Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Untergruppen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mononukleäre Zellen aus Nabelschnurblut durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. Im zweiten Schritt werden Zelloberflächenantigene mit Biotin-konjugierten Antikörpern markiert, um die verbleibenden Nicht-B-Zellen magnetisch zu depletieren.

Anschließend werden die isolierten B-Zellen fluoreszenzmarkiert mit Antikörpern gegen die Zelloberflächenantigene CD 19, CD 34 und CD 45. Im letzten Schritt werden die Zellen durch Durchflusszytometrie sortiert, um die Vorläufer-B-Zell-Untergruppen zu gewinnen. Letztendlich können Zellen in ausreichender Anzahl und Qualität für die Verwendung in nachgelagerten Assays erworben werden, die qualitativ hochwertige DNA und RNA erfordern.

Ein Vorteil der Zellsortierstrategie gegenüber alternativen Methoden besteht darin, dass unsere Strategie weniger Zeit am Durchflusszytometer und nur drei fluoreszierende Antikörper benötigt, was die Kosten des Experiments erheblich reduziert. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, mit der Vielfalt der verfügbaren Methoden zur Vorbereitung von Nabelschnurblutzellen für die Durchflusszytometrie und der Komplexität der Vorbereitung des Durchflusszytometers zu kämpfen haben. Obwohl diese Methode Einblicke in gesunde Vorläufer-B-Zellen geben kann, kann sie auch auf andere Zelltypen angewendet werden, die im Nabelschnurblut vorkommen, wie z. B. T-Zellen, oder auf Studien von Krankheiten, an denen hämatopoetische Zellen beteiligt sind, wie z. B. Leukämie oder Lymphome.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, die richtigen Techniken zu beschreiben, die für die Verarbeitung des Nabelschnurblutes und der Nabelschnurzellen erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren und das Vorhandensein von kontaminierenden Ablagerungen zu reduzieren. Um mononukleäre Zellen aus Nabelschnurblut zu isolieren, verdünnen Sie zunächst acht Milliliter Aliquots des Nabelschnurbluts mit 24 Millilitern DPBS. Schichten Sie dann langsam jede verdünnte Blutmischung auf 15 Milliliter ALI Watt Fipa plus in konische 50-Milliliter-Röhrchen, wobei Sie darauf achten, dass die Schichten getrennt bleiben.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Blut 40 Minuten lang bei 400 mal G und 20 Grad Celsius, während die Zellen durch Dichtegradienten getrennt werden, markieren Sie sieben Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden mit dem Proben-ID-Datum und allen anderen geeigneten Informationen, wie in der Tabelle beschrieben. Nach der Trennung verbleiben die mononukleären Zellen an der grenzfläche des Plasmas, während die Granulozyten und Erythrozyten nun sedimentieren und die oberen Plasmaschichten ansaugen, wodurch der Kontakt mit den mononukleären Zellschichten vermieden wird. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Glaspipette, um die mononukleären Zellschichten von drei der 50-Milliliter-Röhrchen vorsichtig in einem einzigen neuen 50-Milliliter-Röhrchen zu sammeln.

Füllen Sie dieses neue Röhrchen mit PBS, mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und waschen Sie die Zellen dann zweimal für 10 Minuten bei 300 mal G und 20 Grad Celsius. Nach der ersten Wäsche resuspendieren Sie die Pellets und geben Sie sie in ein einzelnes konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Nach dem zweiten Waschen wird das Zellpellet vorsichtig in 200 Mikrolitern PBS reanimiert, ein Mikroliter der Zellsuspension wird in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zur Zählung auf einen Milliliter PBS übertragen.

Waschen Sie dann die Zellen in der 50-Milliliter-Tube mit mehr PBS, anschließend und entfernen Sie den Überstand vollständig, ohne das Pellet zu stören. Um die B-Zellen von den mononukleären Zellen zu isolieren, wird zunächst das gerade gewaschene Pellet in 160 Mikrolitern von vier Grad Celsius suspendiert. Frisch zubereiteter DGAs E-D-T-A-P-B-S Puffer.

Mischen Sie dann 40 Mikroliter des B-Zell-Isolationskits und des Bio-ITIN-Antikörpercocktails mit der Zellsuspension. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert haben, waschen Sie den freien Antikörper in einem Milliliter von vier Grad Celsius, E-D-T-A-P-B-S-Puffer pro 10 Millionen Zellen ab. Anschließend wird das Zellpellet in 320 Mikrolitern vier Grad Celsius E-D-T-A-P-B-S Puffer resuspendiert.

Mischen Sie nun nach einer 15-minütigen Inkubation bei vier Grad Celsius 80 Mikroliter Anti-Biotin-Mikrokügelchen mit der Zellsuspension. Waschen Sie die Zellen erneut, während sich die Zellen drehen. Platzieren Sie eine LS-Säule in das Magnetfeld eines max-Separators und tropfen Sie drei Milliliter vier Grad Celsius E-D-T-A-P-B-S-Puffer durch die Säule.

Anschließend resuspendieren Sie bis zu 100 Millionen der gewaschenen Zellen in 500 Mikrolitern mit vier Grad Celsius, E-D-T-A-P-B-S-Puffer. Pipettieren Sie dann die Zellsuspension auf die Säule und sammeln Sie die unmarkierten Zellen, die die Säule passieren, in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie weitere zwei Milliliter E-D-T-A-P-B-S-Puffer von vier Grad Celsius an die Wände des ursprünglichen konischen Röhrchens, jeweils einen Milliliter, und mischen Sie dann die restliche Zellsuspension vorsichtig und pipettieren Sie sie jedes Mal vorsichtig auf die Säule, um sicherzustellen, dass alle Zellen zurückgewonnen werden.

Füllen Sie schließlich das konische Röhrchen mit den unmarkierten Zellen mit PBS. Nach dem Zentrifugieren entfernen die Zellen vorsichtig den Überstand, ohne das Küvettenpellet zu stören. Anschließend werden die Zellen vorsichtig in 200 Mikrolitern E-D-T-A-P-B-S-Puffer reanimiert.

Beginnen Sie mit der Antikörpermarkierung. Übertragen Sie zunächst einen Mikroliter der Zellsuspension in das zuvor markierte, ungefärbte Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter E-D-T-A-P-B-S Puffer in das Röhrchen und lagern Sie es auf Eis.

Schalten Sie alle Lichter aus und geben Sie dann je 20 Mikroliter CD 19-, CD 34- und CD 45-Antikörper pro 1 Million Zellen in die verbleibende Zellsuspension. Gut mischen und die Tube für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln stellen. Als nächstes werden 40 Mikroliter der Antikörper-markierten Zellsuspension in das mit sieben A und D markierte Röhrchen überführt.

Waschen Sie die Zellen in einem Milliliter PBS und resuspendieren Sie die Palette dann in 100 Mikrolitern Bindungspuffer. Geben Sie sieben Mikroliter sieben A a d zu diesen Zellen und inkubieren Sie sie dann 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, während die Zellen mit sieben A a d markiert werden, füllen Sie das Röhrchen der Antikörper-markierten Zellen mit PBS auf, waschen Sie die Antikörper-markierten Zellen und resuspendieren Sie das Pellet dann in 500 Mikrolitern E-D-T-A-P-B-S-Puffer. Übertragen Sie nun das gesamte Volumen der Antikörper-markierten Zellsuspension in das CD 19 positive CD 34 positive CD 45 positiv markierte Röhrchen.

Spülen Sie das Röhrchen mit einem weiteren Milliliter E-D-T-A-P-B-S-Puffer und überführen Sie die Restzellsuspension in das CD 19 positive CD 34 positive CD 45 positiv markierte Röhrchen. Zum Schluss geben Sie 300 Mikroliter Bindungspuffer in die sieben A- und D-Röhrchen, um die Zellen mit dem Durchflusszytometer MO flow XDP zu sortieren. Richten Sie zunächst den MO-Fluss für die Sortierung ein, führen Sie die richtigen Kompensationssteuerungen aus, und erstellen Sie dann ein Protokoll mit Diagrammen, wie in dieser Abbildung dargestellt.

Stellen Sie sicher, dass das Aerosol-Evakuierungssystem jederzeit in Betrieb ist, und verwenden Sie dann die ungefärbte Probe, um die Spannung und Verstärkung für die Vorwärts- und Seitenstreudiagramme einzustellen. Identifizierung der negativen Fluoreszenzpopulationen. Stellen Sie den Schwellenwert auf kleiner oder gleich 1 % ein, damit DNA, die Rückstände enthält, die zurückgewonnenen Proben nicht kontaminiert.

Führen Sie ca. 50.000 Ereignisse der CD 19 positiven CD 34 positiven CD 45 positiven Probe durch. Um die Gating-Strategie, wie gerade gezeigt, wieder festzulegen, gating Sie die ungesicherte CD 19-positive CD 34-positive Population auf das Seitenstreudiagramm im Vergleich zum Vorwärtsstreudiagramm. Um sicherzustellen, dass der Lymphozytengang potenzielle Pro-B-Zellen enthält.

Verwenden Sie diese Probe, um auch die negative Fluoreszenzpopulation für die Sieben-a- bis d-Färbung einzustellen. Führen Sie als Nächstes die sieben a a d Proben aus, um die Lebensfähigkeit der Probe zu bestimmen, sortieren Sie nur Zellen aus einer Probe mit einer Lebensfähigkeit von mehr als oder gleich 95 % zu Beginn, da tote Zellen wahllos verfärben und die Sortierpopulationen kontaminieren können. CD 34 negativ CD 45, low CD 19 positiv, CD 34 negativ CD 45 mittel und CD 19 positiv. CD 34 negativ CD 45 hoch.

Beziehen Sie die Lymphozyten- und Dublett-Diskriminierungstore in die Sortierentscheidungen aller Populationen ein, um Verstopfungen zu vermeiden. Filtrieren Sie die CD 19 positive CD 34 positive CD 45 positive Probe unmittelbar vor dem Sortieren durch ein 40-Mikron-Zellsieb. Legen Sie dann beschriftete Sammelröhrchen, die mit 2%FBS in PBS beschichtet sind, in einen eisgekühlten Röhrchenhalter und sortieren Sie die Zellen sofort nach Abschluss der Sortierung in das entsprechende Sammelröhrchen.

Die Extraktion der DNA zwischen den Proben Die Variation spielt eine Rolle für den Erfolg der Zelle, sortieren Sie in einer guten Sortierung. Es gibt einen hohen Prozentsatz an Zellen im Gang der Lymphozyten. Proben mit guten Erfolgsraten enthalten geringe Mengen an kontaminierenden Trümmern, was durch die geringe Anzahl von Ereignissen belegt wird, die unterhalb und links der Gated Lymphozytenpopulation liegen.

Die Proben mit schlechten Erfolgsquoten enthalten einen hohen Anteil an kontaminierendem Schmutz. Schlechte Stichproben zeigen eine deutliche Zunahme dieser Ereignisse. Die flusssortierten Zellen und die nachfolgende DNA, die aus jeder Vorläufer-B-Zell-Untergruppe isoliert wurde, sind von Quantität und Qualität, um nachgelagerte Analysen durchzuführen.

Wir haben diese DNA routinemäßig in Myra verwendet, um aus methylierter DNA DNA hier DNA anzureichern, die aus CD 19 positiven CD 34 positiven Zellen, CD 19 positiven, CD 34 negativen CD 45 niedrigen Zellen, CD 19 positiv, CD 34 negativen CD 45 mittleren Zellen und CD 19 positiven CD 34 isoliert wurde. Negative CD 45-Zellen mit hohem Gehalt wurden insgesamt neun Minuten lang auf hoher Ebene beschallt, säulengereinigt und dann auf einem 1%aros-Gel mit cybergrüner Nukleinsäure-Gelfärbung in dieser Spur visualisiert. Nach Myra wurde auch eine Kontrollleiter mit 100 Basenpaaren unter Verwendung der aktiven Motivmethode Collector Ultra Kit PCR mit den Kontroll-methylierten SLC 25 A 37 und unmethylierten APC 1-Genen der Kontrolle durchgeführt, um die Anreicherung der methylierten DNA zu bestätigen.

Die höhere Verstärkung des SLC 25. A 37 bestätigt die Anreicherung der methylierten DNA in den Vorläufer-B-Zell-Untergruppen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 10 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Zelle sehr schonend zu behandeln und die optimierte Menge an Antikörpern zu verwenden, damit die Bildung von kontaminierenden Ablagerungen nach diesem Verfahren minimiert wird.

Andere Methoden wie Next Generation Sequencing können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Gene methyliert sind und welche Vorläufer-B-Zell-Untergruppen sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Betreiben eines Aerosol-Evakuierungssystems sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens jederzeit getroffen werden.