Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktionsgene im Kavas-Vesikel oder im KV im Zebrafischembryo, der für die Links-Rechts-Musterung verantwortlich ist, zu modulieren und die asymmetrische Flüssigkeitsströmung zu analysieren, die durch die Abgabe von fluoreszierenden Kügelchen in das KV erzeugt wird. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszierende Morph-Oligonukleotide injiziert werden, die die Expression eines spezifischen Gens von Interesse in der Dotterzelle eines Embryos im mittleren Blash-Dilla-Stadium unterdrücken, so dass sie in dorsale Vorläuferzellen geladen werden, aus denen das kv entsteht. Als nächstes werden injizierte Embryonen, die fluoreszierende Morphos nur in der Dotterzelle und im kv aufweisen, für die weitere Analyse ausgewählt.

Dann werden die Embryonen in Depressionsobjektträger eingesetzt und fluoreszierende Kügelchen in das flüssigkeitsgefüllte Vesikellumen des KV injiziert. Schließlich wird die Videomikroskopie verwendet, um die im Inneren des kv fließenden Kügelchen aufzuzeichnen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die bestimmen, ob die gewebespezifische Depletion eines Kandidatengens in der KV die asymmetrische Flüssigkeitsströmung durch die quantitative Analyse der Bead-Bewegungen verändert.

Die Virusdemonstration in diesem Semester ist von entscheidender Bedeutung, da stadienspezifische Molino-Injektionen und Fluoreszenzperlen-Injektionen schwer zu erlernen sind, da beide von der Proposition des Embryos und dem Entwicklungszeitpunkt des Experiments abhängen. Um globale Morph- oder MO-Injektionen durchzuführen, entnehmen Sie die Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und laden Sie sie in eine Injektionsplatte. Verwenden Sie ein Feuer, das an unserer Pipette vorbei poliert wurde, um die Embryonen in die Injektionsplatte zu legen, um die Embryonen zu immobilisieren.

Brechen Sie die Spitze einer Injektionsnadel ab und passen Sie die Injektionseinstellungen an, um einen Injektionstropfen mit einem Volumen von einem Nanoliter zu erzeugen. Injizieren Sie mit einem Präpariermikroskop einen Nanoliter MO in das Joch von mindestens 50 Embryonen zwischen dem einen und vier Zellstadien. Bei der DFC-gezielten Mmo-Injektion werden die Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung entnommen und bei 28,5 Grad Celsius inkubiert.

Wenn die Embryonen das 256-Zellstadium erreichen, laden Sie sie schnell in eine Injektionsplatte und injizieren Sie einen Nanoliter fluoreszierendes MO in das Eigelb. Injizieren Sie mindestens 100 Embryonen zwischen den Zellstadien 256 und 1000, um eine gezielte Dotterinjektion durchzuführen. Nach der Inkubation befruchteter Eier in das Kuppelstadium injizieren Sie einen Nanoliter fluoreszierendes MO in das Joch von mindestens 100 Embryonen zwischen dem Kuppelstadium und 30 % der Lagenstadien.

Wenn M mo injizierte Embryonen 75% pro Lagenstadium erreichen. Entfernen Sie unbefruchtete und tote Embryonen unter einem Präpariermikroskop für globale MO-Injektionen. Wählen Sie lebende Embryonen für die Fluoreszenz, die gleichmäßig über alle Zellen verteilt sind.

Für DFC-gezielte Mmo-Injektionen wählen Sie Embryonen mit Fluoreszenz aus, die durch das Eigelb diffundiert und am dorsal gestrahlten Dermrand konzentriert sind. Für Dotter gezielte MO-Injektionen. Wählen Sie Embryonen, bei denen die Fluoreszenz gleichmäßig über das Eigelb verteilt ist und in keiner embryonalen Zelle zwischen zwei und vier beobachtet wird.

Also Milbenstadien. Wählen Sie DFC-gezielte Embryonen aus, die nur in den KV-Zellen und im Eigelb Fluoreszenz aufweisen, und verwerfen Sie den Rest für Dotter-gezielte Injektionen. Wählen Sie Embryonen mit Fluoreszenz ausschließlich im Eigelb aus, um den asymmetrischen Fluss in der KV von MO-injizierten Embryonen zu analysieren. Beginnen Sie mit einer scharfen Pinzette, um etwa 20 Embryonen zwischen den vier und sechs vorsichtig zu beschichten.

So können die Stadien einen Embryo auf einen gläsernen Vertiefungsobjektträger übertragen und so viel Wasser wie möglich entfernen. Immobilisieren Sie den Embryo, indem Sie genügend warmes Aero mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 1 % hinzufügen, um ihn nur zu bedecken, wenn sich das Aero verfestigt. Verwenden Sie eine Pinzette, um sie so zu positionieren, dass der KV nach oben zeigt, montieren Sie 10 Embryonen und arbeiten Sie schnell, um sicherzustellen, dass alle Injektionen von den 10 abgeschlossen sind.

Also Milbenstadium. Nach dem Verdünnen der fluoreszierenden Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,5 Mikrometern auf eins bis 50 in sterilem Wasser. Mischen Sie die Kügelchen gründlich und geben Sie drei Mikroliter in eine Kapillarnadel mit demselben Mikroinjektor, der auch für MO-Injektionen verwendet wird.

Brechen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette und passen Sie die Injektionseinstellungen an, um die kleinstmögliche Injektion zu erzeugen. Tropfen. Richten Sie dann unter einem Präpariermikroskop die Nadel auf das KV-Lumen des ersten montierten Embryos aus. Führen Sie dann die Nadel in das Lumen ein und injizieren Sie weniger als 0,5 Nanoliter Kügelchen.

Geben Sie einen Tropfen steriles Wasser auf den Aros, um zu verhindern, dass der Embryo unter einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop austrocknet. Unter Verwendung eines 20-fachen Objektivsiebs werden die injizierten Embryonen für eine erfolgreiche Abgabe von Kügelchen für jeden ausgewählten Embryo mit Kügelchen im Inneren des KV bei einem Tropfen sterilem Wasser zur Abdeckung des Aros untersucht. Beobachten Sie dann mit einem fluoreszierenden Verbundmikroskop mit einem 63-fachen Wassertauchobjektiv

Nehmen Sie mit einer am Mikroskop montierten Hochgeschwindigkeitskamera einen zehn Sekunden langen Film auf. Verwenden Sie den Fluoreszenzkanal, um die Kügelchen mit ca. 70 Bildern pro Sekunde aufzunehmen, und entweder Hellfeld- oder differentiellen Interferenzkontrast, um das KV-Lumen aufzuzeichnen. Importieren Sie die Filme in Image J.Erstellen Sie maximale Projektionen und verwenden Sie die Software, um die Bewegungen der einzelnen Perlen zu verfolgen.

Diese Abbildung zeigt die Verteilung von fluoreszierendem MO in erfolgreichen phasenspezifischen lebenden Embryonen. Hier ist eine erfolglose MO-Injektion dargestellt, bei der die Lösung in der Dotterzelle aggregiert bleibt. Der Flüssigkeitsfluss in erfolgreich injizierten Embryonen kann qualitativ oder quantitativ in einem Kontrollembryo mit normalen Flusskügelchen gemessen werden.

Folgen Sie Pfaden gegen den Uhrzeigersinn, die visualisiert werden können, indem Sie eine maximale Projektion der Positionen der fluoreszierenden Kügelchen im Zeitverlauf vornehmen oder indem Sie einzelne Kügelchen im Zeitverlauf verfolgen. Um den Verlust des koordinierten Flusses zu demonstrieren, wurde den Embryonen MO injiziert, um die Reihenkinase zwei B oder das Gestein zwei B abzubauen, was den Fluss stört, und als Ergebnis bewegen sich die Kügelchen zufällig in kv, die durchschnittliche Geschwindigkeit von fünf Kügelchen von der Kontrolle und dem Stein von zwei B mo-Embryonen ist hier nach ihrer Entwicklung dargestellt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie den Weg, Gene und Mechanismen bei der Etablierung des Zugangs des Links-Rechts-Körpers beim Zebrafisch zu erforschen.