Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Präparation von Chromatin aus dem Skelettmuskel adulter Mäuse. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen zur Genregulation und zu skelettalen Muskelfasern zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Herstellung von ChIP-Chromatin aus dem Skelettmuskel der Maus ermöglicht.

Ein physikalisch widerstandsfähiges Gewebe mit einem hohen Gehalt an Strukturproteinen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir versuchten, die molekularen Mechanismen zu charakterisieren, die der gluco-artikulierten Muskelatrophie zugrunde liegen, was die Identifizierung von gluco-artikulierten Rezeptor- und DNA-Bindungsstellen in den Skelettmuskelfasern der Maus erfordert. Das Verfahren wird von Shilpy Joshi, einem Postdoc aus unserem Labor, demonstriert.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, stellen Sie gefrorene oder frisch präparierte Muskeln der Hintergliedmaßen wieder her. Anschließend die Muskeln in einem zwei Milliliter fassenden Reagenzglas, das einen Milliliter eiskalten hypotonen Puffer enthält, mit einer feinen Schere zu einer homogenen Zubereitung aus kleinen Stücken zerkleinern. Lassen Sie das Rohr anschließend fünf bis 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Tischrührwerk schütteln.

Übertragen Sie anschließend das präparierte Gewebe in ein 14-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, das vier Milliliter kalten hypotonen Puffer enthält. Homogenisieren Sie das zerkleinerte Gewebe mit einem mechanischen Gewebehomogenisator für 15 bis 30 Sekunden. Anschließend wird das Homogenat in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.

Fügen Sie kalten hypotonischen Puffer hinzu, um 10 Milliliter der Probe zu erhalten, und fixieren Sie das Homogenat, bevor Sie mit der nächsten Maus fortfahren. Bei diesem Verfahren fügen Sie der Probe Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen. Und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur schütteln.

Fügen Sie als nächstes Glycin hinzu, um eine Endkonzentration von 0,125 molaren in jedem Röhrchen zu erreichen, um die Fixierung zu stoppen. Und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Danach wird das fixierte Lysat mit einem losen Dounce homogenisiert.

Füllen Sie es dann in ein 15-Milliliter-Röhrchen um und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 1000 g bei vier Grad Celsius, um Zellkerne und Zelltrümmer zu erhalten. Entfernen Sie nach fünf Minuten den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in fünf Millilitern frischem hypotonischem Puffer. Das Lysat wird durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen filtriert.

Waschen Sie den Filter mit einer Pipettenspitze mit einem Milliliter kaltem hypotonischem Puffer. Anschließend wird das Filtrat durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb wieder filtriert. Anschließend wird das Filtrat in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Und zentrifugieren Sie bei 1000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um das nukleare Pellet zu erhalten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie einen Milliliter hypotonischen Puffer, um die drei Pellets zu sammeln, und geben Sie sie in ein 1,5- bis Zwei-Milliliter-Röhrchen. Fünf Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren.

Als nächstes wird das Volumen des nuklearen Pellets im Vergleich zu Röhrchen mit einem bekannten Volumen an Flüssigkeit beurteilt und es in einem Ultraschallpuffer bis zum Drei- bis Vierfachen des gepackten Kernvolumens resuspendiert. Anschließend wird die Suspension mit einem Ultraschallgerät 10 bis 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius beschallt. Die beschallte Probe wird zentrifugiert und der Chromatinüberstand wird in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt.

Um zu entvernetzen, nehmen Sie 30 Mikroliter Chromatin in ein 1,5-Milliliter-Reagenzglas und fügen Sie 20 Mikroliter fünf molare Natriumchloride und 450 Mikroliter Wasser hinzu. Vervollständigen Sie das Volumen auf 500 Mikroliter und inkubieren Sie über Nacht bei 65 Grad Celsius. Führen Sie am nächsten Tag eine einstündige Behandlung mit einem Mikroliter Proteinase K, 10 Mikrolitern zwei molaren Tris bei pH 6,8 und 10 Mikrolitern 0,5 molaren EDTA für eine Stunde bei 42 Grad Celsius durch.

Führen Sie dann eine reguläre Phenol-Chloroform-Chloroform-Extraktion durch und fällen Sie die DNA mit einem Volumen Natriumacetat und zwei Volumen 100%igem Ethanol für eine Stunde bei minus 80 Grad Celsius oder über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Anschließend wird die DNA durch Zentrifugation bei 13.500 g für 15 Minuten pelletiert. Den Überstand dekantieren und das Pellet gründlich mit kaltem 70%igem Ethanol waschen und erneut fünf Minuten zentrifugieren.

Dekantieren Sie dann den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Danach suspendieren Sie das Pellet wieder in das ursprüngliche Volumen des Tris HCl EDTA-Puffers. Messen Sie die DNA-Konzentration in einem Spektralphotometer mit Absorptionsmitteln bei 260 Nanometern, 280 Nanometern.

Anschließend pipettieren Sie 500 bis 1000 Nanogramm DNA zusammen mit einer DNA-großen Leiter auf getrennten Bahnen eines 1,5%igen Agarosegels. Und führen Sie eine Elektrophorese durch, um die Fragmentgröße des Chromatins zu beurteilen. Zur Optimierung wurde die Homogenisierung entweder 15 Sekunden oder 45 Sekunden lang bei zwei Geschwindigkeiten, 18.000 und 22.000 U/min, durchgeführt.

Unter allen Bedingungen konnten die Zellkerne von den Gewebetrümmern getrennt werden, aber die Ausbeute war bei geringerer Geschwindigkeit optimal. Die Zellkerne können auch durch drei bis fünf Minuten langes Donzieren vorbereitet werden. Die mechanische Homogenisierung ist jedoch die Methode der Wahl, da eine optimale Ausbeute an Kernen in nur 15 Sekunden erreicht werden kann, was einen erheblichen Zeitgewinn ermöglicht, insbesondere wenn mehrere Proben verarbeitet werden müssen.

Mit Hilfe dieses Protokolls können bis zu 2,7 mal 10 bis zu sieben Zellkerne aus 500 Milligramm Gewebe isoliert werden, um 100 Mikrogramm Chromatin zu erzeugen. Das auf diese Weise hergestellte Chromatin liefert saubere, qualitativ hochwertige Ergebnisse in ChIP-Sequenzierungsexperimenten. Dies wird durch die hohen Konzentrationen von acetyliertem K27 von Histon H3 und RNA-Polymerase 2 am muskelexprimierten Desmond-Locus verdeutlicht.

Die Spezifität für Muskelfasern wird durch ein niedriges oder fehlendes Signal an den Pecam1- und Vcam1-Loci gezeigt, die nicht im Muskel exprimiert werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Homogenisatorsonde ordnungsgemäß in die Probe einzutauchen, um ein Aufschäumen zu vermeiden, die Sonde zwischen den Proben zu reinigen und die Chromatinfragmentierung zu optimieren. Das auf diese Weise hergestellte Chromatin wurde erfolgreich für ChIP verwendet, um die genomweite Belegung von Transkriptionsfaktoren zu kartieren, und sollte auch für Chromatin-Bestätigungs-Capture-Techniken geeignet sein.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forschung auf dem Gebiet der Genomik, um die Genregulation in der Skelettmuskulatur von Mäusen zu erforschen. Das Verfahren kann auch auf Muskeln von Ratten und Biopsien von menschlichen Patienten angewendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die mechanische Homogenisierung angewendet wird, gefolgt von der Reinigung von Formaldehyd-fixierten Kernen, um Chromatin aus dem Skelettmuskel für die Immunpräzipitation vorzubereiten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd, Phenol, Chloroform und Proteinase K gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einer Brille sollten getroffen werden. Schritte, bei denen diese Reagenzien zum Einsatz kommen, sollten unter einer Haube durchgeführt werden.