Name: Mess-intrazellulären Ca 2 + Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Lernen Sie die Messung intrazellulärer Calciumschwankungen in menschlichen Spermien mit vier Fluoreszenztechniken. Diese sensitiven Methoden ermöglichen die Analyse von Kapazitation und Progesteron-Effekten.

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Die Autoren danken Jose Luis De la Vega, Erika Melchy und Dr. Takuya Nishigaki für technische Unterstützung. Dirección General de Asuntos del Persönliche Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 CT); Diese Arbeit wurde vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Mexiko) (99333 und 128566 zu CT) unterstützt.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Intrazelluläre Signalwege ist von entscheidender Bedeutung für die meisten zellulären Aktivitäten; Ca 2 + ist ein allgegenwärtiges Bote, Säugerzellen begleitet während ihrer gesamten Lebensdauer, von ihrem Ursprung bei der Befruchtung, bis zum Ende ihres Lebenszyklus. In Reaktion auf verschiedene Stimuli, [Ca 2 +] i zunimmt, schwingt und nimmt mit raumzeitliche Codierung, dementsprechend, diverse Prozesse aktiviert, moduliert oder terminiert durch Ca 2 +-codierten Nachrichten. Intrazellu...

Ca 2 + ist ein universelles second messenger von Signaltransduktionswegen in eukaryotischen Zellen. Intrazelluläre Ca 2 + (Ca 2 + i) ist an der Regulation vieler grundlegenden physiologischen Prozesse in beide erregbaren und nicht erregbaren Zellen. Die Bedeutung und die Universalität der Ca 2 + als second messenger während Signaltransduktion von seiner räumlich-zeitlichen Vielseitigkeit bei der Übertragung von Informationen in der Zelle ab. Während Ca 2 + nicht de novo oder abgebaut innerhalb der Zelle, dessen intrazelluläre Konzentration ([Ca2 +] i) synthetisiert werden soll, in sehr engen Grenzen durch unterschiedliche zelluläre Mechanismen, die kontinuierlich Puffer, absondern, zu unterteilen, und / beibehalten oder akkumulieren Ca 2 +. Änderungen in der Konzentration dieses Ions in stark lokalisierten Bereichen innerhalb der Zelle 1 auf, und die Entschlüsselung solcher Schwankungen ist wichtig für die Gewinnung eines deeper Verständnis von (1) ihre Rolle in der Signal-Mechanismus, (2) ihre physiologische Bedeutung, und (3) allgemeine Mechanismen der Zell-Signalisierung. Ca 2 +-vermittelte Signalisierung von besonderer Bedeutung ist in Spermien Physiologie 2. Beweglichkeit der Spermien ist eine der wichtigsten Funktionen für die Befruchtung erfolgreich, und in der Tat, mehrere Spermien-Motilität Defekte können Sterilität 3-5 führen. Die Bedeutung von Ca 2 + in Flagella Bewegung ist seit langem anerkannt 6, jedoch ist der Mechanismus, wie Ca 2 + steuert die spezifische Form Flagella Biegung ist nicht vollständig verstanden. Vor der Fusion mit dem Ei, müssen Spermien durchlaufen capacitation, ein komplexer Prozess, abhängig von Spermien Wohnsitz innerhalb der weiblichen Trakt. Während capacitation werden die Spermien Membran Lipid Architektur und Organisation geändert, vor allem als Folge von Cholesterin Entnahme aus der Plasmamembran. Darüber hinaus sind mehrere Proteine ​​Tyrosin-Phosphorlierte 7. Wichtig ist, dass während capacitation gibt es eine Zunahme des intrazellulären pH (pH i) und von [Ca 2 +] i, und das Membranpotential hyperpolarisiert in einigen Arten 2. Kapazitation erfolgt nur in einer Subpopulation von Spermien (20-40%), und die Mechanismen in all diesen zellulären Veränderungen beteiligt sind alles andere als klar. Es ist allgemein anerkannt, dass nur eine Subpopulation von kapazitierten Spermien die Akrosomreaktion (AR) zu unterziehen, wenn sie physiologische Induktoren ausgesetzt. Die AR ist auch ein Ca 2 +-regulierten Ereignis für die Befruchtung in allen Arten besitzen ein Akrosom (spezialisierte Organellen mit äußeren und inneren Membranen) erforderlich. Dabei werden die äußeren akrosomalen Membran verschmilzt mit der Spermien Plasmamembran, Freisetzung hydrolytischer Enzyme, die die Samenzelle, die Glyco-Protein-Matrix um das Ei (zona pellucida oder ZP) eindringen können. Die AR macht auch eine neue fusogene Samenzelle Oberfläche, die mit interagiertdas Ei Plasmamembran für die endgültige Verschmelzung beider Keimzellen. Es gibt mehrere zelluläre Liganden darstellt, die AR, Progesteron eine der darunter untersucht induzieren. In dieser Arbeit haben wir vier verschiedene Techniken, bei denen die Verwendung eines Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff zu messen präsentieren [Ca 2 +] i Veränderungen in menschlichen Spermien durch Progesteron ausgelöst (außer für die Durchflusszytometrie, in denen wir messen die [Ca 2 + ] i erhöhen induziert während der in vitro Kapazitation-Prozess). In diesem speziellen Fall haben wir Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), ein membranpermeablen Farbstoff mit einem K d = 325 nM. In vitro wir überwacht Fluoreszenz ändert sich als Funktion der Zeit mit drei der Methoden, und die vierte Technik wir gemessenen Fluoreszenz-Werte bei einem gegebenen Zeitpunkt. Diese unterschiedlichen Ansätze einander ergänzen, da sie insgesamt räumlicher und zeitlicher Auflösung liefernolution sowohl an der einzelnen Zelle und Zell-Population Ebenen. Handy Bevölkerung oder Bulk-Experimente Masse Techniken werden ausführlich nicht nur, weil die Instrumente, die sie benötigen leicht verfügbar sind, sondern auch, weil sie einfach, gut etabliert sind und damit für die Mittelung der Daten aus Messungen an Millionen von Zellen in einem einzigen Experiment durchgeführt werden. Technik # 1. Konventionelle Fluorometrie Diese Technik überwacht Änderungen in der Fluoreszenz als Funktion der Zeit; die Experimente in Glasküvetten mit Probenvolumina im Bereich von 200 bis 1000 ul durchgeführt. Das Mischen des zugegebenen Reagenzien erfordert Magnetrührstab und damit die zeitliche Auflösung erhalten wird, in der Größenordnung von Sekunden. Die typische Zelle Konzentrationsbereich der untersuchten Proben 10 5 bis 10 8 Zellen / ml. Technik # 2. Gestoppt Flußfluorometrie Tseine Technik überwacht auch Veränderungen in der Fluoreszenz als eine Funktion der Zeit, aber die Reagenzien schnell zusammen (durch Druck) in eine Aufnahme Küvette mit einem sehr kleinen Probenvolumen (im Bereich von 25 bis 100 ul) gemischt. Daher ist Homogenisierung Reagenzien unmittelbar, so dass eine hohe zeitliche Auflösung in der Größenordnung von Millisekunden. Analyse der resultierenden Fluoreszenz-Zeit-Spuren sind geeignet für die Bestimmung Reaktionsgeschwindigkeiten, die Aufklärung der Komplexität des Reaktionsmechanismus, Beschaffung von Informationen über kurzlebige Zwischenprodukte der Reaktion usw. Die gemeinsame Zelle Konzentrationsbereich der analysierten Proben ist 10 5 -10 7 Zellen / ml. Single Cell Experimente Masse Experimente den Durchschnittswert Verhalten einer großen Anzahl von Zellen, aber eine Population kann häufig eine heterogene einzustellen, die bei dieser Art von Messungen übersehen werden. Einzel-Zell-Techniken werden verwendet, um damit th ergänzene Informationen mit Zellpopulation Experimenten erhalten. Technik # 3. Durchflusszytometrie Trotz der Bedeutung der Informationen, die aus einzelnen Zellen Messungen ist es wichtig, eine große Anzahl von Zellen zu analysieren, um die fehlerhafte Extrapolation von Zell-spezifischen Eigenschaften auf eine gesamte Bevölkerung zu verhindern. Aus diesem Grund sind High-Throughput-Techniken begünstigt und die beliebteste Methode ist die Durchflusszytometrie, in denen 10.000 Zellen pro Zustand konventionell analysiert. Dieses Verfahren ermöglicht die multi-parametrische Analyse heterogener Bevölkerungen, wie es Zellen kategorisiert nach ihrer Größe (Vorwärtsstreuung (FSC)), Granularität (side scatter (SSC)) und die Fluoreszenzintensität (spezifische Markierung mit einem Antikörper, der Lebensfähigkeit Marker, etc.) , damit die Informationen über die Parameter &#39;verteilung für eine Gruppe von Zellen. Durchflusszytometrie bietet sofortigen anstatt zeitabhängige Informationen 8. Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht Werte are auch hilfreich bei der Auswahl ein Tor, das Zellen enthält, aber unterscheidet Zelltrümmer, Staub usw. für Fluoreszenzmessungen, negative und positive Kontrollen Fluoreszenz ebenfalls aufzunehmen. Wenn mehr als ein Fluoreszenz-Kanal verwendet wird, muss ein Prozess als Entschädigung bekannt sind, durchgeführt (Details siehe werden <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Compensation ermöglicht spektrale Überlappung Diskriminierung unter Fluorophore. Durchflusszytometrie ermöglicht Diskriminierung von toten Zellen, im allgemeinen mittels Propidiumiodid-Färbung. Technik # 4. Single Cell Imaging Mikroskopie ist eine weitere häufige Methode, um einzelne Zelle Verhalten zu studieren, es ist gut für zeitabhängige Studien geeignet und es bietet auch die räumliche Auflösung. Ein großer Nachteil ist, dass High-Throughput-Analyse nur in den Kinderschuhen steckt in der heutigen Zeit <sbis&gt; 9.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat ca. 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Makler Zählkammer</td><td>SEFI Medical Insruments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 Fläschchen/50 &mu; g je</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Alomon</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Reagenzien für humanes Spermienmedium (HSM)</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)</td></tr><tr><td>Calciumchlorid wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Reagenzien für menschliches Sperma Medium (HSM)</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Reagenzien für humanes Spermienmedium (HSM)</td></tr><tr><td>Natrium-L-lactat (ca. 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-7022</td><td>Reagenzien für humanes Spermienmedium (HSM)</td></tr><tr><td>Propidiumiodid </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Komponente B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td>2,4 mM Lösung in Wasser </td></tr><tr><td>Rundes Deckglas </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>25 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Manganchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; Zellkammer, für Mikroskopie</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

mess-intrazellulären ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen spermien mit vier techniken: konventionelle fluorometrie, stopped flußfluorometrie, durchflusszytometrie und single cell imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermien sind männliche Keimzellen speziell entwickelt, um zu erreichen, zu erkennen und verschmelzen mit dem Ei. Um diese Aufgaben zu erfüllen, müssen Spermien bereit, eine sich ständig wandelnden Umfeld zu stellen und mehrere physische Barrieren überwunden werden. Sein Wesen in transkriptionell und translational still, verlassen sich diese bewegliche Zellen zutiefst auf verschiedenen Signal-Mechanismen, sich zu orientieren und schwimmen in einer gerichteten Weise und mit schwierigen Umgebungsbedingungen während ihrer Reise, um das Ei zu finden kämpfen. Insbesondere ist Ca 2 +-vermittelten Signale entscheidend für mehrere Spermien Funktionen: Aktivierung der Motilität, capacitation (ein komplexer Prozess, die Spermien für die Akrosomreaktion bereitet) und der Akrosomreaktion (ein Ereignis, das exozytotische Spermien-Ei-Fusion ermöglicht). Der Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, um intrazelluläre Schwankungen dieses Ions zu verfolgen ist von bemerkenswerter Bedeutung aufgrund ihrer einfachen Anwendung, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit detection. Mit einem einzigen Farbstoff-loading-Protokoll nutzen wir vier verschiedene Techniken, um Spermien fluorometrische Ca 2 + Dynamik überwachen. Jede Technik liefert verschiedene Informationen, die räumliche und / oder zeitliche Auflösung ermöglicht, die Erzeugung von Daten sowohl auf einzelne Zelle und Zellpopulation Ebenen.

<img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Protokolls für die Spermien Probenvorbereitung von der Swim-up-Methode. Die wichtigsten Schritte für die Trennung der beweglichen Spermien und zur Anpassung ihrer Konzentration dargestellt. Der letzte Schritt der Inkubation wird nur durchgeführt, wenn capacita...

Intrazelluläre Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamik sind sehr wichtig in Spermien Physiologie und Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Fluoreszenzfarbstoffe bilden ein vielseitiges Werkzeug, um sie zu studieren. Bevölkerung Experimente (Fluorometrie und gestoppt Flußfluorometrie) und einzelne Zelle Experimente (Durchflusszytometrie und Single-Cell-Imaging) verwendet werden, um räumlich-zeitliche [Ca verfolgen<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Veränderungen im menschlichen Spermien.

Mess-intrazellulären Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, intrazelluläre Kalziumschwankungen in menschlichen Spermien mit fluoreszierenden Farbstoffen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Spermienprobe nach der Swim-up-Methode vorbereitet und gegebenenfalls die Kapazitation induziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Spermien mit einem kalziumempfindlichen fluoreszierenden Farbstoff zu beladen. Danach das Experiment unter Verwendung der herkömmlichen Fluorometrie, der gestoppten Fluss-Fluorometrie, der Durchflusszytometrie oder der Einzelzell-Bildgebung durchführen und die Kalziummessungen aufzeichnen. Abschließend werden die Ergebnisse analysiert, um Änderungen in den intrazellulären Kalziumkonzentrationen zu bestimmen, die durch Progesteron oder während des Kapazitierungsprozesses ausgelöst werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise solchen, die Radioaktivität verwenden, liegt darin, dass sie ein äußerst empfindliches Verfahren darstellt.Es ist sicher und einfach durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der SPR-Calcium-Signalgebung zu beantworten, wie beispielsweise die Identifizierun

measuring-intracellular-ca2-changes-human-sperm-using-four-techniques

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Calcium ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Signalwegen beteiligt sind. Live Cell Imaging erfordert spezielle Geräte und kann zeitaufwendig sein. Eine schnelle, einfache Methode mit einem Durchflusszytometer, um relative Veränderungen in zytosolischen Kalzium in adhärenten Epithelzellen in Suspension gebracht bestimmen optimiert.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

Derzeit werden die meisten verfügbaren Kalziumindikatoren verwendet, um zytoplasmatische Kalziumtransienten als indirekte Maße für das aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzte Kalzium in kultivierten glatten Muskelzellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines spezifischen FRET-basierten Indikators, der die direkte Messung von Calciumsignalen innerhalb des sarkoplasmatischen Retikulumlumens ermöglicht.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Spermatozoan Membran Integrität, eine zelluläre Funktion verbunden mit Sperma Befruchtung Kompetenz zu bewerten. Wir beschreiben drei Techniken für die fluorimetrischen Beurteilung der Spermien Membranen: gleichzeitige Färbung mit spezifischen fluoreszierende Sonden, Fluoreszenz-Mikroskopie und erweiterte Spermien gewidmet Durchflusszytometrie. Beispiele für die Kombination der Methoden werden ebenfalls vorgestellt.

Fluorimetrischen Techniken für die Beurteilung der Spermien Membranen

Hier, zwei mittleren Durchsatz-Assays für die Bewertung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliche Spermien werden beschrieben. Diese Tests können verwendet werden, um schnell und einfach große Mengen von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca2 +Bildschirm-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma.

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Dieses Protokoll beschreibt, wie elektrische Aufzeichnungen von Säugetierspermien in einer Ganzzellkonfiguration durchgeführt werden, mit dem Ziel, die Aktivität der Ionenkanäle direkt aufzuzeichnen. Die Methode hat maßgeblich dazu beigetragen, die elektrophysiologischen Profile mehrerer Ionenkanäle der Spermien zu beschreiben und ihre molekulare Identität und Regulation aufzudecken.

Aufzeichnung elektrischer Ströme durch die Plasmamembran von Säugetiersamenzellen

Das vorliegende Protokoll bietet eine praktische Lösung, die die Messung von Apoptose, mitochondrialem Membranpotenzial und DNA-Schäden in menschlichen Spermien mit einem einzigen Zytometer ermöglicht.

Durchflusszytometrische Analyse von Biomarkern zum Nachweis von Funktionsdefekten menschlicher Spermien

Das hier beschriebene AcroSensE-Mausmodell und die hier beschriebenen Live-Cell-Imaging-Methoden bieten einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Kalziumdynamik im subzellulären Kompartiment des Spermienakrosoms und wie sie Zwischenschritte regulieren, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.

Echtzeit-Bildgebung der akrosomalen Kalziumdynamik und Exozytose in lebenden Mäusespermien

In diesem Artikel wird eine Methode zur quantitativen Echtzeitüberwachung der Calciumionenkonzentration (Ca2+) in Zellen unter Verwendung von Einzelzell-Ca2+ -Bildgebung mit dem Fura-2/AM-Farbstoff vorgestellt. Diese Technik ermöglicht eine effiziente Farbstoffbeladung und eine genaue Berechnung des Ca2+ -Gehalts durch Fluoreszenzintensitätsverhältnisse, was sie zu einem einfachen und schnellen Ansatz für Forschungsanwendungen macht.

Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

Eine effiziente Methode, um hochreine lebensfähig meiotischen Fraktionen aus Maus Hoden zu erhalten, ist beschrieben, die vereint ein raffiniertes Zelle Dissoziation Protokoll mit fluoreszierenden activated cell sorting (FACS). Diese Methode nutzt die Unterschiede in der DNA-Gehalt und nukleare Dichte der diskreten meiotischen Fraktionen.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

Lernen Sie die Messung intrazellulärer Calciumschwankungen in menschlichen Spermien mit vier Fluoreszenztechniken. Diese sensitiven Methoden ermöglichen die Analyse von Kapazitation und Progesteron-Effekten.

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