Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Dieses Verfahren beinhaltet die Besiedlung der murinen Nasopharynxregion mit Streptococcus pneumoniae und die anschließende Gewinnung der kolonisierenden Bakterien sowie der anhaftenden oder rekrutierten Zellen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein bakterielles Inokulum des gewünschten S. pneumoniae-Stamms hergestellt wird.

Die lebenden Bakterien werden anschließend intranasal in anästhetisierte Mäuse verabreicht, während diese in einer Fixiervorrichtung liegen. Nach der gewünschten Dauer der Besiedlung werden die Mäuse euthanasiert und nasale Spülungen durchgeführt, indem die freiliegenden Luftröhren kaniert und deren Inhalt durch die Nase ausgespült wird. Die in den nasalen Spülungen vorhandene Bakterienanzahl kann mithilfe mikrobiologischer Methoden quantifiziert werden. Alternativ können Immunantworten entweder mittels Durchflusszytometrie zur Phänotypisierung rekrutierter Zellen oder mittels quantitativer PCR-Methoden analysiert werden.

Um die Expressionsebenen des gewünschten mRNA vor Beginn zu messen, müssen Sie Maushalterungen für den intranasalen Kolonisationsabschnitt des Verfahrens sowie kaniülierte Nadeln für die nasalen Spülungen vorbereiten. Eine Maushaltung kann einfach hergestellt werden, indem die sich verjüngende Spitze eines 50-Milliliter-Falcon-Röhrchens abgeschnitten wird. Sobald Sie die Öffnung angefertigt haben, vergewissern Sie sich, dass Sie mit einer Schere alle scharfen Kanten abschleifen.

Für die Herstellung von kanülierten Nadeln benötigen Sie die folgenden Materialien: PE-20-Polyäthylenröhrchen mit einem Innendurchmesser von 0,38 Millimetern. Eine Einwegspritze ist mit 26 und drei acht Zoll langen, schräg abgeschnittenen Nadeln verschlossen, sowie eine Schere mit scharfen, feinen Klingen und eine Pinzette. Schneiden Sie das PE-20-Röhrchen mit der feinen Schere in etwa 2,5 Zentimeter oder einen Zoll lange Stücke, wobei sichergestellt werden muss, dass jedes Ende eine abgeschrägte Spitze aufweist.

Vorsichtig mit der Pinzette eines dieser Stücke auf die Nadelspitze schieben. Um ein Durchstechen der Schlauchseite zu vermeiden, können kanülierte Nadeln bis zur Verwendung in 70 % Ethanol aufbewahrt und unmittelbar vor Gebrauch mit PBS gespült werden. Für die intranasale Kolonisation von Mäusen mit S. pmo empfehlen wir eine Konzentration von 10^9 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter, verabreicht in 10 Mikrolitern.

Für eine endgültige Dosis von 10 hoch 7 KBE muss das Inokulum bis unmittelbar vor der Anwendung auf Eis gehalten werden, und es ist darauf zu achten, dass zwischen jeder Kolonisation eine Vermischung erfolgt. Zusätzlich zum Inokulum benötigen Sie eine P 10- oder P 20-Pipette, sterile Pipettenspitzen und Ihren Maushalter. Isolieren Sie eine einzelne Maus am Schwanz und fixieren Sie sie, indem Sie sie in die zuvor vorbereitete Maushaltervorrichtung einsetzen.

Wenn Sie Schwierigkeiten haben, die Maus in den Fixierapparat zu lenken, kann es hilfreich sein, diesen vor und über die Maus zu positionieren, sodass das Tier nach oben kriechen kann. Sobald sich die Maus im Fixierapparat befindet, fixieren Sie sie, indem Sie vorsichtig am Körperboden entlang nach oben drücken, bis ihre Nase aus dem verjüngten Ende des Fixierapparats hervortritt. Inokulieren Sie jede Maus mithilfe einer P 10- oder P 20-Pipette, indem Sie 10 Mikroliter der vorbereiteten Kultur applizieren und diese gleichmäßig auf beide Nasenöffnungen verteilen.

Lassen Sie den Inokulum tropfenweise in die Nase gelangen, indem Sie die Inokulation schrittweise pulsierend durchführen und dabei die Zeit einhalten, die die Maus benötigt, um das Inokulum einzuatmen. Es ist normal, dass die Maus einen Teil des Inokulums durch Niesen wieder aus der Nase ausscheidet. Beachten Sie, dass die Mäuse für diesen Eingriff anästhesiert sein sollten, um sicherzustellen, dass die Bakterien auf den Nasopharynx beschränkt bleiben und sich nicht im unteren Respirationstrakt ausbreiten.

Zu Demonstrationszwecken impfen wir mit PBS; wenn jedoch mit lebenden Bakterien gearbeitet wird, muss das Verfahren stets gemäß der vom Institut genehmigten Richtlinien durchgeführt werden. Beispielsweise verlangen die meisten Einrichtungen, dass die Kolonisation in einer Sicherheitswerkbank der Biosicherheitsstufe zwei erfolgt. Falls Gewichtsanzeigen Teil Ihrer Methode zur Endpunktüberwachung sind, überwachen Sie die Mäuse unmittelbar nach der Kolonisation alle 12 bis 24 Stunden auf klinische Symptome wie Lethargie, gesträubtes Fell und Gewichtsverlust.

Nach der Kolonisierung der Mäuse sollten diese über den gewünschten Zeitraum gehalten werden. Am Ende dieses Zeitraums werden die Tiere euthanasiert, und eine nasale Lavage wird durchgeführt, da eine zervikale Dislokation möglicherweise die Trachea beschädigen kann. Diese Euthanasie-Methode muss vermieden werden.

Bevor Sie Nasenspülungen durchführen, stellen Sie sicher, dass Sie Folgendes bereitliegen haben: zuvor präparierte kanülierte Nadeln, 70 %igen wässrigen Ethanol, eine Pinzette, eine scharfe feine Iris-Schere, phosphatgepufferte Salzlösung, RNA-Lysepuffer und 1,5-mL-Eppendorfgefäße. Sobald Sie bereit sind, legen Sie das Tier flach auf den Rücken und desinfizieren mit 70 %igem wässrigem Ethanol das Fell, insbesondere den Nackenbereich.

Beachten Sie, dass kein Ethanol in die Nasenöffnungen gelangt. Führen Sie einen einzigen Längsschnitt entlang der Körpermitte des Halses des Tieres durch, um eine Öffnung zu schaffen, durch die die Luftröhre sichtbar wird. Klappen Sie die Haut vorsichtig nach beiden Seiten zurück, um das darunterliegende Halsgewebe freizulegen.

An diesem Punkt sollte die Luftröhre sichtbar sein, umgeben von den längs verlaufenden Muskeln an beiden Seiten. Schneiden Sie diese vorsichtig durch, um eine klare Sicht auf die Luftröhre selbst zu erhalten, und achten Sie darauf, die umgebende Gefäßversorgung nicht zu verletzen. Falls Sie versehentlich die Gefäße durchtrennen und Blut in der Region vorhanden ist, bevor Sie fortfahren.

Lassen Sie die Blutung stoppen und reinigen Sie die Stelle anschließend mehrmals, indem Sie sterile PBS-Lösung zugeben und sterile Mullbinden verwenden, um überschüssige Feuchtigkeit vorsichtig aufzusaugen. Sobald die Luftröhre ausreichend freigelegt ist, führen Sie einen quer verlaufenden, halbmondförmigen Schnitt in der Luftröhre etwa auf halber Höhe durch. Geben Sie sterile PBS-Lösung in eine kanülierte Spritze.

Führen Sie die Kanüle in die Luftröhre in Richtung Nase ein, wobei die abgeschrägte Kante zur leichteren Insertion nach unten weist. Sobald die Kanüle sitzt, drehen Sie sie um 180 Grad und tasten vorsichtig nach oben, bis ein leichter Widerstand spürbar ist. Bringen Sie die für die Probenentnahme vorgesehene EEND-DPH-Röhre direkt unterhalb der Nase der Maus an.

Überprüfen Sie die korrekte Platzierung der Kanüle, indem Sie eine minimale Menge PBS-Spüllösung austragen. Danach sollte sich bei korrekter Positionierung der Kanüle ein Flüssigkeitstropfen um die NAS der Maus bilden. Wenn die Testlösung PBS direkt aus dem Mund des Tieres austritt, ziehen Sie die Kanüle zurück und positionieren Sie sie erneut, indem Sie vorsichtig nach vorne tasten, bis ein geringer Widerstand spürbar ist.

Achten Sie darauf, den Kanülenstil nicht zu weit über diesen Widerstand hinaus vorzuschieben, da er sonst das nasale Gaumendach passieren und in die Mundhöhle gelangen könnte. Sobald Sie bestätigt haben, dass sich die Kanüle in der korrekten Position befindet, geben Sie schnell 200 Mikroliter PBS frei, um eine maximale Zahl an Zellen zu mobilisieren und zu sammeln. Die Flüssigkeit sollte durch die Nasenöffnungen der Maus austreten und in das Sammelgefäß laufen.

Das Probenmaterial sofort auf Eis stellen. Diese Proben können anschließend auf den bakteriellen Befall sowie die Zellrekrutierung untersucht werden. Um Proben für die RNA-Analyse zu gewinnen, verwenden Sie eine separate Kanüle, die 500 Mikroliter RNA-Lysepuffer enthält, um eine sekundäre nasale Lavage durchzuführen.

Beachten Sie, dass der RNA-Lysepuffer das Epithel entfernt und das umliegende Gewebe zerstört. Daher ist Vorsicht geboten, um einen Kontakt mit Organen wie den Lungen zu vermeiden. Falls eine Erhaltung dieser Gewebe zur Quantifizierung der nasopharyngealen Bakterienlast gewünscht ist, benötigen Sie Folgendes.

Epicor-Röhrchen, mikrobiologische Platten mit Triptich-Soja-Ei-Medium werden mit 5 % Schafsblut ergänzt. Ein Vortex-Mischer, sterile PBS-Pipettenspitzen sowie P-20- und P-200-Pipetten. Zuerst in einer BSL-Stufe-2-Absaughaube arbeiten und für jede Mirin-Nasenspülprobe eine serielle Verdünnungsreihe herstellen.

Im Allgemeinen kann man Konzentrationen von S. pneumoniae im Nasopharynx zwischen null und 10 hoch vier KBE erwarten. Führen Sie daher drei zehnfache serielle Verdünnungen durch, geben Sie 10 Mikroliter der unverdünnten Nasenspülprobe in das erste Reagenzglas, um eine Konzentration von 10 hoch minus eins KBE pro Milliliter zu erhalten, und fahren Sie fort, bis Sie drei Proben verdünnt haben, wobei gründlich zwischen jeder Verdünnung verwirbelt wird. Bitte beachten Sie, dass dieses Video nur zu Demonstrationszwecken dient.

Korrekte Labortechnik, einschließlich des Wechsels der Pipettenspitzen zwischen Verdünnungen, sollte stets beachtet werden. Teilen Sie die Platte mit einem Edding in vier Quadranten und beschriften Sie die Quadranten mit der entsprechenden Verdünnung, die darauf ausplattiert werden soll. Platieren Sie jeweils drei Tropfen von 10 Mikroliter-Proben jeder Verdünnung auf die Agarplatte aus. Lassen Sie diese 15 bis 30 Minuten unbedeckt trocknen, decken Sie die Platten danach ab und stellen Sie sie verkehrt herum in einen Bakterieninkubator unter optimalen Bedingungen für das Wachstum von Pneumokokken, typischerweise bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Inkubieren Sie diese Platten 24 bis 48 Stunden. Entfernen Sie danach die Platten und ermitteln Sie die Anzahl kolonisierender Bakterien, indem Sie die auf der Platte gebildeten Kolonien mitteln. Bei jeder Verdünnung können Amino-Kolonien an ihrer charakteristischen beigefarbenen Färbung und an ihren Zonen der alpha-Hämolyse identifiziert werden, die aus kleinen Haloen um jede Kolonie bestehen und durch den bakteriellen Abbau des Blutzusatzes im Agar entstehen.

Und schließlich durch kleine Vertiefungen in der Mitte jeder Kolonie, die ihr das Aussehen einer Erythrozytenform verleihen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein solides Verständnis dafür haben, wie man eine nasopharyngeale Besiedlung bei einer Maus etabliert, wie man Bakterien und Zellen aus der Nasopharynx-Region der Maus nach der Besiedlung mittels Nasenspülung isoliert und wie man die entsprechende bakterielle Belastung mit mikrobiologischen Methoden quantifiziert. Wir hoffen, dass die in diesem Video beschriebenen Methoden Sie dazu ermutigen, ein intranasales Modell der Besiedlung zu nutzen, um Wirt-Antworten auf Pathogene im Kontext dieses bisher wenig erforschten Bereichs zu untersuchen.