L'acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere filmati di fluorescenza di singole cellule di lievito in crescita ed estrarre serie temporali di espressione reporter per ciascuna cellula. Ciò si ottiene coltivando prima un monostrato di cellule in una camera microfluidica. Il secondo passo consiste nell'eseguire la microscopia a fluorescenza time-lapse per uno o più reporter.

Successivamente, i filmati vengono elaborati utilizzando il pacchetto software per innesti per tracciare e misurare le cellule nel tempo. Il passaggio finale consiste nell'analizzare le misurazioni delle celle e le assegnazioni di derivazione e nell'esportare le serie temporali dell'espressione reporter per ogni cellula intera. In definitiva, viene utilizzato un tasso di trascrizione istantaneo dedotto da serie temporali di espressione per mostrare i cambiamenti nella trascrizione sia durante il ciclo cellulare che in risposta al cambiamento dei livelli del fattore di trascrizione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della regolazione genica, come la velocità con cui i diversi promotori rispondono all'aggiunta improvvisa o a una certa sottrazione di un fattore di trascrizione attivo. Quanto è variabile questa risposta in una popolazione di cellule e in che modo le diverse caratteristiche cellulari, tra cui la morfologia e la fase del ciclo cellulare, influenzano la risposta? Inoltre, questo metodo può sondare gli effetti di aggiunte e sottrazioni multiple di un fattore di trascrizione attivo sull'espressione genica.

Preparare le cellule di lievito che crescono in uno stato stazionario ricco di sostanze nutritive a una densità adatta per il caricamento nel dispositivo microfluidico come descritto nel protocollo di testo. Quindi preparare una piastra di coltura microfluidica Y zero quattro C dall'ASIC cellulare risciacquando i pozzetti con acqua sterile dopo la rimozione della soluzione di spedizione utilizzando il sistema di perfusione dell'onice far scorrere l'acqua attraverso i pozzetti da uno a sei a sei PSI per cinque minuti per lavare i canali, quindi fluire dal pozzetto di carico otto a sei PSI per 10 secondi. Rimuovere l'acqua da tutti i pozzetti e sostituirla con 250 microlitri di terreno SC nei pozzetti di ingresso, da uno a sei e 50 microlitri della coltura cellulare preparata nel carico cellulare.

Il pozzo otto sigilla il collettore di onice alla piastra e inizia a innescare i canali e la camera di coltura scorrendo dai pozzi di ingresso da uno a sei a sei PSI per due minuti. Seguire questo con il flusso solo dal pozzetto di ingresso, mantenendo il fluido di partenza per almeno cinque minuti. A sei PSI lo flusso continuo fino a quando il microscopio non fissa la piastra al supporto del tavolino per impedirne lo spostamento durante l'esperimento al fine di migliorare l'inseguimento cellulare durante l'analisi dei dati, dopo la preparazione del microscopio come descritto nel protocollo di testo, posizionare alcune gocce di fluido di immersione sull'obiettivo e montare il dispositivo microfluidico in modo sicuro.

Nella fase del microscopio invertito, mettere a fuoco il terzo più a sinistra della prima camera di coltura utilizzando uno degli indicatori di posizione incorporati. Spegnere il flusso dal pozzetto di ingresso del fluido e il flusso dal pozzo di caricamento delle celle otto a sei PSI in raffiche di cinque secondi. Sposta il tavolino per cercare le cellule nella camera di coltura.

Aumentare il tempo e la pressione del flusso di carico fino a raggiungere la densità delle celle desiderata, ma evitare di sovraccaricare e intasare la barriera più a sinistra dove il fluido fresco entra nella camera. Iniziare a fluire dal pozzetto di ingresso del fluido contenente il fluido di partenza a sei PSI. In Metamorph o altri software di automazione e controllo per microscopia.

Imposta un'acquisizione multidimensionale per scattare più immagini in più posizioni del tavolino nel tempo. Imposta il numero di punti temporali e l'intervallo tra di essi. Quindi selezionare diverse posizioni del tavolino con circa 10 caselle. Ogni.

Imposta l'acquisizione in modo che in ogni posizione del palco e in ogni punto temporale, il programma si concentrerà sull'immagine in campo chiaro a luce trasmessa utilizzando il metodo di messa a fuoco automatica integrato di Metamorphs, implementando l'autofocus come un diario scritto personalizzato all'inizio di ogni fase. La posizione offre un maggiore controllo sulla precisione della messa a fuoco. Impostare anche il programma per acquisire l'immagine in campo chiaro a più un micron rispetto al piano focale e per acquisire un'immagine in campo chiaro fuori fuoco a meno quattro micron rispetto al piano focale.

Utilizza diari scritti personalizzati per modificare la messa a fuoco secondo necessità tra le immagini. Infine, imposta il programma. Acquisisci un'immagine in scala di grigi per ogni reporter fluorescente sul piano focale.

Utilizzando impostazioni ottimizzate per un'acquisizione rapida con uno sbiancamento minimo delle foto. Preparare il programma di flusso per l'esperimento nel software di controllo dell'onice. Quindi avviare contemporaneamente il programma di acquisizione in Metamorph e il programma di flusso nel software di controllo Onyx.

Esegui il file M di formato dati in MATLAB per aprire l'interfaccia utente grafica o GUI per l'input dei dati. Nella parte superiore, specificare o passare alla cartella contenente i file di immagine per impostare la directory dei dati e quindi utilizzare gooey per specificare i tipi di dati e i file di immagine registrati nell'esperimento. Procedere alla selezione dei parametri di segmentazione come descritto nel protocollo di testo.

La scelta dei parametri appropriati per la segmentazione delle immagini in campo chiaro può essere difficile e ha un effetto significativo sulla qualità dei dati delle serie temporali risultanti. Ci concentriamo sull'identificazione di tutte le regioni cellulari con la preferenza data alla sovrasegmentazione piuttosto che alla sottosegmentazione. Durante l'ispezione visiva dei dati, le regioni sovrasegmentate possono essere unite insieme per formare intere regioni di celle, ma le regioni sottosegmentate non possono essere suddivise in seguito.

Imposta i diversi parametri di segmentazione e verifica la qualità della segmentazione facendo clic su Test riuscito. Le regioni segmentate saranno verdi con bordi magenta. Assicurati di utilizzare il cursore per controllare più punti temporali nel filmato quando la segmentazione è soddisfacente.

Selezionare Fine per riportare i parametri di segmentazione alla GUI dei dati di formato. Dopo aver selezionato i parametri del colore come descritto nel testo, premere il pulsante della soglia automatica per determinare automaticamente la soglia. Utilizzando il metodo di tzu, l'immagine evidenzierà le aree conservate al di sopra della soglia.

La soglia può essere regolata manualmente utilizzando la casella di modifica. Utilizzare la barra di scorrimento per verificare che la soglia sia appropriata per tutti i punti temporali. Quando sei soddisfatto, premi fatto.

Per riportare la soglia alla GUI dei dati di formato, premere aggiungi e segmenta. Per creare la maschera colore, premere formatta dati per leggere i file immagine, elaborare i dati e creare un file dot mat nella cartella specificata. Questo file fungerà da input per la GUI delle serie temporali del processo.

Esegui il file M della serie temporale del processo in MATLAB per aprire la GUI di tracciamento. Dopo aver aperto l'interfaccia grafica, impostare prima l'altezza della camera. Questo indica l'altezza della camera in cui sono intrappolate le cellule.

Viene utilizzato come vincolo per approssimare il volume cellulare come un ellissoide 3D basato sull'asse maggiore e minore della regione cellulare. Quindi imposta i micrometri per pixel. Questo è il fattore di conversione utilizzato per calibrare la distanza da pixel a micrometro nelle immagini in modo che l'area della sezione trasversale e il volume possano essere calibrati rispettivamente in micrometri quadrati e micrometri cubi.

Quindi, utilizza il pannello dei filtri per impostare i parametri minimo e massimo per filtrare le regioni spazzatura nella maschera. L'area è l'area della regione in pixel. ECC è il fattore di eccentricità, che è più circolare man mano che il valore si avvicina allo zero.

E SF è il fattore di forma, che è più circolare man mano che il valore si avvicina a un clic, carica le immagini nel pannello di output di input del file e seleziona il file di dati dot mat di interesse emesso dalla GUI dei dati in formato. La maschera di regione verrà applicata a ciascun canale di colore e verranno effettuate una serie di misurazioni diverse. Il file di dati viene quindi salvato dopo aver selezionato il parametro delle celle della traccia come descritto nel testo.

Fare clic sulle celle di traccia per tracciare le regioni da un fotogramma all'altro utilizzando gli OID della regione per assegnare le derivazioni per le gemme appena apparse e per salvare i dati, modificare i parametri nelle finestre pop-up se necessario. I lignaggi vengono assegnati automaticamente riducendo al minimo le distanze tra le gemme putative e le potenziali madri. In ogni fotogramma.

Fai clic sul pulsante sopra il pannello delle informazioni della cella selezionata e cura le regioni scarsamente segmentate e gli errori nelle assegnazioni di ID o derivazione utilizzando i vari strumenti appiccicosi o i tasti di scelta rapida descritti nel protocollo di testo per curare correttamente i dati. Unisci tutte le regioni eccessivamente segmentate, elimina tutte le regioni che non catturano l'intera cellula e assicurati che le relazioni tra le gemme madri siano assegnate correttamente. Inoltre, elimina tutti gli ID verdi unendo le regioni.

Correzione dell'id, assegnazione della regione a una madre, assegnazione di nessuna madre o eliminazione della regione. Poiché i dati sulle gemme verranno aggiunti a quelli della madre durante l'analisi finale. Non unire una regione di gemme alla sua madre.

Ispeziona visivamente i dati per ogni fotogramma fino all'ultima volta di interesse. Non è richiesto per l'intera serie temporale. Se non si utilizzano i fotogrammi successivi, assicurarsi di salvare le modifiche una volta che tutte le regioni cellulari sono state ispezionate nell'arco di tempo di interesse, i dati per tutti i canali di fluorescenza e il modo in cui cambiano nel tempo sono pronti per essere emessi.

Push analisi delle serie temporali per analizzare le serie temporali per intere celle nel tempo. Calcola le informazioni sul ciclo cellulare e prendi le derivate. Si aprirà una finestra che consente la selezione delle misure di interesse e l'inserimento dei parametri di analisi Inserire l'ultimo punto temporale curato nel gooey.

I parametri predefiniti di livellamento e assegnazione del ciclo cellulare funzionano bene per i ceppi aploidi e diploidi ripresi a intervalli di cinque minuti, ma potrebbe essere necessario variarli per ottenere i migliori risultati. Quando tutti i parametri sono impostati, selezionare analizza per esportare i dati delle serie temporali di singole cellule come descritto nel protocollo di testo, Un esperimento eseguito e analizzato con successo produrrà serie temporali per lo più continue per singole cellule intere con tempi di emergenza e divisione realisticamente assegnati ma per un ceppo di lievito alone che esprime una copia integrata della proteina fluorescente Ian o CFP guidata dal costituente di un promotore DH. Le misurazioni dell'intera cellula nel tempo sono state ottenute dall'analisi delle serie temporali.

Le immagini in campo chiaro mostrano la cellula madre segmentata in blu e i suoi germogli in verde. Con l'intera cellula contigua delineata in rosso, emerge una dipendenza dal ciclo cellulare sia per il volume che per l'espressione. Qui, le regioni grattugiate mostrano quando la cella è in SG due M e ha una gemma che germoglia inizia nella transizione G da uno a S dal bianco al grigio.

L'ombreggiatura e la divisione cellulare si verificano in corrispondenza della transizione da M a G da una ombreggiatura grigia a bianca dopo la formazione delle gemme. Il volume totale combinato aumenta più rapidamente di prima, ma l'emergenza mentre la concentrazione proteica o l'intensità media diminuiscono leggermente. L'aumento delle proteine integrate combinate accelera anche dopo la gemmazione rispetto alla sola regione madre.

Questi risultati dimostrano l'importanza di incorporare correttamente i contributi delle gemme alla misurazione dell'intera cellula ed evidenziano la necessità di una corretta formazione delle gemme e dell'assegnazione dei tempi di divisione. Le serie temporali differenziate possono essere utilizzate per calcolare un livello di mRNA relativo istantaneo e una velocità di trascrizione, che aumentano anche dopo la gemmazione la capacità di generare un tempo stabile. Le derivate delle serie temporali di misura avvantaggiano anche gli studi cinetici utilizzando il sistema di espressione commutabile descritto nel protocollo di testo.

Un'analisi delle serie temporali mostra quando il fattore di trascrizione è localizzato nel nucleo e quando il gene bersaglio inizia e si ferma. La trascrizione mostrata qui è una micrografia dei quattro canali di acquisizione indicati per una cellula con un attivatore trans PHO four Tet R fuso con YFP commutabile. L'attivatore trans si localizza nel nucleo marcato RFP in risposta a un basso contenuto di fosfato e guida l'espressione di un reporter CFP promotore di sette X Tet O.

La velocità di trascrizione dedotta cambia con la localizzazione in media e a livello di singola cellula. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre analisi dei dati delle serie temporali multidimensionali a singola cellula per rispondere a ulteriori domande, tra cui in che modo l'espressione varia nella popolazione nel tempo? Gli effetti delle fluttuazioni estrinseche sono ereditati nel corso di più generazioni?

La cinetica di attivazione genica cambia dopo la riattivazione? Il ciclo cellulare gioca un ruolo e molte altre domande che richiedono l'espressione genica, la crescita e le traiettorie di lignaggio delle singole cellule?