Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Bei diesem Verfahren handelt es sich um die Besiedlung des Murn-Nasopharynx mit einer Streptokokken-Pneumonie und die anschließende Extraktion von kolonisierenden Bakterien sowie adhärenten oder rekrutierten Zellen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein bakterielles Inokulum der S-Pneumonie hergestellt wird. Stamm des Interesses.

Das lebende Bakterium wird dann intranasal in anästhesierte Mäuse verabreicht, während sie sich in einem Rückhalteapparat befinden. Nach der gewünschten Besiedlungsdauer werden die Mäuse dann eingeschläfert und Nasenspülungen durchgeführt, indem ihre freiliegenden Luftröhren kanüliert und der Inhalt durch die Nasen ausgespült wird. Die in Nasenspülungen vorhandene Bakterienzahl kann mit mikrobiologischen Techniken quantifiziert werden. Alternativ können Immunantworten entweder mit Durchflusszytometrie-Techniken zur Phänotypisierung rekrutierter Zellen oder mit quantitativen PCR-Techniken getestet werden.

Um die Menge an exprimierter mRNA von Interesse zu messen, bevor Sie beginnen, müssen Sie Maus-Fesseln für den intranasalen Besiedlungsteil des Verfahrens und kanülierte Nadeln für die Nasenspülungen vorbereiten. Ein Mäuse-Zurückhaltesystem kann einfach durch Abschneiden der spitz zulaufenden Spitze eines 50-Milliliter-Falkenröhrchens hergestellt werden. Sobald du die Blende erstellt hast, stelle sicher, dass du eine Schere verwendest, um alle scharfen Enden zu polieren.

Für die Aufbereitung von kanülierten Nadeln benötigen Sie folgenden PE 20 Polyethylenschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,38 Millimetern. Eine Mil-Spritze ist mit 26 und drei abgeschrägten Nadeln mit acht Gauge, einer scharfen, feinen Iris, einer Schere und einer Pinzette bedeckt. Schneiden Sie den PE 20-Schlauch mit der feinen Schere in etwa 2,5 Zentimeter lange Stücke und achten Sie darauf, dass jedes Ende eine abgeschrägte Spitze hat.

Schieben Sie mit der Pinzette vorsichtig eines dieser Stücke auf die Spitze Ihrer Nadel. Um ein Durchstechen der Schlauchseite zu vermeiden, können kanülierte Nadeln bis zur Verwendung in 70 % Ethanol aufbewahrt und direkt vor der Verwendung mit PBS gespült werden. Für die intranasale Besiedlung von Mäusen mit S pmo empfehlen wir eine Konzentration von 10 bis neun koloniebildenden Einheiten pro mil, die in 10 Mikrolitern abgegeben werden.

Für eine letzte Dosis von 10 bis sieben KBE halten Sie das Inokulum bis kurz vor der Anwendung auf Eis und achten Sie darauf, zwischen jeder Besiedlung zu rühren. Neben dem Inokulum benötigen Sie auch eine P 10 oder P 20 Pipette, sterilisierte Pipettenspitzen und Ihren Maus-Restrain. Isolieren Sie eine einzelne Maus an ihrem Schwanz und halten Sie sie fest, indem Sie sie in Ihr zuvor vorbereitetes Maushaltegerät legen.

Wenn Sie Schwierigkeiten haben, die Maus in den Rückhaltebehälter zu lenken, kann es hilfreich sein, sie vor und über der Maus zu positionieren, damit das Tier nach oben kriechen kann. Sobald sich die Maus in der Zurückhaltung befindet, befestigen Sie sie an der Basis ihres Körpers und drücken Sie sie vorsichtig nach oben, so dass ihre Nase aus dem spitz zulaufenden Ende der Zurückhaltung herausragt. Mit einer P 10- oder P 20-Pipette impfen Sie jede Maus, indem Sie 10 Mikroliter der vorbereiteten Kultur abgeben und gleichmäßig auf beide verteilen. Nares.

Lassen Sie das Inokulum in die Nase tropfen, indem Sie die Inokulation allmählich pulsieren und sich die Zeit nehmen, die die Maus benötigt, um das Inokulum einzuatmen. Die Maus kann einen Teil des Inokulums aus der Nase niesen, was zu erwarten ist. Beachten Sie, dass Mäuse für dieses Verfahren anästhesiert werden sollten, um sicherzustellen, dass die Bakterien im Nasopharynx lokalisiert bleiben und sich nicht auf die unteren Atemwege ausbreiten.

Für die Zwecke dieser Demonstration impfen wir mit PBS, aber wenn wir mit lebenden Bakterien arbeiten, stellen Sie sicher, dass das Verfahren gemäß den vom Institut genehmigten Richtlinien durchgeführt wird. Zum Beispiel verlangen die meisten Institutionen, dass die Besiedlung in einer Haube der Biosicherheitsstufe zwei durchgeführt wird. Wenn Sie Gewichtsindikatoren als Teil Ihrer Endpunktüberwachungsmethode verwenden, überwachen Sie die Maus unmittelbar nach der Besiedlung alle 12 bis 24 Stunden auf klinische Symptome wie Lethargie, zerzaustes Fell und Gewichtsverlust.

Sobald Mäuse besiedelt sind, halten Sie sie für die gewünschte Zeit. Am Ende dieser Zeit werden die Mäuse eingeschläfert und eine Nasenspülung durchgeführt, da eine Gebärmutterhalsluxation die Luftröhre möglicherweise schädigen kann. Diese Methode der Euthanasie muss vermieden werden.

Stellen Sie vor der Durchführung von Nasenspülungen sicher, dass Sie Folgendes zur Hand haben. Zuvor vorbereitete kanülierte Nadeln, 70% wässriges Ethanol, eine Pinzette, eine scharfe feine Irisschere, Phosphat, gepufferte Kochsalzlösung, RNA-Lysepuffer und ein mil Einor-Röhrchen. Wenn Sie bereit sind zu beginnen, legen Sie das Tier flach auf den Rücken und sterilisieren Sie mit 70 % wässrigem Ethanol die Vorderseite seines Fells, insbesondere den Halsbereich.

Darauf zu achten, dass Ethanol nicht in die Nasenlöcher gelangt. Machen Sie einen einzigen Längsschnitt entlang der Mittellinie des Halses des Tieres und ermöglichen Sie es Ihnen, eine Öffnung zu schaffen, durch die Sie sich die Luftröhre vorstellen können. Ziehen Sie die Haut vorsichtig zu beiden Seiten zurück und legen Sie das darunter liegende Halsgewebe frei.

Zu diesem Zeitpunkt sollte die Luftröhre sichtbar sein, die auf beiden Seiten von Längsmuskeln umgeben ist. Schneiden Sie diese vorsichtig ab, um einen freien Blick auf die Luftröhre selbst zu haben, und achten Sie darauf, das umgebende Gefäßsystem nicht zu durchtrennen. Für den Fall, dass Sie versehentlich das Gefäßsystem durchtrennt haben und Blut in der Region vorhanden ist, bevor Sie fortfahren.

Lassen Sie die Blutung aufhören und reinigen Sie den Bereich dann mehrmals, indem Sie steriles PBS abgeben und sterile Gaze verwenden, um überschüssige Feuchtigkeit sanft aufzusaugen. Sobald die Luftröhre richtig freigelegt ist, machen Sie einen quer verlaufenden halbmondförmigen Schnitt in der Luftröhre etwa auf halber Höhe. Geben Sie steriles PBS in eine kanülierte Spritze.

Führen Sie die Kanüle in die Luftröhre in Richtung Nase ein und halten Sie die abgeschrägte Kante nach unten, um das Einführen zu erleichtern. Sobald die Kanüle an Ort und Stelle ist, drehen Sie sie um 180 Grad und sondieren Sie sanft nach oben, bis Sie einen leichten Widerstand spüren. Platzieren Sie das für die Probenentnahme vorgesehene EEND DPH-Röhrchen direkt unter der Nase der Maus.

Testen Sie die korrekte Platzierung der Kanüle, indem Sie eine minimale Menge PBS-Spülflüssigkeit abgeben. Im Anschluss daran sollte sich ein Flüssigkeitstropfen um das NAS der Maus bilden, wenn die Kanüle richtig platziert ist. Wenn das Test-PBS direkt aus dem Maul des Tieres austritt, ziehen Sie die Kanüle zurück und positionieren Sie sie erneut, indem Sie vorsichtig nach vorne tasten, bis ein sehr geringer Widerstand zu spüren ist.

Achten Sie darauf, die Kanüle nicht zu weit über diesen Widerstand hinaus zu schieben, da Sie sie am Nasengaumen vorbei in die Mundhöhle bewegen. Sobald Sie sich vergewissert haben, dass die Kanüle richtig positioniert ist, fahren Sie mit der schnellen Abgabe von 200 Mikrolitern PBS fort, um die maximale Menge an Zellen zu verdrängen und zu sammeln. Der Inhalt sollte durch die Nasenlöcher der Maus in das Sammelrohr fließen.

Legen Sie die Probe sofort auf Eis. Diese Proben können anschließend sowohl auf die Bakterienlast als auch auf die zelluläre Rekrutierung untersucht werden. Um Proben für die RNA-Analyse zu entnehmen, verwenden Sie eine separate kanülierte Nadel mit 500 Mikrolitern RNA-Lysepuffer, um eine sekundäre Nasenspülung durchzuführen.

Beachten Sie, dass der RNA-Lysepuffer das Epithel entblößt und das umliegende Gewebe zerstört. Es muss also darauf geachtet werden, dass der Kontakt mit Organen wie der Lunge vermieden wird. Wenn eine Reretention dieses Gewebes gewünscht wird, um die nasopharyngeale Bakterienlast zu quantifizieren, benötigen Sie Folgendes.

Epicor-Röhrchen, mikrobiologische Platten mit Triptychon-Sojaei, werden mit 5 % Schafsblut ergänzt. Ein Vortex-Mischer, sterile PBS-Pipettenspitzen und P 20- und P 200-Pipetten. Bereiten Sie zunächst in einer BSL-Haube mit zwei Hauben eine serielle Verdünnungsreihe für jede Mirin-Nasenspülprobe vor.

Im Allgemeinen ist mit Konzentrationen von S pneumoniae im Nasopharynx zwischen null und 10 bis vier KBE zu rechnen. Führen Sie daher drei zehnfache Reihenverdünnungen durch, geben Sie 10 Mikroliter der sauberen Nasenspülprobe in das erste Röhrchen bis zu einer Konzentration von 10 zu minus einer KBE pro mil und fahren Sie mit der Abwärtsbewegung fort, bis Sie drei verdünnte Proben übermäßig verdünnt haben, die zwischen jeder Verdünnung gründlich vortexen. Bitte beachten Sie, dass dieses Video nur zu Demonstrationszwecken dient.

Die richtige Labortechnik, einschließlich des Austauschs der Pipettenspitzen zwischen Dilu, sollte immer eingehalten werden. Mit einem Edding teilen Sie es zurück zu Ihrer logischen Platte in Quadranten und beschriften Sie die Quadranten mit der entsprechenden Verdünnung, die darauf plattiert werden soll. Verteilen Sie drei Tropfen mit 10 Mikrolitern Proben jeder Ihrer Verdünnung auf der Agarplatte. Lassen Sie diese 15 bis 30 Minuten unbedeckt trocknen, decken Sie dann die Platten ab und legen Sie sie kopfüber in einen Bakterieninkubator mit optimalen Bedingungen für das Pneumokokkenwachstum, typischerweise 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Inkubieren Sie diese Platten 24 bis 48 Stunden lang. Entfernen Sie nach dieser Zeit die Platten und bestimmen Sie die Anzahl der besiedelnden Bakterien, indem Sie die auf der Platte gebildeten Kolonien mitteln. Bei jeder Verdünnung können die Animo-Kolonien an ihrer charakteristischen beigen Farbe identifiziert werden, an ihren Zonen der Alpha-Hämolyse, bei denen es sich um kleine Halos um jede Kolonie handelt, die durch die bakterielle Verdauung des Blutzusatzes im Agar entstehen.

Und schließlich durch kleine Vertiefungen in der Mitte jeder Kolonie, die ihr das Aussehen eines Erythrozyten verleihen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein solides Verständnis dafür haben, wie man eine nasopharyngeale ES PMO etabliert, wie man eine Besiedlung in einer Maus herstellt, wie man Bakterien und Zellen aus dem Nasopharynx einer Maus nach der Besiedlung isoliert, wie man eine Nasenspülung verwendet und wie man die entsprechende Bakterienlast mit mikrobiologischen Techniken quantifiziert. Wir hoffen, dass die in diesem Video beschriebenen Methoden Sie dazu ermutigen, ein intranasales Besiedlungsmodell zu verwenden, um die Reaktionen des Wirts auf Krankheitserreger im Kontext dieser wenig untersuchten Region zu untersuchen.