Automatisierung von ChIP-seq Experimente Epigenetische Profile auf 10.000 HeLa-Zellen zu generieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Forschern eine automatisierte Plattform zur Verfügung zu stellen, die in der Lage ist, Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente an nur 10.000 Zellen durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst hochwertiges Scherchromatin für die Chromatin-Immunpräzipitation vorbereitet wird. Im zweiten Schritt wird ein automatisiertes Chromatin-Immunpräzipitationsexperiment erstellt und automatisierte Bibliotheken mit der immunpräzipitierten DNA ausgeführt.

Die immunpräzipitierte DNA wird mittels quantitativer PCR und Next Generation Sequencing analysiert. Letztendlich kann der Erfolg der automatisierten Technologie durch den Vergleich der Chromatin-Immunpräzipitationssequenzprofile, die an der ursprünglichen Probe von 10.000 Zellen generiert wurden, mit Experimenten, die an 100.000 Zellen durchgeführt wurden, und vorhandenen Datensätzen als Referenz validiert werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im epigenetischen Bereich zu beantworten, um unser Verständnis der Funktionen spezifischer Biomarker in verschiedenen Geweben zu verbessern.

Entwicklungsstadien und Krankheitszustände. Diese Technik hat Auswirkungen auf die Diagnose mehrerer Krankheiten, da sie dazu beitragen wird, epigenetische Biomarker in Gesundheit und Krankheit genau und zuverlässig zu identifizieren. Automatische Technologien sind wichtige Werkzeuge für Forscher bei der epigenetischen Analyse bestimmter Zelltypen, Subpopulationen und Biopsien.

Für ein standardmäßiges automatisiertes Chromatin-Immunpräzipitationsexperiment beginnen Sie mit der Zugabe von 120 Mikrolitern Chromatin-Immunpräzipitationspuffer H zu 100 Mikrolitern geschertem Chromatin von einer bis 2 Millionen Zellen und reservieren Sie zwei bis 20 Mikroliter Chromatin für die Eingabeprobe. Um das automatisierte Experiment auf dem IP Star Compact einzurichten, wählen Sie Protokolle aus und klicken Sie auf das Symbol für die Chromatin-Immunpräzipitation. Wählen Sie die direkte Methode der Chromatin-Immunpräzipitation und dann im nächsten Bildschirm das Chromatin-Immunpräzipitationsprotokoll 200 Mikroliter und geben Sie die Probennummer an.

Stellen Sie die experimentellen Parameter für die Chromatin-Immunpräzipitation für die Antikörperbeschichtung auf vier Stunden ein. Schritt 15 Stunden für den Immunpräzipitationsschritt und fünf Minuten für jeden Waschschritt. Richten Sie dann die Reagenzien gemäß den Anweisungen auf dem Bildschirm mit den Layoutinformationen ein und fügen Sie die entsprechenden Reagenzien und hochgradig validierten Antikörper in ChIP-seq-Qualität hinzu.

Fügen Sie dann 20 Mikroliter Protein, A-beschichtete magnetische Kügelchen für jede Reaktion hinzu, und die Chromatinproben nach dem Overnight-Chip-Protokoll und der umgekehrten Vernetzung sind abgeschlossen. Reinigen Sie die DNA mit einem DNA-Aufreinigungskit auf Magnetbead-Basis. Verwenden Sie einen hochempfindlichen kommerziellen fluormetrischen Assay, um die immunpräzipitierte DNA zu quantifizieren.

Als nächstes werden Primer für mindestens eine positive und eine negative Kontrollgenomregion verwendet. Analysieren Sie die Qualität der immunpräzipitierten DNA durch quantitative PCR gemäß den entsprechenden Parametern der Materialien für die Analyse. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Wiederfindung des Inputs für die Sequenzierung der nächsten Generation unter Protokollen ausgedrückt.

Klicken Sie nun auf das Symbol für die Bibliotheksvorbereitung, wählen Sie dann die gewünschte Bibliotheksvorbereitungstechnologie aus und richten Sie die Reagenzien gemäß den Anweisungen auf dem Bildschirm mit den Layoutinformationen ein. In diesem Experiment wurden beispielsweise Sequenzierungsprofile für sechs verschiedene Histonmodifikationen erstellt, die mit der Genexpression assoziiert sind. Die hohe Peakkorrelation, die zwischen diesen Histonmarkern beobachtet wurde, deutet auf die Fähigkeit des automatisierten Systems hin, genaue und zuverlässige Daten zu generieren.

Darüber hinaus zeigen diese Diagramme die Verteilung der Peaks für die verschiedenen Histonmodifikationen in bestimmten genomischen Regionen. Für ein automatisiertes Chromatin-Immunpräzipitationsexperiment für Proben mit geringer Zellzahl stellen Sie schließlich das automatisierte Chromatin-Immunpräzipitationsprotokoll 200 Mikroliter auf das Automatisierungssystem ein, wie gerade gezeigt. Als nächstes bestücken Sie das System mit dem ChIP-seq, Grade Antikörper und Reagenzien optimieren die Arbeit mit Chromatinmengen zwischen 10.000 und 100.000 Zellen mit nur 10 Mikrolitern Protein, A-beschichteten magnetischen Kügelchen für jede Reaktion.

Führen Sie nach dem Chip die Bibliotheksvorbereitung durch, wählen Sie das Microplex-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll aus und richten Sie die Reagenzien gemäß den Anweisungen ein, die auf dem Bildschirm mit den Layoutinformationen angezeigt werden. In dieser repräsentativen quantitativen PCR einer Chromatin-Immunpräzipitation aus einer Ausgangsprobe von 10.000 Zellen wurden signifikante Anreicherungen mit den Anti-Histon-Antikörpern in den positiven Kontrollregionen und vernachlässigbare Signale in den negativen Kontrollregionen beobachtet. Hier wird eine Serie von 10 Immunpräzipitationsreaktionen gezeigt, die reproduzierbar und sehr gut vergleichbar mit einem manuellen Chromatin-Immunpräzipitationsexperiment waren, was die Fähigkeit des automatisierten Systems demonstriert, mit geringen Zellmengen zu arbeiten, ohne dass die Variabilität von Experiment zu Experiment im Vergleich zur manuellen Immunpräzipitation sichtbar zunimmt.

Diese Daten veranschaulichen die bioinformatischen Analysen der Sequenzbibliotheken von 10.000 und 100.000. Er hat S3-Zellen nach der Chromatin-Immunpräzipitation untersucht und damit hervorragende Ergebnisse aus den Chromatin-Immunpräzipitationsproben mit niedriger Zellzahl gezeigt. Dieser Datensatz, der dem Experiment mit 10.000 Zellen Ausgangsmaterial entspricht, enthält ein geringes Hintergrundrauschen mit äußerst zuverlässigen Anreicherungspeaks, die sowohl durch den Datensatz mit 100.000 Zellen als auch durch den Referenzdatensatz des Broad Institute bestätigt werden.

Für das Codierungsprojekt ist es wichtig zu beachten, dass die 10.000 Zelldaten fast identische Peaks wie die Daten des Broad Institute aufweisen, mit einem Überlappungsverhältnis von 98 % der besten 40 % der Peaks, die nach dem signifikanten Score geordnet sind, wie er im Endcode-Projekt verwendet wird. Das automatisierte IP star-System erfordert nur minimale Bedienereingriffe, wodurch die HandsOn-Zeit der Chromatin-Immunpräzipitation auf nur ein bis zwei Stunden reduziert wird. Darüber hinaus ersetzt der automatisierte Prozess die zahlreichen fehleranfälligen Schritte der manuellen Chromatin-Immunpräzipitation und liefert hochkonsistente Ergebnisse.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine gute Chromatin-Immunpräzipitation und eine gute Auswahl an hochspezifischen und sensitiven Antikörpern der Schlüssel zum Erfolg des Experiments sind. Diese Technologie ebnete Forschern in allen Bereichen der Biologie den Weg, um die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Konsistenz der Therapie zu verbessern. Epigenetische Studien.