Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dissoziationskonstante für eine Proteinligandeninteraktion abzuschätzen. Dies wird erreicht, indem zunächst Mischungen des Proteins mit unterschiedlichen Konzentrationen des Liganden zusammen mit einem Indikatorfarbstoff hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, diese Proben zu erhitzen und gleichzeitig die Fluoreszenz des Indikators aufzuzeichnen, um die Entfaltung des Proteins zu überwachen.

Als nächstes werden die Kurven der Proteinentfaltung in eine Reihe von Schmelztemperaturen umgerechnet. Der letzte Schritt besteht darin, diese Daten an ein geeignetes Modell anzupassen, um die Dissoziationskonstante zu schätzen. Letztendlich wird die dynamische Differenzfluorometrie eingesetzt, um die Wechselwirkung eines Proteins mit seinen Liganden besser zu verstehen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Isothermie, Titration, Kalorimetrie und Oberflächenplasmaresonanz besteht darin, dass diese Methode innerhalb weniger Stunden mit nur moderaten Probenmengen in einem Instrument durchgeführt werden kann, das bereits in den meisten Instituten verfügbar ist. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Proteinchemie zu beantworten, wie z. B. die Affinität von Liganden zu Proteinen und die relative Stärke von Wechselwirkungen. Im Allgemeinen würden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Auswahl der zu verwendenden Stichproben und die Analyse der Daten schwierig sein können.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie die folgenden Lösungen vor. Ein Gemisch, das die in dieser Tabelle aufgeführten Reagenzien und Bestände des interessierenden Liganden in der höchsten verfügbaren Konzentration sowie sechs zehnfache Verdünnungen dieser Konzentration enthält. Wenn aus früheren Daten eine ungefähre Dissoziationskonstante bekannt ist, sind mindestens zwei Konzentrationen über und unter dem kd vorzubereiten.

Eine Beispieltabelle ist hier dargestellt. Aliquotieren Sie 18 Mikroliter des Gemisches in jede der acht Vertiefungen. Geben Sie in der A-Q-P-C-R-Platte zwei Mikroliter Lösungsmittel in die erste Vertiefung, in jede der verbleibenden sieben Vertiefungen, fügen Sie zwei Mikroliter von jedem Mitglied der Ligandenverdünnungsreihe hinzu.

Platzieren Sie die A-Q-P-C-R-Dichtung über der Platte, um eine gute Abdichtung der Platte zu erreichen. Platzieren Sie einen Handapplikator in der Mitte der Platte, streichen Sie die Versiegelung zu einer Seite hin glatt und wiederholen Sie den Vorgang dann auf der anderen Hälfte der Platte. Zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 500 mal G, um Luftblasen zu entfernen.

Platzieren Sie als Nächstes die Platte in einem QPCR-Instrument der ersten Stufe. Wählen Sie die Option Schmelzkurve aus, die die Gesteinsfilter verwenden, und wählen Sie die schnelle Rampengeschwindigkeit. Führen Sie am Ende des Gerätelaufs eine thermische Denaturierung durch.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" auf dem Bildschirm. Speichern Sie die Ergebnisdatei. Öffnen Sie die Software für die thermische Verschiebung des Proteins.

Erstellen Sie auf der Registerkarte "Eigenschaften" eine neue Studie. Geben Sie ihr einen Namen, und geben Sie auf der Registerkarte "Bedingungen" die Liganden an. Wechseln Sie zur Registerkarte Experimentdateien, und importieren Sie die gespeicherte Ergebnisdatei.

Legen Sie den Inhalt der einzelnen Elemente fest. Wechseln Sie zur Registerkarte Analyse und klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren, um die Ergebnisse zu analysieren. Prüfen Sie, ob das Protein in Gegenwart von Lösungsmittel allein ein ähnliches Ergebnis liefert wie in dieser Abbildung gezeigt.

Untersuchen Sie als Nächstes die Schmelztemperaturen, die in den Ergebnissen des Replikatschmerzes beobachtet wurden. Stellen Sie sicher, dass dies einen deutlichen Anstieg der Schmelztemperatur mit zunehmender Ligandenkonzentration zeigt. Diese Daten werden verwendet, um einen ungefähren Wert für die Dissoziationskonstante zu liefern, wie in der Begleitarbeit beschrieben.

Diese Lösungen werden für das Verfahren zur Bestimmung der Dissoziationskonstante benötigt, ein Mastermix, wie in dieser Tabelle beschrieben, und Bestände des Liganden in 15 verschiedenen Konzentrationen, die verzehnfacht werden. Im abschließenden Experiment. Im Idealfall werden Ligandenkonzentrationen eingeschlossen, die mindestens zwei Größenordnungen über und unter der geschätzten kd liegen, und die Konzentrationen auf die geschätzte kd zentriert.

Hier sehen Sie ein Beispiel für eine Verdünnungsreihe. Konzentrieren Sie sich auf sieben der Punkte innerhalb einer Größenordnung der geschätzten KD mit weiteren vier Punkten auf jeder Seite davon. Wenn Sie zur Auswahl stehen, fügen Sie weitere Punkte bei Werten ein, die gesättigt sind.

Geben Sie 120 Mikroliter des Mastermixes in jede der acht Vertiefungen in einer 96-Well-Platte mit U-Boden, um als Reservoir für die bequeme Abgabe des Mastermixes zu dienen. Verwenden Sie dann eine Achtkanalpipette, um 18 Mikroliter des Mastermixes in eine Säule einer PCR-Platte zu dosieren. Wiederholen Sie dies für weitere fünf Säulen, um insgesamt 48 gefüllte Vertiefungen in einem Muster von sechs x acht auf der Platte zu erhalten.

Geben Sie als Nächstes 20 Mikroliter der Ligandenstiele oder des Lösungsmittels in jede der acht Vertiefungen. In einer anderen 96-Well-Platte mit U-Boden aspirieren Sie mit einer Achtkanalpipette zwei Mikroliter von acht verschiedenen Ligandenstämmen oder Lösungsmitteln und fügen diese zu einer Säule der PCR-Platte hinzu, die mit dem Mastermix gefüllt wurde. Wiederholen Sie den Vorgang mit denselben acht Liganden oder Lösungsmittelmaterialien.

Für zwei weitere Säulen aspirieren Sie zwei Mikroliter der verbleibenden acht Liganden- oder Lösungsmittelstöcke und geben diese in eine vierte Säule in der Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für zwei weitere Spalten. Dadurch erhalten Sie dreifache Proben für alle 16 Liganden- und Lösungsmittelproben.

Legen Sie das A-Q-P-C-R-Siegel über die Platte. Die Platte wird zwei Minuten lang bei 500 mal G zentrifugiert. Setzen Sie die Platte in das QPCR-Gerät ein und führen Sie eine thermische Denaturierung mit den zuvor angegebenen Parametern am Ende des Gerätelaufs durch.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" auf dem Bildschirm. Speichern Sie die Ergebnisdatei. Öffnen Sie die Software für die thermische Verschiebung des Proteins.

Erstellen Sie auf der Registerkarte "Eigenschaften" eine neue Studie. Geben Sie ihr einen Namen und beschreiben Sie auf der Registerkarte "Bedingungen" die Liganden. Wechseln Sie zur Registerkarte Experimentdateien, importieren Sie die gespeicherten Ergebnisdateien, und legen Sie den Inhalt der einzelnen Dateien fest.

Wechseln Sie zur Registerkarte "Analyse" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren". Wählen Sie die Registerkarte Replizierungen aus dem Menü auf der linken Seite des Bildschirms, um die Ergebnisse anzuzeigen. In dreifacher Ausfertigung.

Beurteilen Sie die Zuverlässigkeit der Daten anhand der Genauigkeit der Tripladate. Sollten die Triplikate eine schlechte Reproduzierbarkeit aufweisen. Untersuchen Sie die Rohdaten genau.

Analysieren Sie die Daten sowohl mit der Boltman- als auch mit der Ableitungsmethode. Um die Schmelztemperatur zu beurteilen, wählen Sie die Registerkarte Ergebnisse replizieren und schalten Sie im Diagramm der Replikationsergebnisse die Schaltfläche Diagramm nach zwischen tm, boltzmann und TM derivative um. Wählen Sie die Methode aus, die die Reproduzierbarkeit der Probe erhöht.

Bei Proben, die mehrere Übergänge aufweisen, ist es fast immer am besten, die Ableitungsmethode im Mehrfachschmelzmodus zu verwenden. Exportieren Sie die Ergebnisse für weitere Untersuchungen mit Excel über die Registerkarte "Exportieren". Beginnen Sie diese Analyse, indem Sie in Excel eine Tabelle mit den Ligandenkonzentrationen und der Schmelztemperatur erstellen.

Öffnen Sie die GraphPad-Prismensoftware und erstellen Sie eine XY-Tabelle. Geben Sie die Daten in der Spalte X für die Ligandenkonzentrationen und in der Spalte Y für die Ergebnisse der Schmelztemperatur ein. Wählen Sie auf der Registerkarte Analyse die Option Anpassung der nichtlinearen Regressionskurve aus.

Um das richtige Modell einzugeben, wählen Sie Neu und neue Gleichung erstellen. Fügen Sie die entsprechende Gleichung als Ligandenbindung an einer Stelle ein. Aktivieren Sie das Feld Regeln für Anfangswerte, und geben Sie Regeln für Anfangswerte ein.

Beschränken Sie den Parameter P auf konstant gleich, um die Endkonzentration des Proteins einzugeben. Wählen Sie Analysieren aus, um die Analyse durchzuführen, zusätzliche Analysen, um Daten an ein kooperatives Modell anzupassen oder Daten an Kurven anzupassen. Das Zeigen von binären Verschiebungen der Schmelztemperatur wird im begleitenden Protokolltext beschrieben.

Diese Methode wurde verwendet, um die Wechselwirkung von Hexokinase mit Glukose zu messen. Ein erstes Screening deutet auf eine wahrscheinliche KD von 0,2 bis 1,7 Millimolar hin. Die Ergebnisse eines größeren Screenings zeigen eine gute Anpassung an das Modell für ein einzelnes Bindungsereignis mit einer KD von 1,2 plus oder minus 0,1 Millimolar, die mutmaßliche HETO SQUA L Transferase WCBM zeigt eine starke thermische Verschiebung bei der Bindung an GTP.

Ein erstes Screening deutete auf eine KD von 200 bis 500 Mikromolaren hin. Ein detailliertes Experiment deutet auf eine scheinbare KD von 120 plus oder minus 20 Mikromolar hin. Wenn jedoch eine logarithmische Skala für die X-Achse verwendet wird, gibt es eine signifikante Diskrepanz zwischen dem Modell und der Datenanalyse derselben Daten mit einem kooperativen Modell, das eine hervorragende Übereinstimmung mit den Daten zeigt, was bedeutet, dass WCBM in seiner Bindung an GTPA antikooperativ ist, ein eher ungewöhnliches Ergebnis wird mit dem mutmaßlichen BIP beobachtet 60, oxy Beta D mano, Heur two oh, ACE WCBI.

Ohne Liganden und bei hohen Ligandenkonzentrationen wird ein einfaches monophasisches Schmelzmuster beobachtet. Bei mittleren Ligandenkonzentrationen werden jedoch zwei unterschiedliche Schmelzpeaks beobachtet. Der Übergang zwischen den beiden Peaksätzen ist dosisabhängig über den gesamten Konzentrationsbereich der Modellierung des biphasischen Schmelzens.

Als Summe eines Anteils des Liganden passen die Ergebnisse des freien und hohen Liganden gut zu den Daten. Diese Anpassung wird verbessert, indem das für eine hohe Ligandenkonzentration beobachtete Ergebnis auf eine vollständige Belegung extrapoliert wird. Die Daten, die für den Anteil von WCBI an den Liganden erhalten wurden, zeigen eine hervorragende Anpassung an ein einfaches Bindungsmodell.

Mit einer KD von 58 plus oder minus zwei Mikromolaren Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier oder fünf Stunden durchgeführt werden, einschließlich Wiederholungen, wenn sie richtig ausgeführt wird Nach diesem Verfahren. Andere Methoden wie die Tiptop-Venenfluoreszenz und die isotherme Titrationskalorimetrie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Temperaturabhängigkeit und STA-Geometrie zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Schätzung für die Dissoziationskonstante einer Interaktion mit Hilfe der differenziellen Scanning-Grippe bestimmen können.