Beobachtung der Flimmerbewegung von Plexus Epithelzellen Ex Vivo

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Bewegung der Epithelzelle des Aderhautplexus, Celia, ex vivo zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn aus einem Mausembryo oder -welpen herausgeschnitten wird, um das Gewebe des Plexus choroideus zu isolieren. Die Bewegung der Ziliarbewegungen wird durch differentiellen Interferenzkontrast (DIC-Mikroskopie) sichtbar gemacht, und dann wird ein digitaler Film der Ziliarspitzen für die manuelle Verfolgung der Positionen der Ziliarspitzen aufgenommen.

Letztendlich werden die rekonstituierten Spitzenbewegungen der Celia auf der Grundlage der Muster ihrer Bewegungen kategorisiert und quantifiziert. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Zellbiologie zu beantworten, wie z.B. Wie wird die Zölia-Mortalität während der Entwicklung kontrolliert und wie verändert sich das Mobilitätsmuster im Laufe der Zeit? Die Implikation dieser Techniken war die physiologische Analyse und Diagnose des Weges.

Syrien-assoziierte Krankheiten, da unser grundlegendes Verständnis des kinetischen Syriens immer noch Ansporn ist. Beginnen Sie damit, eine mit 70 % Ethanol gespülte Neugeborenenmaus mit dem Kopf in eiskaltem Liebovitz L 15, Medium in eine sterile 10-Zentimeter-Schale unmittelbar nach der Enthauptung zu legen. Verwenden Sie anschließend eine Uhrmacherzange, um die Kopfhaut vom Schädel zu entfernen.

Dann schneiden Sie den Schädel mit einem Medianschnitt entlang der Längsnaht auf, um das Gehirn freizulegen, gefolgt von einem Durchtrennen der Hirnnerven, um das gesamte Organ zu entnehmen. Übertragen Sie das isolierte Gehirn in eine neue, mit frischem Eis und kaltem Medium gefüllte Schale, wobei der dorsale Aspekt nach oben zeigt, und stellen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop. Richten Sie dann das Gewebe so aus, dass die Riechkolben bei drei Uhr positioniert sind, und fassen Sie das Gehirn vorsichtig mit der Uhrmacherzange.

Schneiden Sie mit der anderen Hand mit einer feinen Präparierzange die zerebralen Poons durch, die die Gehirnhälften mit dem Hirnstamm verbinden. Drücken Sie das Dion-Cephalon heraus, um die Hemisphären weiter zu trennen, und platzieren Sie die Schnittfläche nach oben, gefolgt von einem Ziehen an der Lamina afia, um den lateralen ventrikulären Aderhautplexus zu entfernen, der an der lateralen Seite des Hippocampus befestigt ist. Wenn der Plexus choroideus isoliert wurde, übertragen Sie das Gewebe in eine 35-Millimeter-Glasbodenschale mit frischem Medium und positionieren Sie ein Gewicht auf dem Gewebe, um es innerhalb von 25 bis 60 Minuten nach der Euthanasie sanft an Ort und Stelle zu halten. Beginnen Sie mit der Live-Bildgebung der Epithelzelle Celia des Plexus choroideus, indem Sie den Fokus der Objektivlinse mit dem Auge einstellen.

Stellen Sie den Kondensor so ein, dass die Mitte und der Fokus der Kula-Beleuchtung entsprechen. Setzen Sie dann die entsprechenden optischen Elemente in den Strahlengang ein, um der DIC-Optik zu entsprechen. Bewegen Sie das DIC-Prisma, um den Kontrast der Bilder so einzustellen, dass die Oberflächenstruktur des Gewebes deutlich erkannt wird.

Schalten Sie dann den Lichtweg auf die Videokamera um und erhöhen Sie die Lichtleistung. Mit dem Entfernen der Graufilter stellen Sie ein Beobachtungs- und Fokusfeld ein, indem Sie die zeitliche Auflösung der Videokamera auf 200 Hertz und die Belichtungszeit auf 0,1 Millisekunden für die gewünschte Aufnahmedauer einstellen. Erfassen Sie dann die Bilder, nachdem der Bildstapel erhalten wurde, jedes einzelne Bild zeigt ein klares Bild von Celia an, um die Schwebungsmuster jedes Ziliums manuell zu verfolgen.

Markieren Sie mit dem Mauszeiger die Position der Ziliarspitzen in jedem Rahmen. Analysieren Sie dann mit der entsprechenden Software die Trajektoriendaten und klassifizieren Sie die Trajektorien in einen von zwei Bewegungsmodi: Hin- und Herbewegung oder Rotation mit dem Auge. Berechnen Sie anhand der Formel die Ziliarschlaghäufigkeit für mehrere Ziliarschlagzyklen.

Wie andere Celia auf derselben Zelle kann die Bewegung jedes Ziliums stören. Als nächstes wird die Winkelgleichförmigkeit der ziliären Schwebungsachsen innerhalb einer einzelnen Zelle analysiert. Für die Hin- und Her-Trajektorien passen Sie die Positionen der Celia-Spitzen an eine gerade Linie an, wobei Theta als der Winkel definiert wird, den die Linie mit der X-Achse bildet.

Für die Rotationstrajektorien passen Sie die Positionen an eine Ellipse an, wobei Theta als der Winkel definiert ist, den die Hauptachse der Ellipse mit der x-Achse bildet. Um schließlich eine quantitative Beschreibung jeder Trajektorie zu erhalten, drehen Sie die Trajektorien mit Theta, indem Sie ihre Seitenverhältnisse als die Verhältnisse zwischen den Breiten ihrer Verteilung entlang der x- und y-Achse definieren. In diesem ersten Clip wird eine Draufsicht auf die Epithelzellen des Plexus choroideus mit Celia von einem postnatalen Mausjungen, der mit Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie abgebildet wurde, gezeigt: Die unregelmäßige Oberfläche des Gewebes des Plexus choroideus macht es sowohl in der unscharfen als auch in der unscharfen Ebene sichtbar.

In diesem zweiten Clip wird eine vergrößerte Ansicht des Boxed-Bereichs aus dem vorherigen Film gezeigt, die eine genauere Beobachtung der Rotations- und Hin- und Herbewegungen der einzelnen Zilien ermöglicht. Hier werden die Trajektorien repräsentativer Ziliarspitzenbewegungen, die aus Filmaufzeichnungen über mehrere Zyklen rekonstruiert wurden, mit den Zeitverläufen der x- und y-Koordinaten der in den Diagrammen dargestellten Spitzenpositionen dargestellt. Um eine Phasenverschiebung zwischen den beiden Koordinaten in diesen Graphen zu demonstrieren, wurden die x- und y-Koordinaten normiert und überlagert.

Während bewegliche CLIA durch Live-Bildgebung leicht erkannt werden, ist es nicht einfach, die nicht-bewegliche CLIA mit dieser Methode zu identifizieren. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, kann die Rasterelektronenmikroskopie unabdingbar sein, um ganze Bilder der Clia unabhängig von ihrer Beweglichkeit zu erhalten. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Sektion so schnell durchzuführen, dass die Frische der Probe und die Beweglichkeit Syriens erhalten bleiben.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gewebeproben mit viralem Getreide vorbereitet und wie man die Mortalität von CX vivo überwacht und quantifiziert