Verwenden Sie von In vivo Imaging zur Überwachung der Progression of Experimental Maus Cytomegalovirus-Infektion bei Neugeborenen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in vivo Bildgebung von Maus-Neugeborenen durchzuführen, um die Verbreitung des lumineszierenden Cytomegalievirus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die geeignete Verdünnung des Virus aus einer Stammlösung hergestellt wird. Als nächstes wird den Neugeborenen das lumineszierende MCMV in die Bauchhöhle injiziert.

Zu Zeitpunkten nach der Injektion. Die Jungtiere werden betäubt und mit Luzifer injiziert, bevor sie in vivo bildgebend dargestellt werden. Letztendlich wird die In-vivo-Bildgebung verwendet, um die Replikation und Verbreitung des Virus in der Bauchhöhle und im Zentralnervensystem zu zeigen und zu quantifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Virusfiltration in Organen nach der Euthanasie infizierter Tiere besteht darin, dass weniger Zeit und weniger Ressourcen verbraucht werden. Das Verfahren wird von Mr.Il Macan, einem Techniker aus meinem Labor, vorgeführt. In der folgenden Studie wird ein MCMV-exprimierender Luciferase-Stamm aus dem Labor von Ulrich Kowski verwendet.

Um den Stamm zu amplifizieren, geben Sie das Virus zu kultivierten Zellen in einem serumfreien Medium bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach einer Stunde den Überstand und ersetzen Sie ihn durch DMEM, das mit 10 % fötalem Kälberserum ergänzt wird. Fünf Tage später wird die Kultur geerntet und die Aliquots bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Bis zur weiteren Verwendung. Nach der Titration der Virussuspension durch Plaque-Assay verdünnen Sie die Probe auf 50 pfu in 50 Mikrolitern DMEM und lassen Sie sie auf Eis, bis bei Neugeborenen, die zwischen vier und 20 Stunden alt sind, gebrauchsfertige Injektionen durchgeführt werden. Bevor Sie die Welpen anfassen, manipulieren Sie die Einstreu und den Kot mit behandschuhten Händen.

Um die Einführung von Fremdgerüchen zu vermeiden, die die Mutter dazu zwingen könnten, eine Übungsinjektion durchzuführen, füllen Sie eine Insulinspritze mit 1 % Methylenblau, verdünnt in DPBS. Wenn Sie bereit sind, halten Sie das Neugeborene an der Rückenhaut, wie hier zu sehen, mit der Bauchseite nach oben. Führen Sie die Nadel unter das vier Bein ein und schieben Sie sie vorsichtig subkutan in die Bauchhöhle

Sobald sich die Nadelspitze in der richtigen Position befindet, injizieren Sie das Methyl in blau. Ziehen Sie anschließend die Nadel langsam zurück und wischen Sie jegliches Blut von der Injektionsstelle ab. Bringen Sie das Neugeborene nach der Injektion nach erfolgreicher Übungsinjektion wieder in den Käfig zurück und wiederholen Sie diesen Vorgang mit der zuvor vorbereiteten Virussuspension.

Die Bilder werden sieben Tage nach der Injektion aufgenommen, wobei die Neugeborenen wie zuvor gezeigt vorsichtig behandelt werden. Injizieren Sie jeweils eine Mischung aus Anästhetika und Luzifer, während Sie 12 bis 15 Minuten warten. Damit der LUCIFERIAN seine maximale Emission erreicht, stellen Sie sicher, dass die Plattform in der Aufnahmekammer des Bildgebungsgeräts beheizt wird, um die richtige Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Nachdem die Welpen zur Identifizierung betäubt und markiert wurden, können sie in das Bildgebungssystem gelegt werden.

Führen Sie zunächst die Erfassung des vom ganzen Körper ausgestrahlten Lichts durch. Da sich das Virus in mehreren Zielorganen vermehrt hat, sollte die Expositionsdauer kurz sein. Hier wird die Erfassung für 10 bis 20 Sekunden durchgeführt.

Es ist hilfreich, Bilder von mehreren Tieren mit niedriger Auflösung innerhalb einer Aufnahmerunde zu erhalten und dann die Plattform näher zu bewegen, um sich nach der Sektion auf einen Teil eines bestimmten Tieres oder ein isoliertes Organ zu konzentrieren. Um ein Lichtsignal nur vom Kopf zu erhalten, bedecken Sie den Rest des Körpers mit einem dicken, dunklen Papier, das die Photonen maskiert, führen Sie die Erfassung fünf bis 10 Minuten lang durch und wiederholen Sie dies für die gegenüberliegende Seite des Tieres. Unter den gleichen Bedingungen.

Nach der Bildgebung werden die Welpen in einen beheizten Käfig zurückgebracht, um ihre Körpertemperatur während der Narkose zu halten. Diese Bilder wurden an den Tagen 7, 9, 11 und 14 nach der Infektion aufgenommen, wobei der Gesamtvirustiter im Tier mit der Zeit abzunehmen. In diesem Beispiel ist der Körper bedeckt, so dass der Kopf freiliegt.

Dabei zeigt sich ein diskreter Fleck auf Höhe des linken Ohrs, dessen Intensität zwischen dem siebten und 14. Tag zunimmt, was darauf hindeutet, dass die Ausbreitung von MCMV ins Gehirn in vivo dynamisch beobachtet werden kann. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die genaue Position des Virus im Gehirn zu beantworten.