Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, entweder die Bindung von DNA-Bindungsproteinen wie Transkriptionsfaktoren oder seine Steinmodifikationen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Chromatin in einem zweiten Schritt vorbereitet wird. Eine Chromatin-Immunpräzipitationsreaktion wird aufgebaut, um DNA-Fragmente abzubauen, die an das interessierende Protein gebunden sind.

Als nächstes wird das DNA-Fragment, das an das interessierende Protein gebunden ist, durch PCR amplifiziert. Es werden Ergebnisse erzielt, die eine Faltenanreicherung des DNA-Fragments, das an das interessierende Protein gebunden ist, im Vergleich zu einer ungebundenen Region auf der Grundlage der QPCR-Analyse zeigen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Bereichen Transkription, Chromatin und Epigenetik zu beantworten, z. B. wann und wo verschiedene modifizierte oder unmodifizierte Proteine vorhanden sind.

Auf der DNA Diese Methode kann jedoch Aufschluss über die Genregulation von T-Zellen geben. Es kann auch auf andere Systeme wie B-Lymphozyten, Leukämieproben und immortalisierte Zelllinien angewendet werden. Das Chromatin für dieses Experiment wird aus der Milznaiven CD der Maus mit vier T-Zellen hergestellt.

Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 37 % Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 1 % zur CD vier T-Zell-Suspension in DMEM und schütteln Sie es 15 Minuten lang sanft bei Raumtemperatur. Dadurch werden die DNA-Proteinkomplexe vernetzt. Stoppen Sie die Vernetzung, indem Sie ein molares Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 Millimolar hinzufügen.

Fünf Minuten lang bei Raumtemperatur weiterschaukeln. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern eiskaltem PBS, das Proteasehemmer enthält, zentrifugieren Sie erneut, waschen Sie die Zellen auf diese Weise insgesamt dreimal nach dem letzten Waschen, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter eiskaltem Zelllysepuffer, der Proteasehemmer enthält.

Die Zellsuspension in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und 15 Minuten auf Eis inkubieren. Sammeln Sie die Zellkerne durch Zentrifugation bei 200 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie die Kerne in 500 Mikrolitern Kernlyse.

Puffer mit Proteaseinhibitoren inkubieren 15 Minuten lang auf Eis. Als nächstes beschallen Sie die Zellen mit einer 1,6-Millimeter-Sonde und einem Ausgangspegel von vier 15 Sekunden lang. Kühlen Sie die Probe ein bis zwei Minuten lang auf Eis ab, um eine Überhitzung zu vermeiden, und beschallen Sie sie erneut 15 Sekunden lang.

Wiederholen Sie die Beschallung und Abkühlung für insgesamt viermal Zentrifuge, das Schallchromatin bei 16.000 G für fünf Minuten. Bei vier, vier Grad Celsius. Sammeln Sie den klaren Überstand in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen.

Ein Aliquot von 20 Mikrolitern klarem Überstand wird entfernt. Fügen Sie DNA-Ladefarbstoff hinzu und überprüfen Sie die beschallte DNA durch Elektrophorese durch ein 2%-Agro-Gel. Die ideale Größe der beschallten DNA für die meisten Anwendungen beträgt 200 bis 500 Basenpaare.

Bestimmen Sie abschließend die DNA-Konzentration mit einem UV-Spektralphotometer. Geschertes Chromatin kann sofort verwendet werden, um eine Chromatin-Immunpräzipitationsreaktion einzurichten, oder bei minus 80 Grad Celsius für die Chromatin-Immunpräzipitation gelagert werden oder chipverdünntes beschalltes Chromatin auf eine DNA-Konzentration von fünf bis 10 Mikrogramm pro Milliliter in einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern in Chip-Verdünnungspuffer mit Proteaseinhibitoren lagern. Alle Schritte dieses Verfahrens müssen bei null bis vier Grad Celsius durchgeführt werden.

Sparen Sie 10 %, was in diesem Beispiel 200 Mikroliter des verdünnten beschallten Chromatins entspricht, speichern Sie die verbleibende Probe auf Eis, aliquotieren Sie 450 Mikroliter in jedes von vier 1,7-Milliliter-Microview-Röhrchen, die als Isotypkontrolle und Antikörper von Interesse gekennzeichnet sind. Wenn mehrere Antikörper desselben Isotyps verwendet werden, ist eine einzige Isotypkontrolle ausreichend. Um diese Analyse durchzuführen, geben Sie je nach Spezifität des verwendeten Antikörpers oder der Isotypkontrolle zwei bis fünf Mikrogramm des spezifischen Antikörpers in die jeweiligen Röhrchen. Schütteln Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius, um am nächsten Morgen die Bildung von Chromatin-Antikörper-Komplexen zu ermöglichen.

Fügen Sie jeder Mischung 25 Mikroliter Protein-G-Magnetkügelchen hinzu und rocken Sie mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Legen Sie dann die Fugerohre für 15 bis 20 Sekunden auf einen Magnetständer, damit sich die Kügelchen auf der magnetisierten Seite sammeln können. Entfernen Sie die Lösung vorsichtig durch Aspiration, ohne die Kügelchen zu stören.

Fügen Sie einen Milliliter salzarme Waschlösung hinzu und schütteln Sie den Mutator fünf Minuten lang vorsichtig. Sammeln Sie die Kügelchen mit dem Magnetständer und entfernen Sie die Waschlösung. Fügen Sie erneut einen Milliliter salzarme Waschlösung hinzu und schütteln Sie sie fünf Minuten lang leicht.

Nachdem Sie die salzarme Waschlösung entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter Waschlösung mit hohem Salzgehalt hinzu und rocken Sie fünf Minuten lang. Sammeln Sie die Kügelchen mit dem Magnetständer und entfernen Sie die Waschlösung. Wiederholen Sie die Wäsche mit der Waschlösung mit hohem Salzgehalt.

Sobald Sie die Waschlösung mit hohem Salzgehalt entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter Lithiumchlorid-Waschlösung hinzu und rocken Sie fünf Minuten lang. Sammeln Sie die Kügelchen mit dem Magnetständer und entfernen Sie die Waschlösung. Wiederholen Sie die Lithiumchlorid-Wäsche einmal.

Fügen Sie einen Milliliter TE-Lösung hinzu und rocken Sie fünf Minuten lang. Sammeln Sie die Kügelchen mit dem Magnetständer und entfernen Sie die Waschlösung. Eluieren Sie die DNA aus den Kügelchen, indem Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur 250 Mikroliter elucianisches Puffergestein hinzufügen.

Pipettieren Sie das EIT ab und bewahren Sie dieses Material in einem neuen 1,7-Millimeter-Fuge-Rohr auf. Wiederholen Sie dies noch einmal und kombinieren Sie beide Elu, entsorgen Sie die Perlen, um die Querverbindungen umzukehren. Fügen Sie der entgangenen DNA fünf molare Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,3 molaren und einem Mikroliter RNA hinzu.

Fügen Sie den zuvor gespeicherten Eingaben 400 Mikroliter Elutionspuffer hinzu. Um das Volumen auf 500 Mikroliter pro Eingabe zu erhöhen, fügen Sie Natriumchlorid zu 0,3 molaren RNAs, 10 Mikroliter 0,5 molare EDTA, 20 Mikroliter eines molaren Tris, HCL pH 6,5 und einen Mikroliter Proteinase K hinzu. Verschließen Sie die Röhrchen und inkubieren Sie sie über Nacht bei 65 Grad Celsius in einem trockenen Heizblock am nächsten Morgen. Lassen Sie die Röhren auf Raumtemperatur abkühlen. Fügen Sie dann einen Milliliter 100%iges Ethanol hinzu und inkubieren Sie es zwei Stunden lang bis über Nacht bei minus 80 Grad Celsius.

Zur Ausfällung der DNA-Zentrifuge werden die Röhrchen bei 16.000 g für 15 Minuten gefüttert. Um die DNA-Wäsche zu pelletieren, wird das DNA-Pellet einmal mit 70% Ethanol und luftgetrocknet, das Pellet resuspendiert, das DNA-Pellet in 100 Mikroliter destilliertem Autoklav-Wasser, die DNA mit dem Kajak gereinigt, Schnellspinnsäulen und eluiert in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern Elutionspuffer. Diese DNA ist nun bereit für die Verwendung für die PCR-Amplifikation

Die Analyse der QPCR-Reserven zur Erzielung einer vollständigen Anreicherung über einen ungebundenen Kontrollbereich ist der wichtigste Aspekt dieses Protokolls. Gehen Sie mit der QPCR-Software zum Editor und markieren Sie die Vertiefungen mit Eingabeproben verschiedener Verdünnungen mit ihren Standardkurvenwerten. Beschriften Sie die Wells auch mit unbekannten Chipproben genau so, wie die PCR-Platte ausgelegt ist.

Die Verwendung einer Standardkurve zur Interpolation der DNA-Mengen in den unbekannten spezifischen und isotypischen Proben ermöglicht die Bewertung und Anpassung der Qualität und Effizienz aller Primer-Sets über den in den Proben gefundenen Konzentrationsbereich. Gehen Sie zum Subset-Editor und markieren Sie die Subsets, einschließlich der Wells mit Eingabeproben sowie der unbekannten Chip-Proben. Die unbekannten Proben werden unter Verwendung der Standardkurve quantifiziert, die aus den bekannten Konzentrationen der Eingangsproben für die Analyse generiert wird.

Nachdem die PCR-Amplifikation abgeschlossen ist, führen Sie die Analyse mit ABS quant durch. Zweite Ableitung max. Wählen Sie die Teilmenge für die Analyse aus und drücken Sie die Eingabetaste. Okay.

Drücken Sie auf Berechnen, wodurch die Standardkurve unter Verwendung der bekannten Konzentrationen der Eingabeproben generiert und die absolute Menge an DNA in den unbekannten Proben angezeigt wird, wenn die Qualität der She-DNA gut ist und wenn die Primer spezifisch an die Zielregion binden, sollte die PCR-Effizienz nahe bei zwei liegen. Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse mit TM durch, die dieselbe Teilmenge erfordert, falls verfügbar. Ein einzelner Peak zeigt an, dass nur ein bestimmtes Produkt amplifiziert wurde.

Die Amplifikation spezifischer DNA kann auch durch Elektro des PCR-Produkts getestet werden, zusammen mit der DNA-Leiter durch ein AROS-Gel. Die erhaltenen Daten werden dann als tabulatorgetrennte Textdatei exportiert, die zur weiteren Analyse in Microsoft Excel geöffnet werden kann. Teilen Sie die DNA-Menge für den spezifischen Antikörper durch die Isotypkontrolle für die Zielprimer.

Wiederholen Sie diesen Schritt für den Kontrollbereich Primer. Werden mehrere Antikörper des gleichen Isotyps für unterschiedliche Immunpräzipitationen verwendet, normalisieren Sie diese jeweils mit den Werten aus der gleichen Isotypkontrolle. Darüber hinaus sollten bei Verwendung mehrerer Zielprimerpaare die DNA-Mengen aus einem einzigen Kontrollprimer-Reparaturset für die Normalisierung jedes Ziels verwendet werden.

Die Ausgabewerte stellen die spezifische Immunpräzipitations-Faltenanreicherung des spezifischen Antikörpers an jeder Stelle im Verhältnis zu unspezifischen Antikörpern dar. Hintergrund-Immunpräzipitation: Teilen Sie die Faltenanreicherung für gezielte Primer durch die Faltenanreicherung für Primer der Kontrollregion, um eine Anreicherung relativ zu einer ungebundenen Kontrollregion zu erhalten. Wichtig ist, dass aufgrund der Generierung von Standardkurven mit der Gesamteingabe-DNA für jede Probe jeder der Immunpräzipitationswerte, die vom Standard interpoliert werden, bereits auf den Anteil der Gesamteingabe durch die Maschinensoftware normiert und ausgedrückt werden. Das hier demonstrierte Chromatin-Immunpräzipitationsprotokoll kontrolliert auf Unterschiede, falls vorhanden, in der Menge der in der PCR verwendeten DNA durch die Verwendung eines Primerpaares, das eine ungebundene Region des Genoms amplifiziert und somit als Beladungskontrolle dient.

In diesem Beispiel wurde die kodierende Region des Beta-Aktin-Gens der Maus als eine Region verwendet, die nicht an das Protein von Interesse gebunden ist, und der Transkriptionsfaktor und die Fettbindungsstelle auf der Maus, dem IL-2-Promotor, wurden als Zielregion verwendet. Dieser Schnappschuss einer Excel-Tabelle zeigt die Verwendung des Berechnungsprotokolls, das in den Analysedaten von drei experimentellen Wiederholungen in den gelb, grün und violett gefärbten Feldern mit drei technischen Replikaten beschrieben ist. Jedes wurde zur Berechnung der Faltanreicherung verwendet.

Die relative Anreicherung eines Proteins, das an verschiedene Regionen des Genoms gebunden ist, kann verglichen werden, wenn derselbe Satz von Isotyp-Kontroll- und spezifischen Antikörpern gewählt wird. Wenn die Spezifität des Antikörpers gut ist, wird typischerweise eine zwei- bis zehnfache Anreicherung über die ungebundene Kontrollregion beobachtet. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse eines Chip-Experiments mit konventionellen Zöliakie-Vier-T-Zellen und regulatorischen Zölia-Vier-T-Zellen, die aus Mäusen isoliert wurden.

Ein kleiner Teil der konventionellen T-Zellen wurde 30 Minuten lang mit PMA und Ionenmycin stimuliert. Die relative Anreicherung der NFA-Transkriptionsfaktoren, N Fett C eins und NFA C zwei am IL zwei Promotor wurde beobachtet und ist hier als Faltenanreicherung über eine ungebundene Region dargestellt. Nach diesem Verfahren ist dies zu beobachten. Andere Methoden wie ChIP-seq können verwendet werden, um die globale Belegung von Transkriptionsfaktoren oder globale Veränderungen epigenetischer Markierungen als Reaktion auf einen Stimulus zu adressieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Chromatin-Immunpräzipitation mit einer begrenzten Anzahl von Zellen durchführen und QPCI-Daten analysieren können, um das Transkriptionsfaktor-Banding im Vergleich zu einer ungebundenen Kontrollregion zu bestimmen.