Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Das übergeordnete Ziel dieses Chromatin-Immunpräzipitationsverfahrens ist es, die TGF beta 1-induzierte Bindung des Transkriptionsfaktors SMAD2 an SMAD-Bindungselemente im C-Kit-Promotor zu untersuchen. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie beantworten, wie z.B. die Zytokin-induzierte Gentranskription. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Potenzial hat, die direkte Bindung von Transkriptionsfaktoren und anderen transkriptionsregulatorischen Proteinen an ihre DNA-Bindungsstellen in vivo zu demonstrieren.

Züchten Sie die Zellen auf zehn Zentimeter großen Gewebekulturplatten auf einen Konfluenzgrad von 70 bis 80 %. Stimulieren Sie die Zellen gemäß den experimentellen Zielen. Entfernen Sie das Gewebekulturmedium und fügen Sie fünf Milliliter Fixierlösung hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Schüttelplattform. Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Millilitern eiskaltem One X PBS. Entfernen Sie das eine X PBS und fügen Sie fünf Milliliter Glycin-Stop-Fix-Lösung hinzu.

Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Schüttelplattform inkubiert haben, entfernen Sie die Glycin-Stop-Fix-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Millilitern eiskaltem One X PBS. Nach dem Entfernen des PBS fügen Sie zwei Milliliter Zellkratzlösung hinzu und ernten Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Übertragen Sie dann die geernteten Zellen in ein konisches Röhrchen auf Eis.

Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 600 mal G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter eines X-Zell-Lysepuffers und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Sobald das Pellet wieder im Zelllysepuffer suspendiert ist, übertragen Sie die Zellsuspension in einen eiskalten Dounce-Homogenisator und dounce für 10 Hübe mit einem Stößel vom Typ B für den Zellaufschluss.

Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 2.400 mal G und vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut in 350 Mikrolitern Zellkernaufschlusspuffer. Nachdem die Proben fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden, fügen Sie Mikrokokken-Nuklease hinzu und mischen Sie sie durch Vortexen.

Inkubieren Sie die Proben fünf bis 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und mischen Sie die Proben alle zwei Minuten durch Inversion. Die Zeit in einer gewissen Konzentration, wenn Sie sich zwischen Zelllinien befinden, kann im Falle einer suboptimalen enzymatischen Scherung optimiert werden. Ein alternatives Scherverfahren unter Verwendung von kommerziell erhältlichen sonicare findet sich im Textprotokoll.

Nach der Inkubation mit der Mikrokokken-Nuklease fügen Sie sieben Mikroliter eiskaltes 0,5 molares EDTA hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Proben mit der gescherten DNA für 10 Minuten bei 16, 200 mal G und vier Grad Celsius. Übertragen Sie die gescherte DNA, die den Überstand enthält, in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen.

Aliquotieren Sie 50 Mikroliter in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen, um das erfolgreiche Scheren der DNA zu bestätigen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie das restliche Volumen sofort für die Immunpräzipitation oder lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Kombinieren Sie 10 bis 25 Mikrogramm des gescherten vernetzten Chromatins mit 25 Mikrolitern magnetischen Protein-G-Beads in Chromatin-Immunpräzipitationsqualität.

Fügen Sie dann 10 Mikroliter Immunpräzipitationsverdünnungspuffer und einen Mikroliter Proteasehemmer-Cocktail hinzu. Nach vierstündiger Inkubation geben Sie ein bis 10 Mikrogramm Antikörper in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Und fügen Sie destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern hinzu.

Inkubieren Sie die Proben auf einem End-to-End-Rotator für vier bis 12 Stunden bei vier Grad Celsius. Stellen Sie die Röhrchen nach der Inkubation auf einen Magnetständer. Sobald sich die magnetischen Kügelchen an der Seite des Röhrchens ansammeln, entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn.

Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 800 Mikrolitern Waschpuffer eins. Mischen Sie die Kügelchen bei jeder Wäsche, indem Sie die Tube mehrmals umdrehen. Legen Sie dann die Tube auf den Magnetständer und entfernen Sie vorsichtig den Waschpuffer, sobald sich die Magnetkügelchen an der Seite der Tube ansammeln.

Waschen Sie die Kügelchen anschließend einmal mit 800 Mikrolitern Waschpuffer zwei mit dem gleichen Verfahren. Nach dem Waschen werden die Kügelchen wieder in 50 Mikroliter Elutionspuffer suspendiert und die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem End-to-End-Rotator inkubiert. Übertragen Sie dann den Überstand mit Hilfe des Magnetständers auf ein frisches Röhrchen.

Fügen Sie sechs Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid hinzu, um die Vernetzung umzukehren, gefolgt von zwei Mikrolitern Proteinase K. Nachdem Sie die Proben gemischt haben, inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben direkt auf Proteinbindungsstellen analysiert werden, wie im Textprotokoll beschrieben, oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Um die TGF beta 1-induzierte Bindung von SMAD2 an den SCF-Promotor zu bestätigen, wurde der Chromatin-Immunpräzipitationsassay durchgeführt.

Die TGF-beta-1-Behandlung führte zu einer SMAD2-Bindung an den SCF-Promotor in menschlichen Leberkrebslinien, HepG2 und Hep3B. In Abwesenheit einer TGF-beta-1-Stimulation wurde keine SMAD-Bindung festgestellt. Als Positivkontrolle wurde für die TGF beta 1-induzierte SMAD-Aktivierung eine Chromatin-Immunpräzipitation für PAI-1 durchgeführt.

Der PAI-1-Promotor ist ein bekanntes Ziel von TGF beta und SMAD. Die Spezifität der SMAD2-Immunpräzipitation wurde durch die Verwendung von unspezifischen IgG-Antikörpern bestätigt. Nach Immunpräzipitation mit IgG wurde keine SMAD2-Bindung an das SBE festgestellt.

Um die TGF beta 1-induzierte Bindung von STAT3 an das TGF beta Liganden-Gen zu bestätigen, wurden Chromatin-Immunpräzipitationsassays mit TGF beta 1 behandelten HepG2- und Hep3B-Zellen durchgeführt. Die TGF-beta-1-Behandlung führte zu einer Bindung von STAT3 an die zweite mutmaßliche STAT3-Bindungsstelle des TGF-beta-Gens, jedoch nicht an die erste. In diesem Beispiel dient die positive STAT3-Bindung an STB-2 als interne Positivkontrolle.

Ähnlich wie bei den anderen Chromatin-Immunpräzipitationsexperimenten wurde nach Immunpräzipitation mit IgG keine Bindung von STAT3 an das ST-2 beobachtet. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie je nach Antikörper in ein oder zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Sicherheitsrichtlinien des Labors zu befolgen und bei jedem Schritt des Protokolls sehr genau zu sein.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten Vorsichtsmaßnahmen wie die Überprüfung des Sicherheitsdatenblatts und das Tragen von Schutzausrüstung wie Handschuhen, weißem Kittel und Schutzbrille getroffen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Proteinbindung an die spezifischen DNA-Bindungssequenzen analysiert. Im Anschluss an dieses Protokoll können weitere Methoden wie Promotor-Assays durchgeführt werden, um die funktionelle Relevanz der Protein-DNA-Bindung zu bestätigen, die durch Chromatin-Immunpräzipitation nachgewiesen wurde.