La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

El objetivo general de este procedimiento es obtener películas de fluorescencia de células de levadura individuales en crecimiento y extraer series temporales de expresión reportera para cada célula. Esto se logra cultivando primero una monocapa de células en una cámara microfluídica. El segundo paso es realizar microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo para uno o más reporteros.

A continuación, las películas se procesan utilizando el paquete de software de injerto para rastrear y medir las células a lo largo del tiempo. El paso final es analizar las medidas de celda y las asignaciones de linaje y exportar series temporales de expresión reportera para cada celda completa. En última instancia, se utiliza una tasa de transcripción instantánea inferida a partir de series temporales de expresión para mostrar los cambios en la transcripción tanto a lo largo del ciclo celular como en respuesta a los cambios en los niveles de los factores de transcripción.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación génica, como la rapidez con la que responden los diferentes promotores a la adición o sustracción repentina de un factor de transcripción activo. ¿Qué tan variable es esta respuesta a través de una población de células y cómo influyen en la respuesta las diferentes características celulares, incluida la morfología y la fase del ciclo celular? Además, este método puede investigar los efectos de múltiples adiciones y sustracciones de un factor de transcripción activo en la expresión génica.

Prepare las células de levadura que crecen en un estado estable rico en nutrientes a una densidad adecuada para cargarse en el dispositivo microfluídico como se describe en el protocolo de texto. A continuación, prepare una placa de cultivo microfluídico Y cero cuatro C a partir de la célula ASIC enjuagando los pocillos con agua estéril después de la extracción de la solución de envío utilizando el sistema de perfusión de ónix haga fluir el agua a través de los pozos uno a seis a seis PSI durante cinco minutos para enjuagar los canales, luego fluya desde el pozo de carga ocho a seis PSI durante 10 segundos. Retire el agua de todos los pozos y reemplácela con 250 microlitros de medios SC en los pozos de entrada, del uno al seis y 50 microlitros del cultivo celular preparado en carga celular.

El pozo ocho sella el colector de ónix a la placa y comienza a cebar los canales y la cámara de cultivo fluyendo desde los pozos de entrada uno a seis a seis PSI durante dos minutos. A continuación, fluya solo desde el pozo de entrada que mantenga el medio de arranque durante al menos cinco minutos. A seis PSI, esto fluye continuamente hasta que el paso del microscopio pega la placa a la plataforma para evitar que se desplace a lo largo del experimento con el fin de mejorar el seguimiento celular durante el análisis de datos, después de la preparación del microscopio como se describe en el protocolo de texto, coloque unas gotas de líquido de inmersión en el objetivo y monte el dispositivo microfluídico de forma segura.

En la etapa del microscopio invertido, concéntrese en el tercio más a la izquierda de la primera cámara de cultivo utilizando uno de los marcadores de posición incorporados. Apague el flujo del pozo de entrada de medios y el flujo del pozo de carga de celda ocho a seis PSI en ráfagas de cinco segundos. Mueva la platina para mirar alrededor de la cámara de cultivo en busca de células.

Aumente el tiempo de flujo de carga y la presión hasta que se logre la densidad de celda deseada, pero evite sobrecargar y obstruir la barrera más a la izquierda donde ingresan los medios frescos a la cámara. Comienza a fluir desde el pozo de entrada de medios que contiene los medios de arranque a seis PSI. En Metamorph u otro software de automatización y control de microscopía.

Configure una adquisición multidimensional para tomar varias imágenes en varias posiciones de la etapa a lo largo del tiempo. Establezca el número de puntos de tiempo y el intervalo entre ellos. A continuación, seleccione varias posiciones de platina con aproximadamente 10 celdas. Cada.

Configure la adquisición de modo que en cada posición de la etapa y en cada punto de tiempo, el programa se centre en la imagen de campo claro de luz transmitida utilizando el método de enfoque automático incorporado de Metamorphs, implementando el enfoque automático como un diario escrito personalizado al comienzo de cada etapa. La posición proporciona un mayor control sobre la precisión del enfoque. Configure también el programa para adquirir la imagen de campo claro a más una micra con respecto al plano focal y para adquirir una imagen de campo claro desenfocada a menos cuatro micras con respecto al plano focal.

Utilice diarios escritos personalizados para cambiar el enfoque según sea necesario entre las imágenes. Finalmente, configure el programa. Adquiera una imagen en escala de grises para cada reportero fluorescente en el plano focal.

Uso de configuraciones optimizadas para una adquisición rápida con un blanqueo mínimo de fotos. Prepare el programa de flujo para el experimento en el software de control de ónix. A continuación, comience simultáneamente el programa de adquisición en Metamorph y el programa de flujo en el software de control Onyx.

Ejecute el archivo de formato de datos M en MATLAB para abrir la interfaz gráfica de usuario o GUI de entrada de datos. En la parte superior, especifique o vaya a la carpeta que contiene los archivos de imagen para establecer el directorio de datos y, a continuación, use el pegajoso para especificar los tipos de datos y los archivos de imagen registrados en el experimento. Proceda a seleccionar los parámetros de segmentación como se describe en el protocolo de texto.

La elección de los parámetros adecuados para la segmentación de imágenes de campo claro puede ser difícil y tiene un efecto significativo en la calidad de los datos de series temporales resultantes. Nos centramos en la identificación de todas las regiones celulares con preferencia a las regiones de sobresegmentación en lugar de subsegmentación. Durante la inspección visual de datos, las regiones segmentadas se pueden fusionar para formar regiones de celda completas, pero las regiones segmentadas no se pueden dividir más tarde.

Establezca los diferentes parámetros de segmentación y pruebe la calidad de la segmentación haciendo clic en Probar correctamente. Las regiones segmentadas serán verdes con bordes magenta. Asegúrese de utilizar el control deslizante para comprobar varios puntos temporales de la película cuando la segmentación sea satisfactoria.

Seleccione Listo para devolver los parámetros de segmentación a la GUI de datos de formato. Después de seleccionar los parámetros de color como se describe en el texto, presione el botón de umbral automático para determinar automáticamente el umbral. Usando el método de tzu, la imagen resaltará las áreas conservadas por encima del umbral.

El umbral se puede ajustar manualmente mediante el cuadro de edición. Utilice la barra de desplazamiento para confirmar que el umbral es adecuado para todos los puntos de tiempo. Cuando esté satisfecho, empuje listo.

Para devolver el umbral a la interfaz gráfica de datos de formato, pulse agregar y segmentar. Para crear la máscara de color, presione formatear datos para leer los archivos de imagen, procesar los datos y crear un archivo de punto mat en la carpeta especificada. Este archivo servirá como entrada para la interfaz gráfica de usuario de la serie temporal del proceso.

Ejecute el archivo M de serie temporal de procesos en MATLAB para abrir la interfaz gráfica de usuario de seguimiento. Después de abrir la GUI, primero configure la altura de la cámara. Esto indica la altura de la cámara en la que están atrapadas las celdas.

Se utiliza como restricción para aproximar el volumen de la celda como un elipsoide 3D basado en el eje mayor y menor de la región de la celda. A continuación, ajuste los micrómetros por píxel. Este es el factor de conversión utilizado para calibrar la distancia de píxel a micrómetro en las imágenes, de modo que el área y el volumen de la sección transversal se puedan calibrar en micrómetros cuadrados y micrómetros cúbicos respectivamente.

A continuación, use el panel de filtros para establecer los parámetros mínimo y máximo para filtrar las regiones basura en la máscara. El área es el área de la región en píxeles. ECC es el factor de excentricidad, que es más circular a medida que el valor se acerca a cero.

Y SF es el factor de forma, que es más circular a medida que el valor se acerca a un clic, cargue imágenes en el panel de salida de entrada de archivo y seleccione el archivo de datos de color mat de puntos de salida de interés por la interfaz gráfica de datos de formato. La máscara de región se aplicará a cada canal de color y se realizarán una serie de mediciones diferentes. A continuación, el archivo de datos se guarda después de seleccionar el parámetro de celdas de pista como se describe en el texto.

Haga clic en las celdas de seguimiento para realizar un seguimiento de las regiones de un fotograma a otro utilizando los OID de región para asignar linajes a los botones recién aparecidos y para guardar los datos, cambie los parámetros en las ventanas emergentes según sea necesario. Los linajes se asignan automáticamente minimizando las distancias entre los brotes putativos y las madres potenciales. En cada fotograma.

Haga clic en el botón situado encima del panel de información de la celda seleccionada y seleccione las regiones mal segmentadas y los errores en las asignaciones de ID o linaje utilizando las diversas herramientas pegajosas o teclas de acceso directo que se describen en el protocolo de texto para seleccionar correctamente los datos. Fusiona las regiones demasiado segmentadas, elimina las regiones que no capturen toda la celda y asegúrate de que las relaciones de las yemas madre estén asignadas correctamente. Además, elimine los ID verdes mediante la fusión de regiones.

Corregir el id, asignar la región a una madre, no asignar ninguna madre o eliminar la región. Ya que los datos de las yemas se sumarán a los de la madre durante el análisis final y final. No fusiones una región de yemas con su madre.

Inspeccione visualmente los datos de cada fotograma hasta el último momento de interés. No es necesario para toda la serie temporal. Si no utiliza las tramas posteriores, asegúrese de guardar los cambios una vez que se hayan inspeccionado todas las regiones de la celda durante el período de tiempo de interés, los datos de todos los canales de fluorescencia y cómo cambian con el tiempo están listos para ser emitidos.

Inserte el análisis de series temporales para analizar las series temporales de celdas completas a lo largo del tiempo. Calcule la información del ciclo celular y tome derivados. Se abrirá una ventana que permite la selección de las mediciones de interés y la introducción de los parámetros de análisis.

Los parámetros predeterminados de suavizado y asignación de ciclo celular funcionan bien para las cepas haplo y diploides visualizadas en intervalos de cinco minutos, pero es posible que deban variarse para obtener los mejores resultados. Cuando se establecen todos los parámetros, seleccione analizar para exportar datos de series temporales de una sola célula como se describe en el protocolo de texto, Un experimento realizado y analizado con éxito producirá series de tiempo en su mayoría continuas para células enteras individuales con tiempos de emergencia y división asignados de manera realista para una cepa de levadura de halo que expresa una copia integrada de la proteína fluorescente Ian o CFP impulsada por el constituyente de un promotor DH uno. Las mediciones de células enteras a lo largo del tiempo se obtuvieron a partir del análisis de series temporales.

Las imágenes de campo claro muestran la célula madre segmentada en azul y sus brotes en verde. Con la célula entera contigua delineada en rojo, surge una dependencia del ciclo celular tanto para el volumen como para la expresión. Aquí, las regiones ralladas muestran cuando la celda está en SG dos M y tiene una yema, la brotación comienza en la transición de G uno a S de blanco a gris.

El sombreado y la división celular ocurren en la M a G, una transición de sombreado gris a blanco después de la formación de brotes. El volumen total combinado aumenta más rápidamente que antes, pero la concentración de proteínas o la intensidad media disminuyen ligeramente. El aumento de la proteína integrada combinada también se acelera después de la gemación en comparación con la región madre sola.

Estos resultados demuestran la importancia de incorporar adecuadamente las contribuciones de yemas a la medición de toda la celda y resaltan la necesidad de una formación adecuada de yemas y asignaciones de tiempo de división. Las series temporales diferenciadas se pueden utilizar para calcular un nivel relativo instantáneo de ARNm y una tasa de transcripción, que también aumentan después de la gemación la capacidad de generar un tiempo estable. Las derivadas de las series temporales de medición también benefician a los estudios cinéticos que utilizan el sistema de expresión conmutable descrito en el protocolo de texto.

Un análisis de series temporales muestra cuándo se localiza el factor de transcripción en el núcleo y cuándo se inicia y se detiene el gen diana. La transcripción que se muestra aquí son micrografías de los cuatro canales de adquisición indicados para una célula con un activador trans PHO 4 Tet R fusionado con YFP conmutable. El activador trans se localiza en el núcleo marcado con RFP en respuesta a un bajo contenido de fosfato e impulsa la expresión de un promotor de siete X Tet O, reportero de CFP.

La tasa de transcripción inferida cambia con la localización en promedio y a nivel de una sola célula. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros análisis de los datos de series temporales multidimensionales de una sola célula para responder a preguntas adicionales, como ¿cómo varía la expresión en la población a lo largo del tiempo? ¿Los efectos de las fluctuaciones extrínsecas se heredan a lo largo de varias generaciones?

¿Cambia la cinética de activación génica tras la reactivación? ¿Juega un papel el ciclo celular y muchas otras cuestiones que requieren expresión génica, crecimiento y trayectorias de linaje de células individuales?