Mess-intrazellulären Ca

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, intrazelluläre Kalziumschwankungen in menschlichen Spermien mit fluoreszierenden Farbstoffen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Spermienprobe nach der Swim-up-Methode vorbereitet und gegebenenfalls die Kapazitation induziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Spermien mit einem kalziumempfindlichen fluoreszierenden Farbstoff zu beladen.

Danach das Experiment unter Verwendung der herkömmlichen Fluorometrie, der gestoppten Fluss-Fluorometrie, der Durchflusszytometrie oder der Einzelzell-Bildgebung durchführen und die Kalziummessungen aufzeichnen. Abschließend werden die Ergebnisse analysiert, um Änderungen in den intrazellulären Kalziumkonzentrationen zu bestimmen, die durch Progesteron oder während des Kapazitierungsprozesses ausgelöst werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise solchen, die Radioaktivität verwenden, liegt darin, dass sie ein äußerst empfindliches Verfahren darstellt.

Es ist sicher und einfach durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der SPR-Calcium-Signalgebung zu beantworten, wie beispielsweise die Identifizierung von Substanzen, die einen Anstieg des intrazellulären Calciums mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung hervorrufen, sowie die Identifizierung unterschiedlicher zellulärer Teilpopulationen in einer siemen Probe. Die Anwendung beispielsweise der Durchflusszytometrie hat Implikationen für die Diagnose von Fruchtbarkeitsstörungen durch die Analyse des physiologischen Zustands männlicher Gameten.

Auch wenn diese Methode Einblicke in die Untersuchung der Kalziummobilisierung menschlicher Spermien ermöglichen kann, ist sie ebenso auf andere Zelltypen anwendbar, beispielsweise auf männliche Gameten anderer Arten oder verschiedene Zelltypen wie Neuronen oder Muskelzellen. Im Allgemeinen werden Personen, die diese Methode anwenden, Schwierigkeiten haben, da das Handling von Spermien nicht einfach ist und es wichtig ist, während des gesamten Experiments geeignete Bedingungen aufrechtzuerhalten, um lebensfähige und bewegliche Zellen zu erhalten. Wir haben die Anwendung dieser Techniken durch die Kombination von Strategien aus verschiedenen Fachgebieten realisiert.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Probenvorbereitung und -handhabung sowie die Zugabe der Verbindungen schwer zu erlernen sind, da Spermienzellen während des Verfahrens beschädigt werden können und Artefakte in den Reaktionen während der Zugabe der Verbindungen entstehen könnten. Um die Spermienprobe vorzubereiten, muss vorsichtig ein Milliliter Hams F 10 Medium auf jedes 500 Mikroliter flüssige Ejakulat aufgeschichtet werden. Eloqua, berühren Sie die Wand des Röhrchens mit der Spitze der Mikropipette und geben Sie das Medium sanft über der Probe ab.

Es ist entscheidend, dies langsam durchzuführen, um eine Vermischung der Probenschicht und der Mediumschicht zu vermeiden. Das Medium wird mit zwei Millimolar Calciumchlorid und fünf Milligramm pro Milliliter BSA ergänzt. Um die Kapazitation in vitro zu fördern, stellen Sie die Röhrchen vorsichtig in einem Winkel von etwa 30 Grad schräg.

Dadurch wird die Oberfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten vergrößert, wodurch die Verlagerung oder das Aufschwimmen von Spermienzellen aus der Probe in das Medium während der Inkubation verbessert wird. Als Nächstes stellen Sie die schrägen Reagenzgläser in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. 95 % Luft für eine Stunde nach einer Stunde.

Entfernen Sie mit einer Mikropipette vorsichtig aus jedem Reagenzglas die oberen 700 Mikroliter des Hams F 10 Mediums, das nun bewegliche Spermatozoen enthält. Sammeln Sie alle gesammelten Proben in einem einzigen sauberen Glasröhrchen und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Geben Sie 10 Mikroliter der gepoolten Probe auf das optische Flachglas der Basis einer Makulazählkammer und setzen Sie das Deckglas auf.

Stellen Sie sicher, dass keine Blasenbildung innerhalb der Kammer erfolgt, da dies zu einer ungenauen Zellzählung führen würde. Beobachten Sie unter einem zusammengesetzten Mikroskop, das mit einem 20×-Objektiv ausgestattet ist. Das Deckglas der makulären Zählkammer weist ein großes Quadrat auf, das aus 100 kleineren Quadraten besteht.

Zählen Sie die Zellen in einem beliebigen Streifen aus 10 Quadraten. Diese Zahl entspricht der Zellkonzentration in Millionen Zellen pro Milliliter. Wiederholen Sie die Zählung in zwei weiteren Streifen mit jeweils 10 Quadraten und berechnen Sie den Mittelwert der drei Zählungen, um Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff zu beladen.

Vermischen Sie in einem 1,5-Milliliter-Fugegefäß das erforderliche Volumen der Spermensuspension mit ausreichend eingesetzt ein Millimolar flu oh 3:00 AM-Stammlösung, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolar flu oh 3:00 AM zu erreichen. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, geschützt vor Licht. Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 750 ×g für fünf Minuten. Die Bildung einer Trübung anstelle eines Pellets weist darauf hin, dass sich die Zellen in gutem Zustand befinden. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in dem entsprechenden Volumen an humaner Spermienmedium oder HSM. Um dieses Experiment zu beginnen, geben Sie in ein flachbodiges Glasgefäß 570 Mikroliter HSM und 30 Mikroliter der zuvor mit flu oh 3:00 AM beladenen und in HSM resuspendierten Spermienzellsuspension, um eine Konzentration von 1 × 10⁸ Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Geben Sie einen magnetischen Rührstab in das Glasrohr und führen Sie das Rohr in die auf 37 Grad Celsius vorgewärmte Messkammer des Spektrometers ein. Die Probe muss während der gesamten Messdauer gerührt werden. Starten Sie das Experiment mit der Oli-Software und nehmen Sie Fluoreszenzwerte mit einer Frequenz von 0,5 Hertz über einen Zeitraum von 300 Sekunden auf.

Nachdem 30 Sekunden lang die Basalfluoreszenz aufgezeichnet wurde, injizieren Sie mit einer Hamilton-Mikrospritze das entsprechende Volumen der Testverbindung, in diesem Fall Mikromolar-Progesteron, bei 100 Sekunden. Bei 20 Mikromolar Ionomycin als positiver Kontrolle wird der maximale Fluoreszenzwert ermittelt. In diesem Experiment werden intrazelluläre Kalziumänderungen mit hoher zeitlicher Auflösung gemessen.

Unter Verwendung eines mit einem optischen System für schnelle Kinetik gekoppelten SFM-20-Stopp-Fluss-Mischers füllen Sie eine der Instrumentenspritzen mit einem Milliliter flu. 3:00 AM beladenen Spermienzellen und die zweite Spritze mit einem Milliliter der zu testenden Verbindung. 20 Mikromolar Progesteron, gelöst in HSM.

In diesem Beispiel ist es entscheidend, die Bildung von Blasen beim Ansaugen der Flüssigkeiten in die Spritzen zu vermeiden. Heben Sie beide Kolben der Instrumente an, bis sie die Spitze der Spritzenkolben berühren. Stellen Sie in diesem Fall die gesamte Probennahmezeit auf 50 Sekunden und die Frequenz auf 10 Millisekunden ein, um Zellschäden zu minimieren, und stellen Sie die Flussrate auf den niedrigsten Wert ein, der einen messbaren Antwortreiz liefert.

Die Mischung der Reagenzien sowie die Rohfluoreszenz in Abhängigkeit von Thymus wird auf dem Computerschirm angezeigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wobei Progesteron durch HSM als negativen Kontrollansatz und 10 Mikromolar Ionomycin als positiven Kontrollansatz vor der Durchflusszytometrie ersetzt wird. Bereiten Sie die experimentellen Proben vor, indem Sie je 500 Mikroliter Zellsuspension pro Durchflusszytometrie-Röhrchen unter jeder zu testenden Bedingung ansetzen.

Richten Sie ein Experiment mithilfe der Gerätesoftware ein. Erstellen Sie zunächst einen neuen Ordner, eine Experimentprobe und die Anzahl der Röhrchen. Wählen Sie dann die geeigneten Zytometer-Einstellungen für flu O 3:00 AM. Verwenden Sie die Fluoresceinisothiocyanat- und Propidiumiodid-Filter.

Führen Sie die unbehandelten Kontrollröhren eins und zwei im Cytometer durch. Sammeln Sie Vorwärts- und Seitenstreudaten, um zu überprüfen, ob die Schwellenwertschwellen geeignet sind, und erstellen Sie das entsprechende Gate, um Trümmer von Zellen zu unterscheiden. Führen Sie die experimentellen Röhrchen durch und sammeln Sie Fluoreszenzdaten von 10.000 Ereignissen pro Probe.

Am Ende. Exportieren Sie alle Daten in die zur Verfügung stehende Software zur Analyse. Bereiten Sie die für diesen Vorgang benötigten runden Deckgläser vor, indem Sie einen Tropfen von fünf Mikroliter Poly-L-Lysin-Lösung in die Mitte jedes Deckglases geben.

Mindestens eine Stunde ruhen lassen, vor der Verwendung den behandelten Bereich mit Wasser spülen. Dadurch wird überschüssiges Polylysin entfernt und die Spermienzellen können mit ihrem Kopf an der Deckglasoberfläche haften, während ihre Geißeln weiterhin beweglich bleiben. Das Deckglas im Aufnahmekammer montieren.

Geben Sie 10 Mikroliter flu oh 3:00 AM beladener Zellen mit einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter in die Mitte der Deckglasoberfläche. Bedecken Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern vorher erwärmtem HSM.

Platzieren Sie die Kammer auf der auf 37 Grad Celsius vorgewärmten Mikroskopbühne und betrachten Sie die Zellen im Phasenkontrast. Wählen Sie einen Bereich aus, in dem die Zelldichte für die Bildgebung geeignet ist. Eine zu hohe Zelldichte erschwert die Analyse aufgrund überlappender Signale.

Die Zellen sollten mit dem Kopf fest am Deckglas haften, aber bewegliche Geißeln aufweisen, was ihre Vitalität bestätigt. Starten Sie das Experiment, indem Sie die Software für die zeitaufgelöste Bildaufnahme aktivieren. Typischerweise werden vier Bilder pro Sekunde bei einer Belichtungszeit von zwei Millisekunden pro Bild benötigt.

Fluoreszenzbilder im Live-Modus aufnehmen. Um die Fokussierung und Helligkeit einzustellen. Mit einer Mikropipette vorsichtig tropfenweise die Testverbindung Progesteron, in diesem Fall, hinzufügen und die Bildaufnahme nach Bedarf fortsetzen.

Führen Sie zwei sequenzielle Kontrollzugaben in dieselbe Kammer durch: 20 Mikromolar Ionomycin zur Erzielung maximaler Fluoreszenz und fünf Millimolar Manganchlorid zur Erzielung minimaler Fluoreszenz. Führen Sie die Bildanalyse offline mit der IQ-Software durch.

Zeichnen Sie die interessierenden Bereiche oder ROIs um jede Zelle oder einen Teil einer Zelle. Wählen Sie zusätzlich einen zellfreien Bereich zur automatischen Hintergrundsubtraktion durch die Software aus. Anschließend wird für jeden ROI eine zeitliche Fluoreszenzintensitätsreihe erstellt, und diese Daten können zur weiteren Analyse in Microsoft Excel exportiert werden.

Progesteron ist einer der bekannten Induktoren der Akrosomreaktion und führt, wie erwartet, zu einem vorübergehenden Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in menschlichen Spermien, gemessen mittels herkömmlicher Fluorometrie. Die rote Fluoreszenzspur über die Zeit zeigt die durch die Zugabe von vier Mikromolar Progesteron hervorgerufenen Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration. Als negativer Kontrolle wurde HSM zugegeben, was keine Änderung der intrazellulären Kalziumkonzentration bewirkte, wie durch die blaue Fluoreszenzspur angezeigt wird. Als positive Kontrolle ist die durch 10 Mikromolar Ionomycin hervorgerufene Änderung für jede Spur dargestellt.

Die Zugabe dieses Calcium-Ionophors führt zu einer maximalen Erhöhung der zellulären Calciumkonzentration in RA, die nicht auf den Ausgangswert zurückkehrt. Dieses Balkendiagramm zeigt die durchschnittliche Änderung der Fluoreszenz delta F für jede Bedingung, angegeben als Mittelwert ± Standardfehler, wobei N gleich drei ist und der Stern einen P-Wert von weniger als 0,001 im Vergleich zur Kontrolle angibt. Die durch Progesteron induzierte Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration wurde mit höherer zeitlicher Auflösung mittels Stopped-Flow-Fluorometrie gemessen, und hier sind repräsentative Ergebnisse dargestellt.

Die Rohsignale sind im Panel A dargestellt; sowohl Progesteron, gekennzeichnet durch die rote Linie, als auch Ionomycin, gekennzeichnet durch die blaue Linie, führten zu einem schnellen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Die grüne Kurve zeigt die Negativkontrolle, bei der die Zellen mit HSM gemischt wurden. Panel B zeigt korrigierte Signale für die durch Progesteron oder Ionomycin hervorgerufenen Reaktionen, die durch Subtraktion des Kontrollsignals von den entsprechenden Rohsignalen erhalten wurden.

Progesteron verursachte einen sehr schnellen und vorübergehenden Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration mit einem maximalen Fluoreszenzwert 2,7 Sekunden nach Zugabe des Induktors. CIN hingegen verursachte einen schnellen und anhaltenden Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration über einen Zeitraum von 50 Sekunden. Die Einlage in Panel B zeigt eine vergrößerte Ansicht der ersten 500 Millisekunden jeder Antwort.

Das Fehlen einer Verzögerung bei der progesteroninduzierten Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration stimmt mit früheren Berichten überein, die darauf hindeuten, dass Progesteron den Kalziumkanal CatSper direkt ohne Zwischensignalübertragung aktiviert. Die intrazelluläre Kalziumkonzentration wurde ebenfalls in kapazitierten und nicht kapazitierten menschlichen Spermien mittels Durchflusszytometrie gemessen. In diesen repräsentativen Vorwärts- und Seitenstreuungsdiagrammen.

Kapazitierte Zellen sind blau dargestellt und nicht kapazitierte Zellen rot. Das ausgewählte Gate ist mit der blauen Linie gekennzeichnet, und nur die Zellen innerhalb dieses Bereichs wurden für die weitere Analyse verwendet. Abbildung B zeigt das Fluoreszenz-Histogramm im Fitzy-Kanal von unbehandelten Spermatozoen, und Abbildung D zeigt das Fluoreszenz-Histogramm im FZ-Kanal von mit flu oh 3:00 AM gefärbten Spermatozoen, wie in Abbildung D zu sehen ist. Die Verteilung der Fluoreszenzwerte für kapazitierte Spermien, dargestellt durch die blaue Kurve, ist im Vergleich zu nicht kapazitierten Spermien, dargestellt durch die rote Kurve, zu höheren Werten verschoben.

Abbildung C zeigt das Fluoreszenz-Histogramm im PI-Kanal von unbehandelten Zellen, und Abbildung E zeigt das Fluoreszenz-Histogramm im PI-Kanal von toten Zellen. Die Fluoreszenzwerte einzelner Zellen können in den hier dargestellten zweidimensionalen Fluoreszenz-Punktdiagrammen beobachtet werden. Für unbehandelte Zellen und Zellen, die doppelt mit Fluoh 3:00 AM und PI gefärbt wurden, ist der Prozentsatz der in jedem Quadranten erfassten Zellen durch die rote Zahl angegeben.

Wichtig ist, dass das Signal, das von toten Zellen stammt, eliminiert werden kann. Schließlich wurde die durch Progesteron induzierte Änderung der intrazellulären Kalziumkonzentration in einzelnen Spermienzellen gemessen, indem diese repräsentativen Pseudofarbbilder aufgezeichnet wurden, die Zellen zu Beginn und nach der Zugabe von Progesteron, CIN und Mangan(II)-chlorid zeigen. Die Zugabe von Progesteron führt zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration, sowohl im Spermienkopf als auch im Schwanz; Mangan(II)-chlorid wird verwendet, um die Fluoreszenz zu verringern.

Um 3:00 Uhr morgens zeigt diese Abbildung die durch Quenching repräsentativen, normalisierten Fluoreszenzverläufe von neun einzelnen Zellen aus dem Experiment. Wie in Populationsexperimenten beobachtet, zeigte die Einzelzellanalyse einen transienten Anstieg für Progesteron bzw. einen anhaltenden Anstieg für Ionomycin. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Vitalität der Zellen zu überprüfen und die geeigneten Kontrollen nach diesem Protokoll durchzuführen. Weitere Methoden wie die Elektrophysiologie könnten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung spezifischer Ionenkanäle, die an den Calciumanstiegen beteiligt sind, unter Verwendung geeigneter Lösungen und Simulationsprotokolle nach der Entwicklung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Zellphysiologie den Weg, um Calciumdynamiken in lebenden Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die am besten geeignete Technik zur Messung von intrazellulären Kalziumanstiegen unter Verwendung fluoreszierender Farbstoffe in jeder Zellart auswählen können, abhängig von der spezifischen Fragestellung, die Sie beantworten möchten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Spermaproben gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Spendern mit nachgewiesener Gesundheit erforderlich sind. Die Verwendung von Latexhandschuhen während des Verfahrens sowie die ordnungsgemäße Entsorgung von Lösungen und Materialien sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.