Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, entweder die Bindung von DNA-bindenden Proteinen wie Transkriptionsfaktoren oder deren Histonmodifikationen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst in einem zweiten Schritt das Chromatin vorbereitet wird. Anschließend wird eine Chromatin-Immunpräzipitationsreaktion durchgeführt, um DNA-Fragmente anzureichern, die an das Protein von Interesse gebunden sind.

Anschließend wird das an das Protein der Wahl gebundene DNA-Fragment mittels PCR amplifiziert. Die Ergebnisse zeigen eine Anreicherung des an das Protein der Wahl gebundenen DNA-Fragments im Vergleich zu einer nicht gebundenen Region, basierend auf der qPCR-Analyse. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Transkription, Chromatin und Epigenetik zu beantworten, beispielsweise wann und wo verschiedene modifizierte oder unmodifizierte Proteine vorkommen.

Auf der DNA, obwohl diese Methode Einblicke in die Genregulation von T-Zellen ermöglichen kann. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise B-Lymphozyten, Leukämieproben und immortalisierte Zelllinien. Das Chromatin für dieses Experiment wird aus naiven CD4+-T-Zellen der Mausmilz gewonnen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 37% Formaldehyd zu der CD4+-T-Zell-Suspension in DMEM, um eine Endkonzentration von 1% zu erreichen, und schwenken Sie vorsichtig 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dadurch werden die DNA-Protein-Komplexe vernetzt. Beenden Sie die Vernetzung durch Zugabe von einmolarem Glycin auf eine Endkonzentration von 125 Millimolar.

Weiterhin fünf Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Die Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g fünf Minuten bei vier Grad Celsius sammeln. Den Überstand entfernen und die Zellen in fünf Milliliter eiskalter PBS, die Proteaseinhibitoren enthält, resuspendieren; erneut zentrifugieren. Die Zellen auf diese Weise insgesamt dreimal waschen. Nach dem letzten Waschschritt den Überstand verwerfen und die Zellen in einem Milliliter eiskaltem Zelllysepuffer, der Proteaseinhibitoren enthält, resuspendieren.

Überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang auf Eis. Sammeln Sie die Kerne durch Zentrifugation bei 200 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Kerne in 500 µL Kernlysepuffer.

Puffer mit Proteaseinhibitoren 15 Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend die Zellen mit einer 1,6-Millimeter-Sonde und einer Ausgangsleistung von vier für 15 Sekunden beschallen. Die Probe zur Vermeidung einer Überhitzung für ein bis zwei Minuten auf Eis abkühlen und erneut für 15 Sekunden beschallen.

Wiederholen Sie die Beschallung und Abkühlung insgesamt viermal. Zentrifugieren Sie das sonifizierte Chromatin bei 16.000 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie das klare Überstand in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen.

Entnehmen Sie eine 20-Mikroliter-Aliquot klaren Überstand. Geben Sie DNA-Ladefarbstoff hinzu und überprüfen Sie die sonifizierte DNA mittels Elektrophorese in einem 2%-Agarosegel. Die ideale Größe der sonifizierten DNA für die meisten Anwendungen liegt zwischen 200 und 500 Basenpaaren.

Bestimmen Sie abschließend die DNA-Konzentration mithilfe eines UV-Spektrophotometers. Das fragmentierte Chromatin kann unmittelbar zur Durchführung einer Chromatin-Immunpräzipitation verwendet oder bei minus 80 Grad Celsius zur späteren Verwendung in der Chromatin-Immunpräzipitation aufbewahrt werden. Verdünnen Sie das sonifizierte Chromatin in Chip-Verdünnungspuffer mit Proteaseinhibitoren auf eine DNA-Konzentration von fünf bis 10 Mikrogramm pro Milliliter in einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern. Alle Schritte dieses Verfahrens müssen bei null bis vier Grad Celsius durchgeführt werden.

Speichern Sie 10 %, was in diesem Beispiel 200 Mikroliter der verdünnten, sonifizierten Chromatinlösung entspricht, als Input-Probe auf Eis. Geben Sie den verbleibenden Probenanteil – jeweils 450 Mikroliter – in vier mit „Isotyp-Kontrolle“ und „Antikörper der Untersuchung“ beschriftete 1,7-Milliliter-Mikroreaktionsgefäße. Falls mehrere Antikörper desselben Isotyps verwendet werden, genügt eine einzige Isotyp-Kontrolle. Für diese Analyse geben Sie zwei bis fünf Mikrogramm des spezifischen Antikörpers – abhängig von der Spezifität des verwendeten Antikörpers – beziehungsweise der Isotyp-Kontrolle in die jeweiligen Röhrchen. Schwenken Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius, um die Bildung von Chromatin-Antikörper-Komplexen zu ermöglichen, am folgenden Morgen.

Fügen Sie 25 Mikroliter magnetische Protein-G-Kügelchen zu jeder Mischung hinzu und inkubieren Sie mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius unter Schütteln. Stellen Sie anschließend die Zentrifugenröhrchen für 15 bis 20 Sekunden auf einen Magnethalter, damit sich die Kügelchen an der magnetisierten Seite sammeln können. Entfernen Sie vorsichtig die Lösung durch Absaugen, ohne die Kügelchen zu stören.

Geben Sie ein Milliliter der Low-Salt-Waschlösung hinzu und schwenken Sie vorsichtig fünf Minuten lang auf dem Mutator. Sammeln Sie die Kügelchen mithilfe des Magnethalters und entfernen Sie die Waschlösung. Geben Sie erneut ein Milliliter der Low-Salt-Waschlösung hinzu und schwenken Sie fünf Minuten lang vorsichtig.

Nachdem die Pufferlösung mit niedriger Salzkonzentration entfernt wurde, ein Milliliter Pufferlösung mit hoher Salzkonzentration hinzufügen und fünf Minuten lang schwenken. Die Perlen mithilfe des Magnethalters sammeln und die Waschlösung entfernen. Den Waschschritt mit der Pufferlösung mit hoher Salzkonzentration wiederholen.

Nachdem die Hochsalzwaschlösung entfernt wurde, ein Milliliter Lithiumchlorid-Waschlösung hinzufügen und fünf Minuten lang schwenken. Die Kügelchen mithilfe des Magnethalters sammeln und die Waschlösung entfernen. Den Lithiumchlorid-Waschschritt einmal wiederholen.

Geben Sie ein Milliliter TE-Lösung hinzu und schwenken Sie fünf Minuten lang. Sammeln Sie die Perlen mithilfe des Magnethalters und entfernen Sie die Waschlösung. Eluieren Sie die DNA aus den Perlen, indem Sie 250 Mikroliter Eluierpuffer hinzufügen, und schwenken Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Pipettieren Sie das EIT ab und bewahren Sie dieses Material in einem neuen 1,7-Millimeter-Fuge-Röhrchen auf. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal und kombinieren Sie beide Eluate; verwerfen Sie die Perlen, um die Vernetzungen aufzuheben. Geben Sie dem eluierten DNA fünf Molar Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,3 Molar und ein Mikroliter RNAsen hinzu.

Geben Sie 400 µL Elutionspuffer zu den zuvor aufbewahrten Input-Proben hinzu. Um das Volumen auf 500 µL pro Input anzupassen, fügen Sie Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M, ein µL RNA, 10 µL 0,5 M EDTA, 20 µL 1 M Tris, HCl pH 6,5 und ein µL Proteinase K hinzu. Verschließen Sie die Röhrchen und inkubieren Sie sie über Nacht bei 65 °C in einem trockenen Heizblock. Am folgenden Morgen lassen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur abkühlen. Geben Sie dann ein mL 100 %igen Ethanol hinzu und inkubieren Sie für zwei Stunden bis über Nacht bei −80 °C.

Um die DNA abzutrennen, die Röhrchen bei 16.000 ×g für 15 Minuten zentrifugieren. Um das DNA-Pellet zu waschen, das DNA-Pellet einmal mit 70 %igem Ethanol waschen und lufttrocknen lassen, dann das DNA-Pellet in 100 µL autoklaviertem destilliertem Wasser resuspendieren, die DNA mit KAYAK-Quick-Spin-Säulen reinigen und in einem Gesamtvolumen von 50 µL Elutionspuffer eluieren. Diese DNA ist nun bereit für die Verwendung in der PCR-Amplifikation.

Die Analyse der QPCR-Reserven, um eine vollständige Anreicherung gegenüber einer Kontrollregion ohne Bindung zu erzielen, ist der wichtigste Aspekt dieses Protokolls. Verwenden Sie die QPCR-Software, wechseln Sie zum Editor und markieren Sie die Vertiefungen, die Input-Proben verschiedener Verdünnungen enthalten, mit ihren Standardkurvenwerten. Kennzeichnen Sie außerdem die Vertiefungen mit unbekannten ChIP-Proben genau entsprechend der Anordnung auf der PCR-Platte.

Die Verwendung einer Standardkurve zur Interpolation der DNA-Mengen in den unbekannten spezifischen und Isotyp-Proben ermöglicht die Bewertung und Abstimmung der Qualität und Effizienz aller Primer-Sets über den Konzentrationsbereich, der in den Proben vorliegt. Wechseln Sie zum Subset-Editor und markieren Sie die Subsets, einschließlich der Wells mit den Input-Proben sowie der unbekannten Chip-Proben. Die unbekannten Proben werden anhand der Standardkurve quantifiziert, die aus den bekannten Konzentrationen der Input-Proben für die Analyse erstellt wurde.

Nach Abschluss der PCR-Amplifikation die Analyse mit ABS Quant. zweite Ableitung Maximum durchführen. Die Teilmenge für die Analyse auswählen und auf „Okay“ klicken.

Drücken Sie „Berechnen“, wodurch die Standardkurve anhand der bekannten Konzentrationen der eingegebenen Proben generiert wird, und die absolute Menge an DNA in den unbekannten Proben angezeigt wird, sofern die Qualität der DNA gut ist. Wenn die Primer spezifisch an den Zielbereich binden, sollte die PCR-Effizienz nahe bei zwei liegen. Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse mit TM-Bestimmung für dieselbe Teilliste durch, falls verfügbar. Ein einzelner Peak zeigt an, dass nur ein spezifisches Produkt amplifiziert wurde.

Die Amplifikation einer spezifischen DNA kann auch durch Elektrophorese des PCR-Produkts zusammen mit der DNA-Leiter durch ein AROS-Gel überprüft werden. Die erhaltenen Daten werden anschließend als tabulatorgetrennte Textdatei exportiert, die in Microsoft Excel zur weiteren Analyse geöffnet werden kann. Teilen Sie die DNA-Menge für den spezifischen Antikörper durch die Isotyp-Kontrolle für die gezielten Primer.

Wiederholen Sie diesen Schritt für die Kontrollregion-Primer. Wenn mehrere Antikörper desselben Isotyps für verschiedene Immunpräzipitationen verwendet werden, normalisieren Sie jede dieser Proben mit den Werten aus dem entsprechenden Isotyp-Kontrollversuch. Außerdem, wenn mehrere gezielte Primerpaare verwendet werden, sollten die DNA-Mengen aus einem einzigen Kontrollprimer-Paar zur Normalisierung jedes Ziels verwendet werden.

Die Ausgabewerte stellen die spezifische Antikörper-Immunpräzipitations-Fold-Anreicherung an jeder Position relativ zur unspezifischen Antikörper-Hintergrundimmunpräzipitation dar. Teilen Sie die Fold-Anreicherung für gezielte Primer durch die Fold-Anreicherung für Kontrollregion-Primer, um die Anreicherung relativ zu einer kontrollierten, nicht gebundenen Region zu erhalten. Wichtig ist, dass aufgrund der Erstellung von Standardkurven mit der gesamten eingesetzten DNA für jede Probe die aus der Standardkurve interpolierten Immunpräzipitationswerte bereits durch die Maschinensoftware normalisiert und als Bruchteil der gesamten eingesetzten DNA ausgedrückt werden. Das hier dargestellte Chromatin-Immunpräzipitationsprotokoll berücksichtigt Unterschiede, falls vorhanden, in der für die PCR verwendeten DNA-Menge durch Verwendung eines Primerpaares, das eine nicht gebundene Genomregion amplifiziert, und dient somit als Ladekontrolle.

In diesem Beispiel wurde der kodierende Bereich des Maus-Beta-Aktin-Gens als Region verwendet, die nicht an das Protein der Interesse bindet, und die Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor und Fett auf dem Maus-IL-2-Promotor diente als Zielregion. Diese Momentaufnahme einer Excel-Tabelle veranschaulicht die Anwendung des Berechnungsprotokolls, das zur Analyse der Daten aus drei experimentellen Wiederholungen in den gelb, grün und lila markierten Feldern mit jeweils drei technischen Wiederholungen verwendet wurde. Jede wurde zur Berechnung der Anreicherung in Falten herangezogen.

Die relative Anreicherung eines Proteins, das an verschiedene Regionen des Genoms gebunden ist, kann verglichen werden, wenn dieselbe Menge von Isotyp-Kontroll- und spezifischen Antikörpern verwendet wird. Wenn die Spezifität des Antikörpers gut ist, wird typischerweise eine zwei- bis zehnfache Anreicherung gegenüber der ungebundenen Kontrollregion beobachtet. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse eines ChIP-Experiments mit konventionellen CD4-T-Zellen und regulatorischen CD4-T-Zellen, die aus Mäusen isoliert wurden.

Ein kleiner Anteil konventioneller T-Zellen wurde 30 Minuten lang mit PMA und Ionomycin stimuliert. Eine relative Anreicherung der Transkriptionsfaktoren NFA, N fat C one und NFA C two am IL-two-Promotor wurde beobachtet und ist hier als Faltanreicherung gegenüber einer nicht gebundenen Region nach diesem Verfahren dargestellt. Andere Methoden wie die ChIP-seq können verwendet werden, um die globale Besetzung von Transkriptionsfaktoren oder globale Veränderungen epigenetischer Markierungen als Reaktion auf einen Stimulus zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Chromatin-Immunpräzipitation mit einer begrenzten Anzahl von Zellen durchführt, und wie man QPCI-Daten analysiert, um die Bandenbildung von Transkriptionsfaktoren im Vergleich zu einer Kontrollregion, die nicht gebunden ist, zu bestimmen.