Name: Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Vorläufer-B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut mittels Dichtegradientenzentrifugation, magnetischer Depletion und Durchflusszytometrie. Diese Methode liefert hochwertige Nukleinsäuren für downstream-Analysen.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) unterstützt, um KT

Ein. Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut <ol><li> Planen EDTA-Puffer PBS-5 ml Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung zu 95 ml Spülpuffer (1:20 Verdünnung). Degas der Puffer und halten Sie die Puffer auf Eis. WICHTIG: Failure zu entgasen kann der Puffer in weniger als optimale Ergebnisse führen bei der Isolierung von CD19 + B-Zellen, weil Blasen können die Isolation Spalte zu blockieren. </li><li> Planen 50 ml konischen Röhrchen für Dichtegradientenzentrifugation. Bestimmen Sie die Anzahl von Rohren für die Verarbeitung der Nabelschnurblut benötigt (1 Rohr 8 ml Blut verarbeiten) und 15 ml Ficoll-Paque PLUS in jedes Röhrchen. </li><li> 8 ml von Nabelschnurblut mit 24 ml DPBS (1X) und sorgfältig Schicht das verwässerte Nabelschnurblut Mischung auf der Oberseite des Ficoll-Paque PLUS in jedem der 50 ml konischen Röhrchen. Mischen Sie nicht das Blut und Ficoll-Paque PLUS. WICHTIG: Zur Vermeidung von Vermischung der Nabelschnurblut und Ficoll-Paque PLUS, halten den Schlauch in einem 45 Grad-Winkel undSchicht die Blut-Gemisch langsam. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 40 min bei 20 ° C. Mononukleäre Zellen (MNC) werden zu verbleiben die Plasma-Ficoll-Paque PLUS Schnittstelle Erwägung Granulozyten und Erythrozyten sedimentieren aufgrund höherer Dichte an der osmotische Druck von Ficoll-Paque PLUS. Label sieben 5 ml Rundboden-Röhrchen, die in Teil 3 mit dem Proben-ID, Datum und wie folgt verwendet werden: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tube </td><td> Etikett </td><td> Zweck </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Unbefleckt </td><td> Ungefärbte Zellen zur Normalisierung während der Durchflusszytometrie </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> Um Lebensfähigkeit während der Durchflusszytometrie bestimmt </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> Enthält die Zellen, die sortiert werden </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> Um CD34 + / CD19 sammeln +(Ende Pro-B - frühe Pre-BI-Zellen) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 45 niedriger </td><td> / CD19 + / CD45 niedrig (pre-BI)-Zellen - zu CD34 sammeln </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 med </td><td> / CD19 + / CD45 med (pre-BII) Zellen - Um CD34 sammeln </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 45 hoch </td><td> / CD19 + / CD45 hoch (unreifen B-Zellen) - Um CD34 sammeln </td></tr></tbody></table> Coat Rohre 4, 5, 6 und 7 mit 2% FBS und legen Sie alle Röhrchen auf Eis. <ol start="5"><li> Saugen Sie die obere Plasmaschicht vorsichtig und vermeiden Sie Kontakt mit der mononukleären Zellschicht. Mit einem 10 ml Glas-Pipette vorsichtig die mononukleären Zellschicht auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Vereinen die mononukleären Zellen aus drei Rohren in einem einzigen 50-ml-Röhrchen. </li><li> Das Rohr wird mit PBS, vorsichtig mischen und bei 300 × g zentrifugiert 10 min bei20 ° C. Saugen Sie vorsichtig den Überstand ohne den Zellpellet. Wiederholen 1x. Nach dem ersten Waschen, resuspendieren Pellets und Transfer zu einem einzigen 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Gently Zellpellet in 200 ul PBS. Entfernen 1 ul der Zellsuspension, fügen Sie es zu 1 ml PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und beiseite stellen für die Zählung (Anzahl Zellen nach dem Aufsetzen des 50 ml Zellsuspension in der Zentrifuge). Das Rohr wird mit PBS und Zentrifugieren bei 200 xg für 15 min, um Blutplättchen zu entfernen. Entfernen Sie den Überstand vollständig ohne die Zellpellet. </li></ol> 2. Geändert B-Zell-Isolierung von mononukleären Zellen mittels MACS-Separation <ol><li> Das Pellet aus Schritt 1,7 mit 160 ul kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer. </li><li> Fügen Sie 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail. Pipettieren gut mischen und inkubieren für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Zellen - 1 ml kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer pro 10 Millionen Zellen (Zell-number in Schritt 1.7) ermittelt und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min. Überstand komplett und dann das Zellpellet in 320 ul kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer. </li><li> Fügen Sie 80 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln, gut mischen und inkubieren für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Zellen - 1 ml kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer pro 10 Millionen Zellen und bei 300 g zentrifugiert für 10 min. Resuspendieren bis zu 100 Millionen Zellen in 500 &amp;mgr; l kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer. Maßstab Puffervolumen nach Zellzahl. </li><li> Bereiten MACS Säulen und MACS Separatoren während der Zentrifugation (Schritt 2,5). Ein LS Spalte im Magnetfeld der MACS Separator, 3 ml kaltem (4 ° C) PBS-EDTA-Puffer auf die Säule gegeben und der Puffer durch die Säule tropfen. Verwenden Sie ein Gefäß, um den Durchfluss durch fangen. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Legen Sie eine 50 ml konischen Röhrchen unter der Spalte und Pipette die Zellsuspension auf die Säule. Lassen Sie die unmarkierte Zellen throug tropfth der Säule und in der 50 ml konischen Röhrchen. WICHTIG: Dies sind die Zellen, die für die Antikörper-Kennzeichnung und Zellsortierung verwendet werden. Nicht wegwerfen durchfließen. Um mit der Zellen aus Schritt 2.5 erholen, eine zusätzliche 1 ml kaltem (4 ° C) PBS-Puffer-EDTA zu den Wänden des konischen Rohrs. Vorsichtig mischen und pipettieren das restliche Zellsuspension auf die Säule. Wiederholen 1x. Verfahren bis 2,8 Schritt unter Verwendung der unmarkierten Zellen in der konischen Rohr nach Passieren der Kolonne gesammelt. </li><li> Füllen Sie das konische Röhrchen mit unmarkierten Zellen mit PBS und bei 300 g zentrifugiert für 10 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne den Zellpellet. Fügen Sie 200 ul EDTA-PBS-Puffer und sanft die Zellen resuspendieren. </li></ol> 3. Antibody Labeling und Vorbereitung für die Cell Sorting <ol><li> Absaugen 1 ul der Zellsuspension und Ort in das Rohr mit der Aufschrift &quot;ungefärbt&quot; (Schritt 1,4). Fügen Sie 500 ul EDTA-PBS-Puffer und speichern Sie die Röhrchen auf Eis. </li><li> Hinzufügen 20ul jeder Antikörper (CD19, CD34 und CD45) pro Millionen Zellen in den verbleibenden Zellsuspension. Gut mischen und legen Sie die Röhrchen im Dunkeln für 30 min bei RT. CD-Antikörper sind lichtempfindlich, Schritte 2-4 mit die Lichter ausgeschaltet. </li><li> Nach 30 min Inkubation mit Antikörpern, absaugen 40 ul der Zellsuspension und legen Sie sie in das Rohr mit der Aufschrift &quot;7AAD&quot;. 1 ml PBS in die Röhre und Zentrifuge bei 500 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 100 ul Bindungspuffer. Hinzufügen 7 ul 7AAD (7-Aminoactinomycin D) und inkubieren im Dunkeln für 10 min bei RT. Während der 10-minütigen Inkubation komplette Schritt 3,4. </li><li> Hinzufügen PBS auf dem oberen Ende des Rohres mit den verbleibenden Zellen mit CD-Antikörper markiert ist. Zentrifugieren bei 500 xg für 3 min. Entfernen Sie den Überstand, 500 ul EDTA-PBS-Puffer und das Zellpellet. Übertragen das gesamte Volumen der Zellsuspension in das Rohr mit einem &quot;+ + +&quot;. Um alle der Zellsuspension einer erholendd zusätzlich 1 ml EDTA-PBS Puffer zu der 50 ml konischen Röhrchen und Transfer in das Rohr mit einem &quot;+ + +&quot;. </li><li> Nach der Inkubation (Schritt 3,3), fügen Sie 300 ul Bindungspuffer in 7AAD Röhre. Die &quot;ungefärbt&quot;, &quot;7AAD&quot; und &quot;+ + +&quot;-Proben und die &quot;34 +&quot;, &quot;45 low&quot;, &quot;45 med&quot; und &quot;45 hoch&quot; Röhren sind bereit für die Durchflusszytometrie. </li></ol> 4. Cell Sorting Mit dem MoFlo XDP Durchflusszytometer <ol><li> Set-up MoFlo für die Sortierung: Richten Laser; stabilisieren Tröpfchenstroms; bestimmen Drop Verzögerung. </li><li> Bereiten einzigen Farbkompensation Kontrollen mit Invitrogen AbC Maus bead Kit (oder ähnlich) nach den Anweisungen des Herstellers. Führen einzigen Farbe steuert, Einstellen der Spannungen von Fluoreszenz-Kanäle für eine optimale Trennung von positiven und negativen Populationen. Set Kompensationskoeffizienten und gelten ausgeglichen Parameter collection Protokoll. Wiederherstellung der Kompensationskoeffizienten bei jeder neuen Menge von Antikörper erhalten wird. </li><li> Neues Protokoll einschließlich Grundstücke wie in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Führen ungefärbten Probe eingestellt Spannung und Gewinn für Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht und identifizieren negativen Fluoreszenz-Populationen. Da DNA-Gewinnung ist das Ziel von der Art, sollte die Schwelle niedrig eingestellt (≤ 1%), so dass DNA-haltigen Ablagerungen verunreinigt nicht die wiederhergestellten Proben. * Stellen Sie sicher, dass die Aerosol Evacuation System ist zu allen Zeiten die menschliche Zellen sind auf dem MoFlo laufen leben läuft. </li><li> Führen Sie einen kleinen Aliquot der + + + Probe (~ 50.000 Veranstaltungen), um die Gating-Strategie (Abbildung 2). Da B-Vorläuferzellen nicht streuen identisch mit B-Zellen reifen, Backgate die ungated CD19 + / CD34 +-Population auf den SSC vs FSC Grundstück, um sicherzustellen, die Lymphozyten-Gate potenzielle Pro-B-Zellen. Aus dieser Probe auch den negativen Fluoreszenz Bevölkerung 7AAD. </li><li> Führen Sie das 7AAD Probe zu Probe Lebensfähigkeit zu bestimmen. Einzige Art von Zellen aus einer Probe mit hoher Lebensfähigkeit bei derBeginn (≥ 95%) als tote Zellen werden wahllos Flecken und kann sort Populationen verunreinigen. </li><li> Richten Sie sort Entscheidungen vier Populationen zu sammeln: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 niedrig; CD19 + / CD34 - / CD45 med und CD19 + / CD34 - / CD45 hoch. Fügen Sie die Lymphozyten und Wams Diskriminierung Tore in den sort Entscheidungen aller Bevölkerungsgruppen. </li><li> Um Verstopfungen in der Sortieranlage Spitze zu vermeiden, Filter + + + Probe durch eine 40 um Zellsieb unmittelbar vor Sortier-und re-Filter, wenn eine Aggregation auftritt Probe während sort. </li><li> Sortieren der Zellen in Sammelröhrchen (Schritt 1.4) mit 2% FBS in PBS in einem gekühlten oder Eis gepackten Rohrhalters beschichtet. </li><li> Unmittelbar nach Art abgeschlossen ist, extrahieren DNA. </li></ol>

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</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Faktor mit dem größten Einfluss auf den Erfolg des Protokolls ist die Anwesenheit von kontaminierenden Verunreinigungen. Wenn Blut von einem anfordernden Nabelschnurblutbank ist es wichtig, dass das Blut versendet sobald nach der Entnahme wie möglich. Darüber hinaus enthalten Proben, die als Lymphozytose klassifiziert sind höhere Anzahl von Lymphozyten, aber diese Proben nicht über ausreichende Zahl von Vorläufer-B-Zellen und sollten nicht verwendet werden. Um die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens ausreichende Anzahl von Zellen für jeden der Vorläufer Teilmengen empfiehlt beginnend mit mindestens 85 ml Nabelschnurblut erhöhen. Es ist wichtig zu beachten, dass im Gegensatz zu erwachsenen peripheren Blut Trennungen, wenn Fraktionieren Nabelschnurblut mononukleäre die Schicht oft mit roten Blutzellen 12 kontaminiert. Dieses Protokoll enthält eine zusätzliche Waschschritt zu verunreinigen Thrombozyten zu entfernen. Protokolle beschreiben mononukleären Trennungen aus Nabelschnurblut schlagen einschließlich einer Lyseschritt to Entfernen unerwünschter roten Blutkörperchen. Wir empfehlen nicht diesen Schritt, weil es verunreinigt Schutt produziert und hat einen negativen Einfluss auf den Erfolg der Zelle sort. Um die Anzahl der Zellen, die durch Flusszytometrie unterschieden werden müssen reduzieren, ist es notwendig, eine B-Zell-Anreicherung vor Zellsortierung durchzuführen. Das Protokoll, das von Miltenyi Biotec, die den B-Zell-Isolation Kit (B-CLL) begleitet, vorgesehen ist für peripheren Blut optimiert und empfiehlt die Verwendung von 10 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail pro 10 Millionen Zellen. Dieser Schritt verwendet Antikörper gegen CD2 (T-Zellen; NK-Zellen), CD4 (T-Zellen), CD11b (Granulozyten; Monozyten; Makrophagen), CD16 (NK-Zellen; Makrophagen; Mastzellen), CD36 (Thrombozyten), CD235a (erythroide Zellen) Nicht-B-Zellen aus dem Nabelschnurblut erschöpfen. Es ist wichtig, um den Bausatz beschrieben und nicht die B-Zell-Isolierungs-Kit II zu verwenden, weil der frühere Kit enthält einen Antikörper gegen CD43, die am vorliegenden Pro-B-Zellen ist. Während unserer opmierung des Protokolls, fanden wir, dass insgesamt 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail ausreicht, um eine positive Zelle Sortierungsergebnis erzeugen. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass mit so wenig wie 5 ul mehrere der B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail negativen Auswirkungen auf die Zellen sortiert. Daher empfehlen wir mit 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail für insgesamt mononukleären Zellen Zahlen zwischen 175 bis 250.000.000. Wenn ausgehend von niedrigeren oder höheren Anzahl von Zellen kann es erforderlich sein, um die Reagenzien entsprechend skalieren. Es gibt zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die kollidierenden Marker, die verwendet werden, um zu unterscheiden Subpopulationen von B-Zellen kann. Die meisten der Diskrepanz kann durch die Tatsache, dass die Differenzierung ein kontinuierlicher Prozess ist und dass das Vorhandensein oder Fehlen von Zelloberflächenmarkern tritt in allmählicher Weise anstatt in einer alles oder nichts Weise erläutert. In diesem Protokoll CD34 - / CD19 + und die Intensitätsstufe der CD45 + (niedrig, mittel, hoch) wurde verwendet, um die Expression Pre-BI, BII pre-und unreife B-Zellen, die mit einer Erhöhung der Höhe der CD45-Expression, die dem Fortschreiten der Differenzierung 6 unterscheiden. Pro-B-Zellen wurden von einigen beschrieben worden CD19 sein + / CD34 + 13, während andere haben gezeigt, dass Pro-B-Zellen CD19 sind - / CD34 + und Pre-BI-Zellen sind CD19 + / CD34 + 9,10. Basierend auf dieser Diskrepanzen haben wir die CD19 + / CD34 +-Zellen so spät Pro-B-Zellen / frühen Pre-BI-Zellen bezeichnet. Es ist wichtig anzumerken, dass diese Strategie entwickelt wurde, um Untergruppen von Vorläufer-B-Zellen, die zu den Zellen von der Krankheit betroffen akuter lymphatischer Leukämie entsprechen isolieren. Es gibt jedoch mehrere Sortieranlagen Strategien, die eingesetzt je nach Zellentyp Subtyp von Interesse sein kann. Antikörper-Fluorochrom Kombinationen sollte basierend auf den Fähigkeiten des Zellsorters ausgewählt werden. Als Gattungenl Regel der hellste Fluorochrom in Ihrem Panel sollte verwendet werden, um die am wenigsten bevölkerten Antigen und vice versa zu kennzeichnen. In Erkennen Doppel-gefärbten Populationen, insbesondere seltene Ereignisse wie diese, ist Dublett Diskriminierung (2B) ein ganz wichtiger Teil der Gating-Strategie. Dadurch wird sichergestellt, dass die Doppel-positiven Ereignisse sind wirklich einzelne Zellen mit beiden Antikörpern und nicht nur zwei Einzel-gefärbten Zellen eingehalten miteinander gefärbt. Hohe Geschwindigkeit, 4-Wege-cell sorting zwangsläufig schafft eine kontrollierte Aerosol Umwelt. Daher sollte lebenden menschlichen Zellsortierung mit großer Sorgfalt durchgeführt werden. Veröffentlicht Sicherheit und Dekontamination Richtlinien sind verfügbar und sollten überprüft und vor der Sortierung 14 umgesetzt werden. Genehmigung von Institutional Biosafety Ausschüsse oder deren Äquivalente können vor der Sortierung erforderlich. Für eine ordnungsgemäße Dekontamination nach dem Sortieren sollte Bleichmittel zum Abfallbehälter zu einer Endkonzentration von 10% zugesetzt werden. Similarly, sollten alle Proben Schlauch sowie alle Flächen in der unmittelbaren Umgebung gründlich mit einem frisch zubereiteten 10% Bleichlösung dekontaminiert werden. Zusammengefasst stellt das Protokoll eine Strategie zum Erhalt seltener Populationen von Vorläufer B-Zellen und kann modifiziert werden, um jegliche seltenen Population in Nabelschnurblut einschließlich hämatopoetischen Stammzellen und unreifen T-Zellen zu isolieren. Kürzlich wurden unreife B-Zellen im peripheren Blut von Patienten mit fortgeschrittener HIV 15 identifiziert. Daher erstreckt sich die Nützlichkeit dieser Methode jenseits der Studie von Blutkrebs. Schließlich haben wir noch nicht RNA Isolationen auf die Fließeigenschaften sortierten Zellen durchgeführt, aber diese Methode sollte anpassungsfähig sein, mit dem Vorbehalt, dass während Zellsortierung die Zellen direkt sollte in Trizol oder einer gleichwertigen RNA kompatible Lösung wie RLT sortiert werden aus dem RNeasy Kit verfügbar über Qiagen.

Um Aberrationen, die in Krankheit zu identifizieren, ist es äußerst wichtig, dass wir gesunde Gewebe oder Zellen, die Gewebe oder Zelltyp von der Krankheit betroffen entsprechen verwenden. Ein Grund dafür ist, dass epigenetische Variation unter Gewebetypen verantwortlich ist für die Regulation der Genexpression und ist entscheidend für die Zelldifferenzierung während der normalen menschlichen Entwicklung 1,2. Ein zweiter Grund ist, dass aberrante gewebespezifischen Genregulation kann fatale Folgen auf normale Entwicklung haben und ist dafür bekannt, zu einer Vielzahl von Krankheitszuständen wie Krebs beitragen. Daher erfordert ein besseres Verständnis einer Krankheit, die hämatopoietische Zellen umfasst Kenntnisse gesunden hämatopoetischen Zellen. Die Entwicklung von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark verläuft durch systematische Abfolge von Ereignissen durch Veränderungen in der Expression von Zelloberflächen dadurch Marker 3. Studien mit erwachsenen Teilnehmergezeigt, dass Knochenmark enthält gewöhnlich eine geringe Anzahl von Vorläufer-B-Zellen 4,5; Erwägung pädiatrischen Studien mit Teilnehmern haben gezeigt, dass der Anteil der Vorläufer-B-Zellen in relativ hoher Individuen weniger als 5 Jahren 6 ist. Nabelschnurblut wurde als Quelle von hämatopoetischen Stammzellen zur Behandlung von Blut-verwandten Erkrankungen und malignen Erkrankungen verwendet werden, ist leicht erhältlich über Nabelschnurblutbanken und ist für unreifen B-Zellen und T 7, die die Zielzellen mehrerer Störungen, einschließlich Leukämie und sind angereichert Lymphome. Vorläufer-B-Zellen im Knochenmark wurden ausgiebig 8,9 phänotypisiert und kann durch die Anwesenheit von spezifischen Zelloberflächen-Marker, die verwendet werden, diese Zellen in verschiedene Teilmengen sortiert werden können definiert werden. Normale B-Zell-Differenzierung verläuft über eine Reihe von Stufen im Knochenmark beginnend mit den frühesten Pro-B-Zellen und ihren Höhepunkt in unreifen oder naive B-Zellen. Nachvan Zelm und Kollegen 10 sind Pro-B-Zellen durch die Anwesenheit von CD34 und im Übergangsbereich zu Stufe 2 (Pre-BI) CD19 erfasst ist. Stage 3 (Pre-BII) Zellen nicht mehr CD34 und beginnen zu zytoplasmatische IgM auszudrücken. Schließlich ist ein bestimmendes Merkmal der Stufe 4 (unreifen B-Zellen) die Expression von Oberflächen-IgM. Die Sortiervorrichtung Strategie in diesem Protokoll beschrieben wurde zuerst von Caldwell und Kollegen 6 beschrieben und umfasst die Verwendung von nur 3 Zelloberflächenmarker das reduziert die Komplexität und die Kosten des Durchführens Zellsortierung Experimenten. In ihrer Arbeit wurde eine Beziehung zwischen CD45 und die Stufen des B-Zell-Differenzierung etabliert. Sie beobachteten, dass B-Zellen im Knochenmark variablen Niveaus der Expression von CD45 zeigen. Insbesondere Zellen, die hohe Spiegel von CD45 exprimiert zu Zellen, die Oberflächen-IgM exprimiert (unreifen B-Zellen) entsprach, entsprachen denen, die ein mittleres Niveau der CD45 exprimiert, um Zellen zu cytopl exprimiertasmic IgM (pre-BII Zellen), und diejenigen, die geringe Mengen an CD45 exprimiert entsprach Zellen, die nicht exprimieren hat cytoplasmatischen IgM (Prä-BI-Zellen). Dieses Protokoll verwendet die Strategie von Caldwell und Kollegen entwickelt, um sechs Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut (Abbildung 1), die in nachgeschalteten Assays erfordern hochwertige Nukleinsäuren wie der methylierten CpG-Insel Rückgewinnung Assay verwendet werden kann (MIRA isolieren ) 11 und quantitative Echtzeit-PCR-Assays. Das Verfahren eine anfängliche Trennung unter Verwendung von Magnetkügelchen, alle nicht-B-Zellen aus Nabelschnurblut abzureichern und erfordert Färbung mit nur drei Antikörper (CD34, CD19 und CD45). Die Zellen, die gewonnen werden repräsentieren 4 Stufen von B-Zell-Differenzierung: 1) CD34 +; CD19 + (späten Pro-B und frühen Pre-BI), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 niedrig (späte pre-BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 med (pre-BII), und 4) CD34 -; CD19 +; CD45 hoch (unreifen B-Zellen).

<table><tbody><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>LS Säule</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multi Stand</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Separator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>B-Zell-Isolationskit (B CLL)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-660</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)</td><td>MIDSCI</td><td>SS1500</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>DB Pharmingen APC Maus Anti-Human-CD19</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555415</tr><tr><td>DB Pharmingen PE Maus Anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>560941</td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Spüllösung</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stammlösung</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 ml Polystyrol Rundbodenröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>PuraFlow Mantelflüssigkeit, 8X</td><td>Beckman Schar</td><td>CY30230</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck Ausrichtungsperlen</td><td>Beckman Schar</td><td>6605359</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Ausrichtungsperlen</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ViroSafe Aerosol-Evakuierungsfilter</td><td>Beckman Schar</td><td>ML01330</td><td></td></tr><tr><td>ABC Maus Perlen Set</td><td>Invitrogen</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Zell-Sieb</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Hämozytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Modell 3R Tischzentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-516</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol-Evakuierungseinheit</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von precursor b-zell-subsets aus nabelschnurblut

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Nabelschnurblut ist sehr für hämatopoetischen Vorläuferzellen in verschiedenen Linie Engagement Stufen bereichert. Wir haben ein Protokoll zur Isolierung Vorläufer-B-Zellen in vier verschiedenen Stadien der Differenzierung entwickelt. Da Gene exprimiert werden und epigenetische Modifikationen auftreten in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise ist es wichtig, zwischen Geweben und Zelltypen unterscheiden, um der Lage sein, Veränderungen im Genom und Epigenom, die zur Entwicklung der Krankheit führen, zu identifizieren. Dieses Verfahren kann auf jede Art von Zelle im vorliegenden Nabelschnurblut in jedem Stadium der Differenzierung angepasst werden. Dieses Verfahren umfasst 4 wichtigsten Schritte. Zuerst werden mononukleäre Zellen durch Dichtezentrifugation getrennt. Zweitens werden B-Zellen angereichert mit Biotin konjugierten Antikörper, erkennen und Entfernung von Nicht-B-Zellen aus den mononukleären Zellen. Drittens werden die B-Zellen werden mit fluoreszent Zelloberflächenprotein spezifische Antikörper markiert einzelnen Stufenvon B-Zell-Entwicklung. Schließlich werden die fluoreszenzmarkierten Zellen sortiert und einzelne Populationen werden zurückgewonnen. Die gewonnenen Zellen werden in ausreichender Menge und Qualität in nachgelagerten Nukleinsäureassays genutzt werden.

Zwischen Probe Variation spielt eine Rolle für den Erfolg der Zelle sort (Tabelle 1). Die Proben mit gutem Erfolg Raten haben niedrige verunreinigenden Ablagerungen (3A) und die Proben mit schlechter Erfolgsraten haben hohe verunreinigenden Ablagerungen (Abbildung 3B). Zwischen Probe Variation kann etwas gesteuert werden, wenn das Kabel Blutprobe in 24 hr des Versandes (O / N ersten Priorität) gesammelt wurde. Die Fließeigenschaften sortierten Zellen aus jeder Vorläufer-B-Zell-Untergruppe sind in ausreichender Menge und Qualität zur Nukleinsäure-Isolation führen. Die isolierte DNA ist von hoher Qualität und kann in nachfolgenden Analysen verwendet werden. Wir nutzen diesen routinemäßig DNA in 11 bis MIRA für methylierte DNA (Abbildung 4) anzureichern. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Cord Blood Facility Data </td><td> Schlechte Sortieren </td><td><strong&gt; Good Sortieren </td></tr><tr><td> Arbeiten Blood Volume mit Gerinnungshemmer (ml) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> White Blood Cells [10 3 / ul] </td><td> 8,68 </td><td> 11,19 </td></tr><tr><td> Lymphozyten [10 3 / ul] </td><td> 3,88 </td><td> 3,76 </td></tr><tr><td> Lymphozyten (%) </td><td> 44,70 </td><td> 33,6 </td></tr><tr><td> Red Blood Cells [10 6 / ul] </td><td> 3,65 </td><td> 3,05 </td></tr><tr><td colspan="3"> In-house-Daten </td></tr><tr><td> Cell Number nach Ficoll-Paque </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> Cell Number nach MACS Separation </td><td> 22 M </td><td> 16,5 M </td></tr><tr><td> Total Events Count (MoFlo XDP) </td><td> 30,57 M </td><td> 19,97 M </td></tr><tr><td> Lebensfähigkeit (%) </td><td> 98,00 </td><td> 98,00 </td></tr><tr><td> Zellen in Lymphozyten Gate (%) </td&gt; <td> 17,00 </td><td> 50,00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> Gesamtzellzahl </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> % Der insgesamt Events </td><td> 0,04 </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> Leistungsfähigkeit </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 niedriger </td></tr><tr><td> Gesamtzellzahl </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> % Der insgesamt Events </td><td> 0,05 </td><td> 0,13 </td></tr><tr><td> Leistungsfähigkeit </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 med </td></tr><tr><td> Gesamtzellzahl </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> % Der insgesamt Events </td><td> 1,54 </td><td> 2,54 </td></tr><tr><td> Leistungsfähigkeit </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 hohen </td></tr><tr><td> Gesamtzellzahl </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> % Der insgesamt Events </td><td> 6,2 </td><td> 10,25 </td></tr><tr><td> Leistungsfähigkeit </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Repräsentativen Zelle sort Statistiken. Zeilen 1-5 sind Zählungen durch das Nabelschnurblut Anlage vorgesehen. Die restlichen Zeilen sind die Daten in unserem Labor gesammelt. Die arme Art enthaltenen hohen Schutt und einen geringen Prozentsatz an Zellen in der Lymphozyten-Gate. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> FiguRE 1. Ablaufschema des Verfahrens. Nabelschnurblut verarbeitet und mononukleären Zellen isoliert mit Ficoll-paque plus. Ein zusätzlicher Waschschritt enthalten ist, um kontaminierende Thrombozyten zu entfernen. B-Zellen aus mononukleären Zellen mit dem MACS menschlichen B-Zell-Isolation Kit (B-CLL) isoliert. Dieser Schritt verwendet Biotin-konjugierten monoklonalen Antikörper (CD2, CD4, CD11b, CD36, Anti-IgE und CD235a), um alle nicht-B-Zellen zu entfernen. Die gewonnenen B-Zellen mit CD19-APC, CD34-PE und CD45-FITC Antikörper dann sortiert Verwendung des MoFlo XDP Durchflußzytometer zum Vorläufer-B-Zell-Untergruppen erholen gekennzeichnet: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 günstig , CD19 + / CD34 - / CD45 med und CD19 + / CD34 - / CD45 hoch. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> Abbildung 2. Gating Strategie zur Identifizierung und Sortierung populations. Rote Pfeile zeigen das Tor, um nachfolgende Diagramm angewendet wird. R4, R5, R6 und R7 Toren geben sortierten Populationen. A) Vorwärts vs Seite Streudiagramm zeigt angereicherten Lymphozyten-Population. R1, Lymphozyten Tor. B) Höhe vs Breite von vorn Streudiagramm zur Identifizierung einzelner Zellen im Vergleich zu Dubletten. R2, einzelne Zelle Tor. C) CD19-APC-positiven Zellen fallen in CD34-PE negativen und positiven Populationen. R3, CD19 + / CD34 - Tor; R4, CD19 + / CD34 +-Gate zeigt gewünschte Sortierung Bevölkerung d) CD19 + / CD34 - Zellen fallen in drei etwas unterschiedliche CD45-FITC Populationen.. R5 und R6, CD19 + / CD34 - / CD45 und CD19 niedrig + / CD34 - / CD45 med. Populationen sind. R7, wegen hoher Zellzahlen im CD19 + / CD34 - / CD45 hohe Population umfasst diese Art nur Gateein Teil der Bevölkerung. Alle Zellen dieser Population müssen nicht für Downstream-Analysen gesammelt werden. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> Abbildung 3. A) Niedrige Kontamination Trümmern nach Spalte Bereicherung. R1, Lymphozyten Tor. B) Hohe Kontamination Trümmern nach Spalte Bereicherung. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> Abbildung 4. Anreicherung von methylierter DNA von Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen. A) beschallt DNA aus Vorläufer-B-Zell-Untergruppen getrennt ist von hoher Qualität. Für DNA-Bibliothek-Konstruktion wird auf eine mittlere von 200-600 bp beschallt. Spur 1: Promega 100 bp Leiter (Katalog # G2101); Lane 2: Total DNA isoliert von CD19 + / CD34 +-Zellen, Spur 3: Gesamt-DNA aus CD19 isoliert + </sup&gt; / CD34 - / CD45 niedrige Zellen; Spur 4: 100 ng DNA aus CD19 + / CD34 isoliert - / CD45 med. Zellen; Spur 5: 100 ng DNA aus CD19 + / CD34 isoliert - / CD45 hohen Zellen. DNA wurde unter Verwendung des beschallt Diagenode Bioruptor on High für insgesamt 9 min (30 s EIN; 30 sec AUS). DNA wurde gereinigt und visualisiert auf einem 1% Agarosegel mit SYBR green Nukleinsäure Gelfärbemittels. B) Nach MIRA Verwendung des ActivMotif MethylCollector Ultra-Kit, PCR mit SLC25A37 (1-6) und APC1 (7-12) wird durchgeführt, um zu bestätigen Anreicherung von methylierter DNA. 1 &amp; 7: beschallt genomische DNA (keine MIRA), 2 &amp; 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA; 3 &amp; 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 geringen DNA; 4 &amp; 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med. DNA; 5 &amp; 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 hohen DNA; 6 &amp; 12: Water Kontrolle. Höhere Verstärkung SLC25A37 bestätigt die Anreicherung von methylierter DNAin den Untermengen von Vorläufer B-Zellen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut. Ein ausreichender Menge und Qualität von Nukleinsäuren können aus den Zellen extrahiert werden und in nachfolgenden Assays DNA oder RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Vorläufer-B-Zell-Subpopulationen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mononukleäre Zellen aus Nabelschnurblut durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. Im zweiten Schritt werden Oberflächenantigene der Zellen mit biotinylierten Antikörpern markiert, um magnetisch alle verbleibenden Nicht-B-Zellen auszuschließen.Anschließend werden die isolierten B-Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen die Oberflächenantigene CD 19, CD 34 und CD 45 markiert. Im letzten Schritt werden die Zellen mittels Durchflusszytometrie sortiert, um die Vorläufer-B-Zell-Subpopulationen zu gewinnen. Letztendlich können Zellen in ausreichender Anzahl und Qualität gewonnen werden, um sie in nachfolgenden Assays einzusetzen, die hochwertige DNA und RNA erfordern.Ein Vorteil der Zellsortierstrategie gegenüber alternativen Methoden besteht darin, dass unsere Strategie weniger Zeit am Durchflusszytometer erfordert und nur drei fluoreszierende Antikörper verwendet, wodurch die Kosten des Experiments stark reduziert werden. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, haben in der Regel Schwierigkeiten mit der Vielzahl verfügbarer Methoden zur Vorbereitung von Nabelschnurblutzellen für die Durchflusszytometrie sowie mit der Komplexität der Vorbereitung des Durchflusszytometers. Obwohl diese Methode Einblicke in gesunde präkursorische B-Zellen ermöglicht, kann sie auch auf andere im Nabelschnurblut vorhandene Zelltypen wie T-Zellen oder auf Studien von Erkrankungen, die hämatopoetische Zellen betreffen, wie Leukämie oder Lymphom, angewendet werden.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da es schwierig ist, die geeigneten Techniken zur Verarbeitung von Nabelschnurblut und -zellen so zu beschreiben, dass die Zellviabilität maximiert und das Vorhandensein von kontaminierendem Zelltrümmern minimiert wird. Um mononukleäre Zellen aus Nabelschnurblut zu isolieren, verdünnen Sie zunächst Aliquots von acht Milliliter Nabelschnurblut mit 24 Milliliter DPBS. Anschließend schichten Sie vorsichtig jede verdünnte Blutmischung auf 15 Milliliter ALI watts Ficoll Plus in 50-Milliliter-Konizflaschen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Schichten getrennt bleiben.Als Nächstes zentrifugieren Sie das Blut 40 Minuten lang bei 400 × g und 20 °C, während die Zellen durch Dichtegradienten in 75-mL-Rundbodentuben getrennt werden. Beschriften Sie die Röhrchen mit der Proben-ID, dem Datum und allen weiteren relevanten Angaben gemäß der Tabelle. Nach der Trennung verbleiben die mononukleären Zellen an der trüben Grenzfläche zwischen Plasma und Dichtegradient, während Granulozyten und Erythrozyten sedimentieren. Aspirieren Sie nun die oberen Plasmaschichten unter Vermeidung von Kontakt mit der Schicht der mononukleären Zellen. Sammeln Sie anschließend mit einer 10-mL-Glasspipette vorsichtig die Schicht der mononukleären Zellen aus drei der 50-mL-Röhrchen in einem einzelnen neuen 50-mL-Röhrchen.Füllen Sie dieses neue Röhrchen mit PBS, mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und waschen Sie die Zellen anschließend zwei Mal jeweils 10 Minuten bei 300 × g und 20 °C. Nach dem ersten Waschschritt resuspendieren Sie die Pellets und überführen Sie in ein einzelnes kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Nach dem zweiten Waschschritt resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 200 µL PBS und überführen Sie ein µL der Zellsuspension in 1 mL PBS in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zur Zellzählung.Waschen Sie die Zellen anschließend in dem 50-Milliliter-Röhrchen erneut mit zusätzlichem PBS und entfernen Sie vollständig das Überstand, ohne das Pellet zu stören. Um die B-Zellen von den mononukleären Zellen zu isolieren, resuspendieren Sie zunächst das gewaschene Pellet in 160 Mikrolitern frisch zubereiteter, vier Grad Celsius kalter DGA-sE-D-T-A-P-B-S-Pufferlösung.Danach 40 Mikroliter des B-Zell-Isolationskits, bio ITIN Antik&ouml;rpercocktail, mit der Zellsuspension mischen. Nach einer Inkubation der Zellen f&uuml;r 10 Minuten bei vier Grad Celsius den freien Antik&ouml;rper pro 10 Millionen Zellen mit einem Milliliter vier Grad Celsius kaltem E-D-T-A-P-B-S-Puffer abwaschen. Anschlie&szlig;end das Zellpellet in 320 Mikrolitern vier Grad Celsius kaltem E-D-T-A-P-B-S-Puffer resuspendieren.Nun 80 Mikroliter Anti-Biotin-Mikroperlen mit der Zellsuspension mischen, nachdem diese 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubiert wurde. Waschen Sie die Zellen erneut, während die Zellen zentrifugiert werden. Setzen Sie eine LS-Säule in das Magnetfeld eines Max-Separators und lassen Sie drei Milliliter EDTA-PBS-Puffer bei vier Grad Celsius durch die Säule tropfen.Suspenderen Sie anschließend bis zu 100 Millionen der gewaschenen Zellen in 500 Mikrolitern EDTA-PBS-Puffer bei vier Grad Celsius. Pipettieren Sie die Zellsuspension dann auf die Säule und sammeln Sie die nicht markierten Zellen, die durch die Säule fließen, in einem 50-Milliliter-Konischgefäß. Geben Sie zusätzlich zwei Milliliter EDTA-PBS-Puffer bei vier Grad Celsius in die Wand des ursprünglichen Konischgefäßes, jeweils einen Milliliter auf einmal, mischen Sie vorsichtig und pipettieren Sie die restliche Zellsuspension jedes Mal erneut auf die Säule, um sicherzustellen, dass alle Zellen gewonnen werden.Füllen Sie schließlich das kegelförmige Reagenzglas mit den nicht markierten Zellen mit PBS auf. Nach der Zentrifugation entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Suspendieren Sie die Zellen dann vorsichtig in 200 Mikroliter E-D-T-A-P-B-S-Puffer.Beginnen Sie die Antikörperfärbung. Überführen Sie zunächst ein Mikroliter der Zellsuspension in das zuvor beschriftete, ungefärbte Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter E-D-T-A-P-B-S-Puffer zum Röhrchen hinzu und lagern Sie es auf Eis.Schalten Sie alle Lichter aus und geben Sie anschließend je 20 Mikroliter der Antikörper gegen CD 19, CD 34 und CD 45 pro 1 Million Zellen in die verbleibende Zellsuspension. Gründlich mischen und das Röhrchen 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen lassen. Danach 40 Mikroliter der mit Antikörpern markierten Zellsuspension in die sieben mit A bis D beschrifteten Röhrchen überführen.Waschen Sie die Zellen in einem Milliliter PBS und resuspendieren Sie das Pellet anschließend in 100 Mikrolitern Bindungspuffer. Geben Sie sieben Mikroliter 7-AAD zu diesen Zellen und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln, während die Zellen mit 7-AAD markiert werden. Füllen Sie das Röhrchen mit den mit Antikörpern markierten Zellen mit PBS auf, waschen Sie die mit Antikörpern markierten Zellen und resuspendieren Sie das Pellet anschließend in 500 Mikrolitern EDTA-PBS-Puffer. Überführen Sie nun das gesamte Volumen der Suspension der mit Antikörpern markierten Zellen in das Röhrchen, das positiv für CD19, CD34 und CD45 markiert ist.Spülen Sie das Röhrchen mit einem zusätzlichen Milliliter E-D-T-A-P-B-S-Puffer und überführen Sie die restliche Zellsuspension in das mit CD 19 positiv CD 34 positiv CD 45 positiv markierte Röhrchen. Geben Sie abschließend 300 Mikroliter Bindungspuffer zu dem sieben A a D-Röhrchen, um die Zellen mittels des MO-Flow-XDP-Fluoreszenz-Aktivierter-Zell-Sortierers (FACS) zu sortieren. Richten Sie zunächst den MO-Flow für die Sortierung ein, führen Sie geeignete Kompensationskontrollen durch und erstellen Sie anschließend ein Protokoll mit Darstellungen, wie in dieser Abbildung veranschaulicht.Stellen Sie sicher, dass das Aerosolabsaugungssystem durchgängig läuft, und verwenden Sie dann die ungefärbte Probe, um die Spannung und Verstärkung für die Vorwärts- und Seitwärtsstreuung einzustellen. Um die negativen Fluoreszenzpopulationen zu identifizieren. Stellen Sie die Schwelle auf weniger als oder gleich 1 % ein, damit kein DNA-haltiger Schmutz die gewonnenen Proben verunreinigt.Analysieren Sie etwa 50.000 Ereignisse der CD19-positiven, CD34-positiven, CD45-positiven Probe. Legen Sie die Gating-Strategie wie gerade gezeigt fest, indem Sie die ungated CD19-positive, CD34-positive Population zurück ins Seitenstreulicht gegenüber Vorwärtsstreulicht-Diagramm einzeichnen. Stellen Sie sicher, dass das Lymphozyten-Gate potenzielle Pro-B-Zellen einschließt.Verwenden Sie diese Probe auch, um die negativen Fluoreszenzpopulationen für die Färbung mit sieben a a d einzustellen. Führen Sie danach die Probe mit sieben a a d durch, um die Probenlebensfähigkeit zu bestimmen; sortieren Sie nur Zellen aus einer Probe mit einer anfänglichen Lebensfähigkeit von größer oder gleich 95 %, da tote Zellen unspezifisch anfärben und die Sortierpopulationen verunreinigen können. Legen Sie nun die Sortierentscheidungen fest, um Populationen zu sammeln: CD 19 positiv, CD 34 positiv CD 19 positiv, CD 34 negativ CD 45 niedrig, CD 19 positiv, CD 34 negativ CD 45 mittel und CD 19 positiv, CD 34 negativ CD 45 hoch.Schließen Sie die Lymphozyten- und Dublett-Diskriminations-Gates in die Sortierentscheidungen aller Populationen ein, um Verstopfungen vorzubeugen. Filtern Sie die CD19-positive, CD34-positive, CD45-positive Probe im Sortierkopf unmittelbar vor der Sortierung durch einen 40-Mikron-Zellfilter. Anschließend setzen Sie die beschrifteten Sammelröhrchen, die mit 2 % FBS in PBS beschichtet sind, in einen mit Eis gefüllten Röhrchenhalter und sortieren die Zellen unmittelbar nach Abschluss der Sortierung in das entsprechende Sammelröhrchen.Extrahieren Sie die DNA, da die Variation zwischen den Proben eine Rolle für den Erfolg der Zelle spielt, und sortieren Sie eine gute Sortierung. Es liegt ein hoher Prozentsatz an Zellen im Lymphozytengang vor. Proben mit hohen Erfolgsraten enthalten geringe Mengen an kontaminierenden Rückständen, wie durch die geringe Anzahl von Ereignissen unterhalb und links der eingegrenzten Lymphozytenpopulation belegt.Die Proben mit geringen Erfolgsraten enthalten hohe Mengen an kontaminierenden Rückständen. Bei schlechten Proben ist ein deutlicher Anstieg dieser Ereignisse zu beobachten. Die durch Flusszytometrie sortierten Zellen und die anschließend aus jedem Vorläufer-B-Zell-Subset isolierte DNA weisen eine Menge und Qualität auf, die für nachgeschaltete Analysen geeignet sind.Wir haben diese DNA routinemäßig in Myra verwendet, um methylierte DNA anzureichern, hier DNA, isoliert aus CD 19 positiven, CD 34 positiven Zellen, CD 19 positiven, CD 34 negativen, CD 45 low Zellen, CD 19 positiven, CD 34 negativen, CD 45 medium Zellen und CD 19 positiven, CD 34 negativen, CD 45 high Zellen. Diese wurden bei hoher Leistung insgesamt neun Minuten lang sonifiziert, an einer Säule gereinigt und anschließend in einem 1 %igen Agarosegel mit Cyber Green Nukleinsäure-Gel-Färbemittel in dieser Spur sichtbar gemacht. Als Kontrolle wurde eine 100 Basenpaar lange DNA-Leiter nach Myra unter Verwendung des Active Motif Method Collector Ultra Kits sowie PCR mit den kontrollierten methylierten SLC25A37- und kontrolliert unmethylierten APC1-Genen durchgeführt, um die Anreicherung der methylierten DNA zu bestätigen.Die stärkere Amplifikation von SLC 25 A 37 bestätigt die Anreicherung methylierter DNA in den Vorläufer-B-Zell-Subpopulationen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 10 Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellen sehr schonend zu behandeln und die optimierte Menge an Antikörpern zu verwenden, um die Bildung von kontaminierendem Zelltrümmern zu minimieren, nachdem dieses Verfahren befolgt wurde.Andere Methoden wie die Next-Generation-Sequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche Gene methyliert sind und welche Vorläufer-B-Zell-Subpopulationen betroffen sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie den Betrieb eines Aerosolabsaugsystems, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir die erste Good Manufacturing Practice (GMP)-kompatiblen Verfahren zur Herstellung virus-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) aus Nabelschnurblut, eine Quelle von überwiegend naiven T-Zellen.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Das Video erklärt eine Methode zur Reinigung von B-Zellen durch immunomagnetisches Targeting und Trennung von der Suspension der mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Bei der Methode werden unerwünschte Zelltypen mit spezifischen Antikörpern oder Liganden (die an magnetische Partikel gebunden sind) markiert, die auf bestimmte Zelloberflächenproteine abzielen, die durch magnetische Trennung aus der heterogenen Zellsuspension entfernt werden sollen.

Negative immunomagnetische Selektion: Eine Methode zur Aufreinigung von B-Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut mit biotinylierten Antikörpern, die spezifisch für Nicht-B-Zellen sind, und Streptavidin-konjugierten magnetischen Mikrokügelchen.

Isolierung und Reinigung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut

Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems (HIS). CD34+ hämatopoetische Stammzellen (HSCs) werden aus menschlichen Buffy-Coat-Zellen aus Nabelschnurblut mit Hilfe von Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen isoliert. Die CD34+ HSCs werden in einem mit Zytokinen angereicherten Wachstumsmedium expandiert und kryokonserviert. Schließlich werden die aufgetauten HSCs in ein immundefizientes Mausjunges injiziert, um das HIS-Mausmodell zu etablieren.

Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems

Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Klonierung der seltenen T-Zell-Einheit von peripheren Vδ1+CD4+ T-Zellen zur Verfügung, die, wie wir kürzlich gezeigt haben, ein extrathymer αβ T-Zell-Vorläufer ist. Diese Technik ermöglicht es, diese Zellen in ex vivo-Kulturen quantitativ zu isolieren, zu klonen und effizient zu expandieren.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

Eine hochreine Bevölkerung von Megakaryozyten erhalten Sie bei Kabel Blut stammenden CD34+ Zellen. Eine Methode für die CD34+ Isolation und Megakaryocyte Zelldifferenzierung wird hier beschrieben.

Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+

Hier stellen wir ein Protokoll zur immunphenotypischen Charakterisierung und Zytokin-induzierten Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Linien vor. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen Untersuchungen über die Wirkung von myeloischen Krankheitsmutationen oder kleinen Molekülen auf die myeloische Differenzierung der CD34+ Zellen.

Panmyeloische Differenzierung von humanem Cordblood abgeleitet CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Wir präsentieren ein einfaches Protokoll für die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen aus Vollblut, das von Patienten mit diagnostiziertem Sézary-Syndrom gewonnen wurde, gefolgt von der Auswahl von CD4+ T-Zellen, ihrer Stimulation mit Phorbol12-Myristat13-Acetat und A23187-Ionophor und der Vorbereitung von RNA für die transkriptomische Profilerstellung.

Isolierung menschlicher mononukleärer Blutzellen und CD4+ T-Zellen von Patienten mit Sézary-Syndrom für transkriptomisches Profiling

Dieses Protokoll beschreibt eine automatisierungskompatible Methode mit hohem Durchsatz zur Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes für Biobanking und andere Zwecke.

Isolierung von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes aus Buffy Coats durch immunmagnetische Hochdurchsatz-Bead-Trennung

Lernen Sie die Isolierung von Vorläufer-B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut mittels Dichtegradientenzentrifugation, magnetischer Depletion und Durchflusszytometrie. Diese Methode liefert hochwertige Nukleinsäuren für downstream-Analysen.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

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