Mess-intrazellulären Ca ^{2 +} Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, intrazelluläre Kalziumschwankungen in menschlichen Spermien mit Fluoreszenzfarbstoffen zu messen. Dies wird erreicht, indem die Spermienprobe zunächst mit der Swim-up-Methode vorbereitet und bei Bedarf die Kapazitation gefördert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Spermien mit einem Kalziumfluoreszenzfarbstoff zu beladen.

Anschließend wird mit konventioneller Fluorometrie die Durchflussfluorometrie, die Durchflusszytometrie oder die Einzelzellbildgebung gestoppt, das Experiment durchgeführt und die Kalziummessungen aufgezeichnet. Letztendlich werden die Ergebnisse analysiert, um Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentrationen zu bestimmen, die durch Progesteron oder während des Kapazitationsprozesses ausgelöst werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. solchen, die Radioaktivität beinhalten, besteht darin, dass es sich um ein sehr empfindliches Verfahren handelt.

Es ist sicher und einfach durchzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im SPR-Kalzium-Signalfeld zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung von Verbindungen, die intrazelluläres Kalzium induzieren, die mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zunimmt und die Identifizierung verschiedener zellulärer Subpopulationen in einer Siemens-Probe. Die Implikationen, die sich beispielsweise aus der Anwendung der Durchflusszytometrie-Technik ergeben, erstrecken sich auf die Diagnose von Fruchtbarkeitsproblemen durch die Analyse des physiologischen Zustands männlicher Farbräume.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Untersuchung der Kalziummobilisierung menschlicher Spermien geben kann, kann sie auch auf andere Zelltypen wie männliche Skalen anderer Spezies oder andere Zelltypen wie Neuronen oder Muskelzellen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die diese Methode anwenden, Schwierigkeiten haben, da die Handhabung der Spermien nicht einfach ist und es wichtig ist, geeignete Bedingungen aufrechtzuerhalten, um lebensfähige und motorische Zellen durch das Experiment zu erhalten. Wir haben den Einsatz dieser Techniken durch die Kombination von Strategien aus verschiedenen Bereichen umgesetzt.

visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Vorbereitung und Handhabung der Probe sowie die Zugabe der Verbindungen schwer zu erlernen sind, da die Samenzellen während des Eingriffs beschädigt werden können und Artefakte in den Reaktionen während der Ausgabe der Verbindungen erhalten werden können. Zur Vorbereitung der Samenprobe muss je ein Milliliter Schinken F 10 Medium sorgfältig auf jeweils 500 Mikroliter verflüssigtes Sperma aufgetragen werden. Eloqua, berühren Sie mit der Spitze der Mikropipette die Wand des Röhrchens und dosieren Sie das Medium vorsichtig über der Probe.

Es ist wichtig, dies langsam zu tun, um eine Vermischung der Proben- und der Mittelschicht zu vermeiden. Das Medium wird mit zwei Millimolaren Calciumchlorid und fünf Milligramm pro Milliliter BSA ergänzt. Um die Kapazitation in vitro zu fördern, lehnen Sie die Röhren vorsichtig in einem Winkel von etwa 30 Grad.

Dadurch wird die Oberfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten vergrößert und somit die Verdrängung oder das Aufschwimmen von Samenzellen von der Probe in das Medium während der Inkubation verbessert. Legen Sie anschließend die mageren Reagenzgläser in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. 95% Luft für eine Stunde nach einer Stunde.

Mit einer Mikropipette vorsichtig die oberen 700 Mikroliter des Schinkens F 10 Medium aus jedem Röhrchen entfernen, das nun Motil-Spermien enthält. Bündeln Sie alle gesammelten Proben in einem einzigen, sauberen Glasröhrchen, um Blasenbildung zu vermeiden. Legen Sie 10 Mikroliter der gepoolten Probe auf das optische Flachglas eines Makula-Zählkammerbodens und setzen Sie das Deckglas ein.

Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen in der Kammer bilden, da dies zu einer ungenauen Zellzahl führen würde. Beobachten Sie unter einem Zusammengesetztenmikroskop, das mit einem 20-fach-Objektiv ausgestattet ist. Das Deckglas der Makula-Zählkammer hat ein großes Quadrat, das aus 100 kleineren Quadraten besteht.

Zähle die Zellen in einem beliebigen Streifen von 10 Quadraten. Diese Zahl stellt die Zellkonzentration in Millionen von Zellen pro Milliliter dar. Wiederholen Sie die Zählung in zwei weiteren 10 quadratischen Streifen und berechnen Sie den Mittelwert der drei Zählungen, um Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu laden.

Kombinieren Sie in einem 1,5-Milliliter-Fuge-Röhrchen das erforderliche Volumen der Spermiensuspension mit ausreichend einer millimolaren Grippe oh 3:00 AM Stammlösung, um eine Endkonzentration von zwei mikromolaren Grippe oh 3:00 AM zu erhalten, inkubieren Sie es für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und schützen Sie es vor Licht, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 750 G für fünf Minuten. Die Bildung einer Wolke anstelle eines Pellets zeigt an, dass die Zellen in gutem Zustand sind, den Überstand aspirieren und verwerfen und das Pellet in dem entsprechenden Volumen von menschlichem Spermienmedium oder HSM resuspendieren. Um dieses Experiment zu beginnen, kombinieren Sie in einem Glasröhrchen mit flachem Boden 570 Mikroliter HSM und 30 Mikroliter Samenzellsuspension, die zuvor um 3:00 Uhr morgens mit Grippe beladen und in HSM resuspendiert wurden, um einmal 10 bis 10 Achtelzellen pro Milliliter zu erhalten.

Setzen Sie einen magnetischen Rührstab in das Glasrohr ein und führen Sie das Röhrchen in die auf 37 Grad Celsius vorgeheizte Lesekammer des Spektometers ein. Die Probe muss während der gesamten Erfassungszeit gerührt werden. Starten Sie das Experiment mit der oli-Software und erfassen Sie Fluoreszenzwerte bei einer Frequenz von 0,5 Hertz während 300 Sekunden.

Nachdem Sie 30 Sekunden lang Basalfluoreszenz erfasst haben, injizieren Sie mit einer Hamilton Micro-Spritze das entsprechende Volumen der Testverbindung, in diesem Fall für mikromolares Progesteron, nach 100 Sekunden. Bei 20 Mikromolaren Ionen Mycin als Positivkontrolle, um den maximalen Fluoreszenzwert zu erhalten. In diesem Experiment werden intrazelluläre Kalziumveränderungen mit hoher zeitlicher Auflösung gemessen.

Füllen Sie mit einem SFM 20 gestoppten Durchflussmischer, der mit einem optischen System für tollwütige Kinetik gekoppelt ist, eine der Instrumentenspritzen mit einem Milliliter Grippe. 3:00 Uhr beladen Sie Samenzellen und die zweite Spritze mit einem Milliliter der zu testenden Verbindung. 20 mikromolare Progesteron, gelöst in HSM.

In diesem Beispiel ist es entscheidend, Blasenbildung beim Ansaugen der Flüssigkeiten in die Spritzen zu vermeiden. Heben Sie beide Instrumentenkolben an, bis sie die Spitze der Spritzenkolben berühren. Stellen Sie in diesem Fall die Gesamtabtastzeit auf 50 Sekunden und die Frequenz auf 10 Millisekunden ein, um Zellschäden zu minimieren, und stellen Sie die Flussrate auf den minimalen Wert ein, der einen messbaren Reaktionsauslöser liefert.

Das Mischen der Reagenzien, die Spur von Rohfluoreszenz versus Thymian wird auf dem Computerbildschirm angezeigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang: Ersetzen Sie das Progesteron durch HSM als Negativkontrolle und 10 Mikromolionen Mycin als Positivkontrolle vor der Durchflusszytometrie. Bereiten Sie die Versuchsproben vor, indem Sie 500 Mikroliter Zellsuspension pro Zytometerröhrchen unter jede zu testende Bedingung geben.

Richten Sie ein Experiment mit der Gerätesoftware ein. Erstellen Sie zunächst einen neuen Ordner, eine neue Versuchsprobe und eine neue Anzahl von Röhrchen. Wählen Sie dann die entsprechenden Zytometereinstellungen für Grippe O 3:00 AM. Verwenden Sie die Fluorescein-Isothiocyanat- und Propidiumiodid-Filter.

Führen Sie die unverfärbten Kontrollröhrchen eins und zwei in das Zytometer. Sammeln Sie Vorwärts- und Seitenstreudaten, um zu überprüfen, ob die Schwellenwerteinstellungen angemessen sind, und um das entsprechende Gate zu erstellen, um Schmutz von Zellen zu unterscheiden. Führen Sie die Versuchsröhren aus und sammeln Sie Fluoreszenzdaten von 10.000 Ereignissen pro Probe.

am Ende. Exportieren Sie alle Daten in die Software, die für die Analyse zur Verfügung steht. Bereiten Sie runde Deckgläser vor, die für dieses Verfahren benötigt werden, indem Sie einen Tropfen Poly-L-Lysinlösung von fünf Mikrolitern auf die Mitte jedes Deckglases auftragen.

Vor Gebrauch mindestens eine Stunde einwirken lassen, den behandelten Bereich mit Wasser abspülen. Dadurch wird überschüssiges Polylysin entfernt und die Spermien können sich an dem Deckglas von ihrem Kopf anhaften, während sich ihre Geißeln noch bewegen können. Montieren Sie den Deckglas in der Aufnahmekammer.

Platzieren Sie 10 Mikroliter Grippe oh 3:00 Uhr beladene Zellen in einer Konzentration von eins mal 10 bis den siebten Zellen pro Milliliter. In der Mitte des Deckglases. Decken Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem HSM ab.

Stellen Sie die Kammer auf den auf 37 Grad Celsius vorgeheizten Tisch des Mikroskops und betrachten Sie die Zellen mit Hilfe des Phasenkontrasts. Wählen Sie einen Bereich aus, in dem die Zelldichte für die Bildgebung geeignet ist. Zu viele Zellen erschweren die Analyse aufgrund überlappender Signale.

Die Zellen sollten mit dem Kopf fest mit dem Deckglas verbunden sein, zeigen aber eine Flagellenbewegung, die die Lebensfähigkeit bestätigt. Starten Sie das Experiment, indem Sie die Zeitreihenbilderfassungssoftware aktivieren. In der Regel werden vier Bilder pro Sekunde mit einer Beleuchtung von zwei Millisekunden pro Bild benötigt.

Erfassen Sie Fluoreszenzbilder im Live-Modus. So passen Sie den Fokus und die Helligkeit an. In diesem Fall fügen Sie mit einer Mikropipette vorsichtig tropfenweise die Testverbindung Progesteron hinzu und setzen Sie die Bildaufnahme nach Bedarf fort.

Es werden zwei aufeinanderfolgende Kontrollzugaben in dieselbe Kammer durchgeführt: 20 mikromolare Ionen Mycin, um eine maximale Fluoreszenz zu erzielen, und fünf Millimolare Manganchloride, um eine minimale Fluoreszenz zu erzielen. Führen Sie die Bildanalyse offline mit der IQ-Software durch.

Zeichnen Sie die Interessenbereiche oder ROIs um jede Zelle oder jeden Teil einer Zelle. Wählen Sie zusätzlich einen zellenfreien Bereich für die automatische Hintergrundsubtraktion durch die Software aus. Für jeden ROI wird dann eine Zeitfluoreszenzintensitätsreihe erhalten, und diese Daten können zur weiteren Analyse nach Microsoft Excel exportiert werden.

Progesteron ist einer der bekannten Akrosomreaktionsinduktoren und provoziert erwartungsgemäß einen vorübergehenden intrazellulären Anstieg der Kalziumkonzentration in menschlichen Spermien, gemessen mit konventioneller Fluorometrie. Die rote Fluoreszenzspur über die Zeit zeigt intrazelluläre Calciumkonzentrationsänderungen, die durch die Zugabe von vier mikromolaren Progesteronen als Negativkontroll-HSM verursacht wurden, was zu keiner Änderung der intrazellulären Calciumkonzentration führte, wie durch die blaue Fluoreszenzspur als Positivkontrolle angezeigt. Die durch 10 Mikromolare Ionen Mycin induzierte Veränderung wird für jede Spur angezeigt.

Die Zugabe dieses Calcium-Ionophors bewirkt den maximalen Anstieg der zellulären Calciumkonzentration in der RA, der nicht auf das Basalniveau zurückkehrt. Dieses Balkendiagramm zeigte die durchschnittliche Änderung des Fluoreszenzdeltas F von jeder Bedingung plus oder minus Standardfehler, wobei N gleich drei ist und das Sternchen einen P-Wert von weniger als 0,001 im Vergleich zur Kontrolle anzeigt. Der Progesteron-induzierte intrazelluläre Calciumkonzentrationsanstieg wurde mit größerer zeitlicher Auflösung durch Stopp-Flow-Fluorometrie gemessen und hier sind repräsentative Ergebnisse dargestellt.

Panel A sind Rohspuren zu sehen, wobei sowohl Progesteron, dargestellt durch die rote Linie, als auch Ionenmycin, dargestellt durch die blaue Linie, einen raschen intrazellulären Anstieg der Kalziumkonzentration verursachten. Die grüne Spur ist die Negativkontrolle, bei der Zellen mit HSM gemischt wurden. Panel B zeigt korrigierte Kurven für die mit Progesteron oder Ionenmycin induzierten Signale, die durch Subtraktion des Steuersignals von den entsprechenden Rohsignalen erhalten wurden.

Progesteron verursachte einen sehr schnellen und vorübergehenden intrazellulären Anstieg der Kalziumkonzentration, wobei ein maximaler Fluoreszenzwert 2,7 Sekunden nach Zugabe des Induktors auftrat. Auf der anderen Seite verursachte CIN einen schnellen und anhaltenden intrazellulären Anstieg der Kalziumkonzentration über 50 Sekunden. Der Einschub in Feld B zeigt eine erweiterte Ansicht der ersten 500 Millisekunden für jede Antwort.

Das Fehlen einer Verzögerung des durch Progesteron induzierten intrazellulären Anstiegs der Kalziumkonzentration stimmt mit früheren Berichten überein, die darauf hindeuten, dass Progesteron den Kalziumkanal-Katzensporn direkt aktiviert, ohne eine intermediäre Signalgebung. Die intrazelluläre Kalziumkonzentration wurde auch in kapazitiven und nicht kapazitiven menschlichen Spermien mittels Durchflusszytometrie gemessen. In diesen repräsentativen Vorwärts- und Seitenstreudiagrammen.

Kapazitierte Zellen sind blau und nicht kapazitive Zellen rot. Das ausgewählte Gate ist mit der blauen Linie gekennzeichnet und es wurden nur die Zellen innerhalb dieses Bereichs für die weitere Analyse verwendet. Panel B zeigt das Fluoreszenzhistogramm im Fitzy-Kanal von Unstained, Spermatozoa, und Panel D zeigt das Fluoreszenzhistogramm im FZ-Kanal von grippe oh 3:00 AM gefärbten Spermien, wie es in Panel D beobachtet wurde.Die Verteilung der Fluoreszenzwerte für kapazitive Spermien, dargestellt durch die blaue Spur, ist im Vergleich zu nicht kapazitiven Spermien, dargestellt durch die rote Spur, zu höheren Werten verschoben.

Panel C zeigt das Fluoreszenzhistogramm im PI-Kanal von ungefärbten Zellen und Panel E zeigt das Fluoreszenzhistogramm im PI-Kanal von toten Zellen. Die Fluoreszenzwerte für jede einzelne Zelle können in den hier gezeigten zweidimensionalen Fluoreszenz-Punktdiagrammen beobachtet werden. Bei ungefärbten Zellen und Zellen, die doppelt mit Grippe oh 3:00 AM und pi gefärbt wurden, wird der Prozentsatz der in jedem Quadranten aufgezeichneten Zellen durch die rote Zahl angegeben.

Wichtig ist, dass das Signal, das von abgestorbenen Zellen ausgeht, eliminiert werden kann. Schließlich wurde die Progesteron-induzierte intrazelluläre Calciumkonzentrationsänderung in einzelnen Spermien gemessen, indem diese repräsentativen Pseudofarbenbilder Zellen zu Beginn und nach Zugabe von Progesteron, CIN und Manganchlorid sichtbar gemacht wurden. Die Zugabe von Progesteron bewirkt eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration, sowohl im Spermienkopf als auch im Lum-Manganchlorid wird verwendet, um die Grippe zu verringern.

Oh 3:00 AM Fluoreszenz durch Quenchen, repräsentative normalisierte Fluoreszenzspuren von neun einzelnen Zellen aus dem Experiment sind in dieser Abbildung dargestellt. Wie in Populationsexperimenten beobachtet, zeigte die Einzelzellanalyse einen vorübergehenden bzw. einen anhaltenden Anstieg von Progesteron bzw. Ionenmycin. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen und die entsprechenden Kontrollen nach diesem Verfahren durchzuführen. Andere Methoden, wie z.B. Elektrophysiologie, könnten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung spezifischer Ionenkanäle, die an der Kalziumerhöhung beteiligt sind, unter Verwendung von Lösungen und Simulationsprotokollen nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zellphysiologie den Weg, die Kalziumdynamik in lebenden Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die am besten geeignete Technik zur Messung des intrazellulären Kalziumanstiegs mittels Fluoreszenz-dy in jedem Zelltyp auswählen, abhängig von der spezifischen Frage, die Sie beantworten möchten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Siemen-Proben gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Spendern nachweislich gesund sind. Die Verwendung von Latexkugeln während des Eingriffs und die ordnungsgemäße Entsorgung der Lösung und der Materialien sollten während der Durchführung dieses Eingriffs immer erfolgen.