate ~ 20 Embryonen zwischen 4-6 Somiten Stufen (~ 11-12 hpf) mit scharfen Pinzette. </li><li> Planen 50 ml 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und Aliquot in 5 ml Röhrchen als Flüssigkeit in einem trockenen Bad bei 42 ° C gehalten werden </li><li> Übertragen eines Embryos zu einem Glas Depressionen slide (United Scientific Supplies, Inc.) und entfernen Sie so viel wie möglich am Wasser. Immobilisierung des Embryos, indem genügend warme 1% niedrig schmelzende Agarose gerade bedeckt den Embryo (zu viel Agarose mit anschließender Bildgebung stören). Wie die Agarose erstarrt, verwenden Pinzette, um den Embryo einer solchen Position, dass KV nach oben (dorsal) (Abbildung 1H). Montieren 10 Embryonen mit einem Embryo pro Folie. Arbeiten Sie schnell, um sicherzustellen, dass alle Injektionen in den nächsten Schritt komplETED vom 10 Somiten-Stadium (14 hpf). </li></ol> 4. Die Injektion von Fluorescent Microbeads in KV <ol><li> Verdünnte Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 Mikron Durchmesser Mikrokugeln (Polysciences, Inc.) bis 1:50 in sterilem Wasser in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Mischen Sie die 1:50-Verdünnung von Mikroperlen gründlich durch Antippen des Röhrchens und laden 3 ul in eine Kapillare Nadel. Mit der gleichen Mikroinjektor für MO-Injektionen (zB Harvard Apparatus PLI-90 Pico-Injektor) verwendet, brechen die Nadelspitze mit einer Pinzette und passen Sie die Injektion Einstellungen, um die kleinstmögliche (&lt;0,5 nl) Injektion Tropfen zu erzeugen. </li><li> Unter einem Binokular, richten Sie die Nadel mit der KV Lumen der ersten montiert Embryo. Führen Sie die Nadel in das Lumen und injizieren ein kleines Volumen (&lt;0,5 nl) von Perlen (1G). Eine kleine Nadelspitze und kleinen Injektionsvolumen sind entscheidend, um eine Beschädigung KV vermeiden. </li><li> Inject alle gemounteten Embryonen. Sobald ein Embryo war injected, ein Tropfen von sterilem Wasser kann auf der Oberseite der Agarose gegeben werden, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. Im Verlauf der Injektionen, werden die Kügelchen oft behindern die Nadelöffnung. Das erfordert ein Brechen der Nadelspitze und Einstellen der Einspritzvolumen durch Modulieren des Drucks oder Zeiteinstellung des Mikroinjektionsvorrichtung. Ersetzen Sie die Nadel, wenn es stumpf genug, um erhebliche Schäden während der Injektion verursacht wird. </li><li> Bildschirm die injizierten Embryonen für die erfolgreiche Durchführung der Perlen unter einer aufrechten fluoreszierende Verbindung Mikroskop (zB Zeiss AxioImager M1) mit einem 20x-Objektiv. Erstens, festzustellen, ob KV intakt mit Hellfeldbeleuchtung (Abbildung 1J) ist, und verwenden Sie dann Fluoreszenz, um die Perlen zu beobachten. Wählen Embryonen, in denen Perlen vorhanden sind und sich innerhalb des KV Lumen. Verwerfen von Embryonen mit KV Schäden oder ohne schwimmende Perlen in KV. Es ist leicht zu KV verpassen und liefern Perlen umliegendes Gewebe oder der zugrunde liegenden Eigelb. Wenn erfolglos, mount anoweitere 10 Embryonen und wiederholen Sie die Injektion. </li></ol> 5. Visualisierung und Analyse von KV Strömungstechnik <ol><li> Für jeden ausgewählten Embryos mit Perlen im Inneren KV, einen Tropfen von sterilem Wasser, um die Agarose zu decken und dann beobachten, KV unter dem aufrechten fluoreszierende Verbindung Mikroskop unter Verwendung eines 63X Wasser Eintauchen Ziel (Abbildung 1I). Alternativ kann ein Deckglas für die Verwendung mit Wasser nicht Eintauchen Ziele und / oder inverse Mikroskope aufgebracht werden. </li><li> Verwenden Sie ein High-Speed-Kamera auf dem Mikroskop montiert (z. B. Zeiss AxioCamHSm), um eine 10 sec Film aufzuzeichnen. Notieren Sie sowohl die Perlen mit dem fluoreszierenden Kanal (ca. 70 Bilder / s) und die KV Lumen mit einer Hellfeld-oder Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Kanal. </li><li> Um alle bead Bewegungen im Laufe der Zeit zu visualisieren, importieren Sie den Film von fluoreszierenden Kügelchen in ImageJ-Software (kostenloser Download unter <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) einend eine maximale Projektion aller Fluoreszenzsignale im Film. Um die maximale Projektion in ImageJ durchzuführen, klicken Sie auf &quot;Bild → Stacks → Z-Projekt.&quot; In der &quot;Z-Projekt&quot; Fenster Projekt Scheiben mit Projektionsfläche Art von &quot;Max Intensität&quot;. Dieses Bild kann auf einem Bild des DIC KV in denen die Perlen abgebildet (3A-B) wurden übereinandergelegt werden. </li><li> Die Bewegungen der einzelnen Perlen, können sie mithilfe ImageJ werden. Ein Plugin (&quot;Manual Tracking&quot;) kann heruntergeladen werden unter <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . Öffnen Sie das fluoreszierende Kügelchen Film in ImageJ und führen Sie das manuelle Tracking-Funktion. In dem Fenster der manuellen Tracking, zu überprüfen &quot;show parameters&quot; und Eingabeparameter für &quot;Zeitintervalle&quot; und &quot;x / y-Kalibrierung&quot;. Manuell auswählen Perlen, die in der Brennebene des Films für ≥ 50 Frames bleiben und dann zu verfolgen ≥ 5 Perlen pro Embryo. Der Weg und die Geschwindigkeit eines jeden Wulstes durch th erzeugtene Software (Abbildungen 3 CD). </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit stage-spezifischen Injektionen MO dem DFC / KV Zelllinie Ziel ist ein nützlicher Ansatz zur Zell-Autonomie der Genfunktion zu studieren und zu vermeiden pleiotrope Phänotypen verursacht durch die globale Gen knockdown. Allerdings können diese Injektionen technisch anspruchsvoll. Injektion von MO zwischen den 256-Zelle und 1000-Zellen-Stufen können in drei möglichen Ergebnissen führen: 1) die MO bleibt aggregiert an der Injektionsstelle, 2) die MO diffundiert während des Eigelbs und tritt DFC / KV Zellen oder 3) das ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Standard Control Oligo-Lissamine getaggt </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Benutzerdefinierte Rock2b Morpholino Oligo </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 Mikron Microspheres </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

analyse der genfunktion und visualisierung von cilia-generated fluid flow in kupffer-vesicle

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Inneren Organen wie Herz, Gehirn und Darm entwickeln Links-Rechts-(LR) Asymmetrien, die kritisch für ihre normale Funktion 1 sind. Motile Zilien sind bei der Festlegung LR Asymmetrie in Wirbeltierembryonen, einschließlich Maus, Frosch und Zebrafisch 2-6 beteiligt. Diese &quot;LR Zilien, Generate asymmetrischen Fluidströmung, die erforderlich sind, um eine konservierte asymmetrischen Nodal (TGF-β-Superfamilie) Signalkaskade in der linken Seitenplatte Mesoderm, die vermutlich LR Strukturieren Informationen zum Entwickeln Organen 7 bereitzustellen wird auslösen soll. Somit, um Mechanismen LR Strukturieren zu verstehen, ist es wichtig, Gene, die die Organisation des LR Flimmerzellen, die Motilität und die Länge von LR Zilien und ihrer Fähigkeit, stabile asymmetrische Strömung erzeugen regulieren identifizieren. In der Zebrafisch-Embryos werden LR Flimmerhärchen in Kupffer-Vesikel (KV) 2,4,5 entfernt. KV ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen umfaßt monociliateddass ein mit Flüssigkeit gefüllten Hohlraum umschließen. Schicksal Mapping hat gezeigt, dass KV aus einer Gruppe von ~ 20-30 Zellen als dorsalen Vorläuferzellen (DFCs), die an der dorsalen Rand Blastoderm wandern während epiboly Stufen 8,9 bekannt abgeleitet ist. Während der frühen Somiten Stufen, um DFCs Cluster und differenzieren sich in Flimmerepithelzellen KV in der Schwanzknospe des Embryos 10,11 bilden. Die Fähigkeit, zu identifizieren und zu verfolgen DFCs-in Kombination mit optischen Transparenz und rasche Entwicklung des Zebrafisch-Embryos-make Zebrafisch KV ein hervorragendes Modell System LR Flimmerzellen studieren. Interessanterweise behalten Vorläuferzellen des DFC / KV Zellstammbaums cytoplasmatischen Brücken zwischen dem Eigelb Zelle bis zu 4 Stunden nach der Befruchtung (HPF), während zytoplasmatische Brücken zwischen dem Eigelb Zelle und andere embryonalen Zellen schließen nach 2 hpf 8. Unter Ausnutzung dieser zytoplasmatischen Brücken, entwickelten wir ein Stadium-spezifische Injektion Strategie Morpholino Oligonucleotide liefernotides (MO) ausschließlich DFCs und Knockdown die Funktion eines gerichteten Gens in diesen Zellen 12. Diese Technik schafft chimären Embryos in dem Genfunktion in dem DFC / KV Linie entwickeln im Kontext eines Wildtyp-Embryos wird geklopft. Um asymmetrische Strömung in KV analysieren, injizieren wir fluoreszierenden Mikrokügelchen in den KV Lumen und aufzeichnen bead Bewegung mit Videomikroskopie 2. Fluidströmung einfach visualisiert und können durch die Verfolgung bead Verschiebung im Laufe der Zeit quantifiziert werden. Hier mit dem stufenspezifischen DFC-Zielgens Knockdown Technik und Injektion von fluoreszierenden Mikrokugeln in KV zu fließen visualisieren stellen wir ein Protokoll, das einen effektiven Ansatz, um die Rolle eines bestimmten Gens während KV Entwicklung und Funktion charakterisieren bereitstellt.

Stufenspezifischen MO Injektionen stellen einen nützlichen Ansatz Genfunktion in bestimmten Kompartimenten des Embryos zu analysieren. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Injektion Strategien verwendet werden, um Genfunktion in DFC / KV Zellen und wie zu testen, um fluoreszierende Beads einzuführen, um den Fluidstrom zu visualisieren in KV. Die Verteilung der fluoreszierenden MO in erfolgreichen stufenspezifischen injizierten Embryonen ist schematisch in den 1D-F un...

Cilia-generated Fluidströmung in Kupffer-Vesikel (KV) steuert links-rechts Strukturierung des Zebrafisch-Embryos. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Modulation Genfunktion spezifisch in Zellen KV. Darüber hinaus zeigen wir, wie fluoreszierende Kügelchen in KV liefern Strömung zu visualisieren.

Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktionsgene im Kavas-Vesikel oder im KV im Zebrafischembryo, der für die Links-Rechts-Musterung verantwortlich ist, zu modulieren und die asymmetrische Flüssigkeitsströmung zu analysieren, die durch die Abgabe von fluoreszierenden Kügelchen in das KV erzeugt wird. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszierende Morph-Oligonukleotide injiziert werden, die die Expression eines spezifischen Gens von Interesse in der Dotterzelle eines Embryos im mittleren Blash-Dilla-Stadium unterdrücken, so dass sie in dorsale Vorläuferzellen geladen werden, aus denen das kv entsteht. Als nächstes werden injizierte Embryonen, die fluoreszierende Morphos nur in der Dotterzelle und im kv aufweisen, für die weitere Analyse ausgewählt.Dann werden die Embryonen in Depressionsobjektträger eingesetzt und fluoreszierende Kügelchen in das flüssigkeitsgefüllte Vesikellumen des KV injiziert. Schließlich wird die Videomikroskopie verwendet, um die im Inneren des kv fließenden Kügelchen aufzuzeichnen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die bestimmen, ob die gewebespezifische Depletion eines Kandidatengens in der KV die asymmetrische Flüssigkeitsströmung durch die quantitative Analyse der Bead-Bewegungen verändert.Die Virusdemonstration in diesem Semester ist von entscheidender Bedeutung, da stadienspezifische Molino-Injektionen und Fluoreszenzperlen-Injektionen schwer zu erlernen sind, da beide von der Proposition des Embryos und dem Entwicklungszeitpunkt des Experiments abhängen. Um globale Morph- oder MO-Injektionen durchzuführen, entnehmen Sie die Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und laden Sie sie in eine Injektionsplatte. Verwenden Sie ein Feuer, das an unserer Pipette vorbei poliert wurde, um die Embryonen in die Injektionsplatte zu legen, um die Embryonen zu immobilisieren.Brechen Sie die Spitze einer Injektionsnadel ab und passen Sie die Injektionseinstellungen an, um einen Injektionstropfen mit einem Volumen von einem Nanoliter zu erzeugen. Injizieren Sie mit einem Präpariermikroskop einen Nanoliter MO in das Joch von mindestens 50 Embryonen zwischen dem einen und vier Zellstadien. Bei der DFC-gezielten Mmo-Injektion werden die Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung entnommen und bei 28,5 Grad Celsius inkubiert.Wenn die Embryonen das 256-Zellstadium erreichen, laden Sie sie schnell in eine Injektionsplatte und injizieren Sie einen Nanoliter fluoreszierendes MO in das Eigelb. Injizieren Sie mindestens 100 Embryonen zwischen den Zellstadien 256 und 1000, um eine gezielte Dotterinjektion durchzuführen. Nach der Inkubation befruchteter Eier in das Kuppelstadium injizieren Sie einen Nanoliter fluoreszierendes MO in das Joch von mindestens 100 Embryonen zwischen dem Kuppelstadium und 30 % der Lagenstadien.Wenn M mo injizierte Embryonen 75% pro Lagenstadium erreichen. Entfernen Sie unbefruchtete und tote Embryonen unter einem Präpariermikroskop für globale MO-Injektionen. Wählen Sie lebende Embryonen für die Fluoreszenz, die gleichmäßig über alle Zellen verteilt sind.Für DFC-gezielte Mmo-Injektionen wählen Sie Embryonen mit Fluoreszenz aus, die durch das Eigelb diffundiert und am dorsal gestrahlten Dermrand konzentriert sind. Für Dotter gezielte MO-Injektionen. Wählen Sie Embryonen, bei denen die Fluoreszenz gleichmäßig über das Eigelb verteilt ist und in keiner embryonalen Zelle zwischen zwei und vier beobachtet wird.Also Milbenstadien. Wählen Sie DFC-gezielte Embryonen aus, die nur in den KV-Zellen und im Eigelb Fluoreszenz aufweisen, und verwerfen Sie den Rest für Dotter-gezielte Injektionen. Wählen Sie Embryonen mit Fluoreszenz ausschließlich im Eigelb aus, um den asymmetrischen Fluss in der KV von MO-injizierten Embryonen zu analysieren. Beginnen Sie mit einer scharfen Pinzette, um etwa 20 Embryonen zwischen den vier und sechs vorsichtig zu beschichten.So können die Stadien einen Embryo auf einen gläsernen Vertiefungsobjektträger übertragen und so viel Wasser wie möglich entfernen. Immobilisieren Sie den Embryo, indem Sie genügend warmes Aero mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 1 % hinzufügen, um ihn nur zu bedecken, wenn sich das Aero verfestigt. Verwenden Sie eine Pinzette, um sie so zu positionieren, dass der KV nach oben zeigt, montieren Sie 10 Embryonen und arbeiten Sie schnell, um sicherzustellen, dass alle Injektionen von den 10 abgeschlossen sind.Also Milbenstadium. Nach dem Verdünnen der fluoreszierenden Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,5 Mikrometern auf eins bis 50 in sterilem Wasser. Mischen Sie die Kügelchen gründlich und geben Sie drei Mikroliter in eine Kapillarnadel mit demselben Mikroinjektor, der auch für MO-Injektionen verwendet wird.Brechen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette und passen Sie die Injektionseinstellungen an, um die kleinstmögliche Injektion zu erzeugen. Tropfen. Richten Sie dann unter einem Präpariermikroskop die Nadel auf das KV-Lumen des ersten montierten Embryos aus. Führen Sie dann die Nadel in das Lumen ein und injizieren Sie weniger als 0,5 Nanoliter Kügelchen.Geben Sie einen Tropfen steriles Wasser auf den Aros, um zu verhindern, dass der Embryo unter einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop austrocknet. Unter Verwendung eines 20-fachen Objektivsiebs werden die injizierten Embryonen für eine erfolgreiche Abgabe von Kügelchen für jeden ausgewählten Embryo mit Kügelchen im Inneren des KV bei einem Tropfen sterilem Wasser zur Abdeckung des Aros untersucht. Beobachten Sie dann mit einem fluoreszierenden Verbundmikroskop mit einem 63-fachen Wassertauchobjektiv.Nehmen Sie mit einer am Mikroskop montierten Hochgeschwindigkeitskamera einen zehn Sekunden langen Film auf. Verwenden Sie den Fluoreszenzkanal, um die Kügelchen mit ca. 70 Bildern pro Sekunde aufzunehmen, und entweder Hellfeld- oder differentiellen Interferenzkontrast, um das KV-Lumen aufzuzeichnen. Importieren Sie die Filme in Image J.Erstellen Sie maximale Projektionen und verwenden Sie die Software, um die Bewegungen der einzelnen Perlen zu verfolgen.Diese Abbildung zeigt die Verteilung von fluoreszierendem MO in erfolgreichen phasenspezifischen lebenden Embryonen. Hier ist eine erfolglose MO-Injektion dargestellt, bei der die Lösung in der Dotterzelle aggregiert bleibt. Der Flüssigkeitsfluss in erfolgreich injizierten Embryonen kann qualitativ oder quantitativ in einem Kontrollembryo mit normalen Flusskügelchen gemessen werden.Folgen Sie Pfaden gegen den Uhrzeigersinn, die visualisiert werden können, indem Sie eine maximale Projektion der Positionen der fluoreszierenden Kügelchen im Zeitverlauf vornehmen oder indem Sie einzelne Kügelchen im Zeitverlauf verfolgen. Um den Verlust des koordinierten Flusses zu demonstrieren, wurde den Embryonen MO injiziert, um die Reihenkinase zwei B oder das Gestein zwei B abzubauen, was den Fluss stört, und als Ergebnis bewegen sich die Kügelchen zufällig in kv, die durchschnittliche Geschwindigkeit von fünf Kügelchen von der Kontrolle und dem Stein von zwei B mo-Embryonen ist hier nach ihrer Entwicklung dargestellt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie den Weg, Gene und Mechanismen bei der Etablierung des Zugangs des Links-Rechts-Körpers beim Zebrafisch zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine einfache und zuverlässige Technik für die Visualisierung und Quantifizierung Atemwege Zilien Motilität und Zilien erzeugte Strömung mit der Maus Luftröhre beschrieben. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um zu bestimmen, wie eine Vielzahl von Faktoren Zilien Motilität beeinflussen, einschließlich pharmakologischer Wirkstoffe, genetische Faktoren, Umwelteinflüssen und / oder mechanische Faktoren wie Schleim zu laden.

Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien

In dieser Studie wurde eine detaillierte lichtmikroskopische Technik für die Echtzeitbeobachtung und -analyse der Bewegung von CPEC-Zilien ex vivo zusammen mit einer elektronenmikroskopischen Methode zur Ultrastrukturanalyse optimiert.

Beobachtung der Flimmerbewegung von Plexus Epithelzellen<em&gt; Ex Vivo</em

Hier wird gezeigt, wie Entwicklungsprozesse in C. elegans verfolgt und quantifiziert werden können. Die vorgestellten Methoden basieren auf Open-Source-Tools, die einfach implementiert werden können. Es wird gezeigt, wie man 3D-Zellformmodelle rekonstruiert, wie man subzelluläre Strukturen manuell verfolgt und wie man die kortikale kontraktile Strömung analysiert.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Vor kurzem abgebildet wir die dreidimensionale (3D) räumlichen Positionen der Transportwege für verschiedene Proteine in primäre Zilien in lebenden Zellen translocating. Hier leben diese Papier-Details, die in der Versuchsanordnung, den Prozess der biologischen Proben und der Datenanalyse für die 3D Höchstauflösung Fluoreszenz imaging Ansatz neu angewendet primäre Zilien.

Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Wir präsentieren ein Protokoll zur molekularen Shuttles zu bauen wo treiben Motorproteine Kinesin Oberfläche eingehalten Farbstoff-markierten Mikrotubuli. Schwachen Wechselwirkungen die Kinesine mit der Oberfläche ermöglicht ihre reversible Bindung. Dadurch entsteht ein Nano-System das dynamische Montage und Demontage der Komponenten unter Beibehaltung seiner Funktionalität aufweist.

Montage von molekularen Shuttles Powered by reversibel befestigt Kinesine

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Gewebekomplexitäten multizellulärer Systeme verwirren die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrazellulären Hinweisen und individuellen zellulären Verhaltensweisen. Hier stellen wir eine Methode vor, um den direkten Zusammenhang zwischen kontaktabhängigen Cues und Divisionsachsen mit C. elegans embryo blastomeres und klebenden Polystyrolperlen zu untersuchen.

In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen

Der Einsatz von künstlicher Intelligenz (Ai) zur Analyse von Bildern entwickelt sich im Vergleich zu häufig verwendeten Methoden zu einem leistungsfähigen, weniger voreingenommenen und schnellen Ansatz. Hier trainierten wir Ai, eine zelluläre Organelle, primäre Zilien zu erkennen und Eigenschaften wie Länge und Färbeintensität rigoros und reproduzierbar zu analysieren.

Künstliche Intelligenz Ansätze zur Beurteilung primärer Zilien

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Diese Methode beschreibt die Nutzung des endogenen Signals in einem transgenen ARL13B-CENTRIN-2-Mausmodell, um primäre Zilien in situ dreidimensional über große Bereiche mineralisierten Gewebes abzubilden, von der Gewebeentnahme bis zur Analyse der Zilienorganisation. Dieses Protokoll kann auch auf andere Arten von Geweben angewendet werden.

Volumetrische Bildgebung und Analyse von primären Zilien im Muskel-Skelett-Gewebe mit dem Mausmodell ARL13B-CENTRIN-2

Lernen Sie die Modulation von Genfunktionen in der Kupffer-Vesicle von Danio rerio Embryonen zur Analyse asymmetrischer Flüssigkeitsströmung. Diese Methode nutzt fluoreszierende Mikroperlen und Videomikroskopie.

Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

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