Name: Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Lernen Sie die differentielle Scanning-Fluorimetrie zur Bestimmung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Schätzung von Dissoziationskonstanten mit moderaten Probenmengen.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des BBSRC (Fördernummer BB/H019685/1 und BB/E527663/1) an die Universität Exeter finanziert.

1. Bestimmung der einen Näherungswert für die Dissoziationskonstante (dh innerhalb einer Größenordnung) <ol><li> Bereiten Sie die Mischung in Tabelle 1 aufgeführt. </li><li> Bereiten Bestände der Liganden von Interesse bei der höchsten Konzentration vorhanden, und dann bei sechs von zehn fache Verdünnungen davon. Wobei eine ungefähre Kd ist aus dem Stand Daten bekannt, zielen darauf ab, die mindestens zwei Konzentrationen oberhalb und unterhalb der K d haben. </li><li> 18 ul Aliquots der Mischung in acht Vertiefungen einer Platte qPCR. Add 2 ul Lösungsmittel in die erste Vertiefung. Add 2 ul jedes Mitglied des Ligand-Verdünnungsreihe (Schritt 1.2) in eine Vertiefung jedes der verbleibenden sieben Vertiefungen. </li><li> Legen Sie eine qPCR-Dichtung über der Platte. Um eine gute Abdichtung der Platte zu erreichen, legen Sie eine Hand Applikator (siehe Tabellen von spezifischen Reagenzien) in der Mitte der Platte. Glätten die Dichtung an einer Seite und dann auf der anderen Hälfte wiederholendie Platte. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g für zwei Minuten, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Die Platte wird in einem StepOne qPCR Instrument. Wählen Sie das &quot;Melt Kurve&quot;-Option, die ROX-Filter, und wählen Sie die schnelle Änderungsgeschwindigkeit (dies einen 2 min Pause bei 25 ° C, gefolgt von einer Rampe bis 99 ° C über 40 min, und dann eine 2 Minuten Pause). Führen Sie einen thermischen Denaturierung. HINWEIS: Script-Dateien für die Durchführung einer Lauf sind online unter http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Zum Abschluss des Instruments auszuführen, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Analysieren&quot; auf dem Bildschirm. Speichern Sie das Ergebnis Datei. </li><li> Öffnen Sie die Shift-Protein Thermal-Software. <ol><li> Erstellen Sie eine neue Studie; im Eigenschaften-Registerkarte, geben diesem einen Namen, und in der Registerkarte Bedingungen, Detail die Liganden. </li><li> Bewegen Sie die Registerkarte Experiment Dateien, und importieren Sie die Datei gespeicherten Ergebnisse (XXX.eds) und stellen den Inhalt der einzelnen Brunnen (fil-Vorlagees sind von den Autoren). </li><li> Bewegen Sie die Registerkarte Analyse, und drücken Sie die &quot;Analyze&quot;-Taste. HINWEIS: Diese werden die Ergebnisse analysieren. Es ist möglich, die Ergebnisse für die weitere Untersuchung mit Excel auf der Registerkarte Export exportieren. Die Ergebnisse werden in einem Register abgegrenzt Format exportiert. Es ist am besten, um die exportierte Datei in Excel öffnen, und sofort im Excel-Format speichern. </li></ol></li><li> Zu überprüfen, dass das Protein in der Gegenwart von Lösungsmittel allein ergibt ein ähnliches Ergebnis wie in 1A gezeigt. Weiter, überprüfen Sie die in den Ergebnissen in der &quot;Replikat&quot; Scheibe beobachtete Schmelztemperaturen. Stellen Sie sicher, dass dies zeigt einen deutlichen Anstieg der Schmelztemperatur mit zunehmender Ligandenkonzentration. HINWEIS: Idealerweise wird dies ein deutliches Maximum Schmelztemperatur (unter der Annahme, dass das Protein vollständig Liganden gebunden ist) und eine ungefähre Kd bereitzustellen, wo die Schmelztemperatur ist auf halbem Weg zwischen dem Liganden-freie Protein unddas Maximum. </li></ol> 2. Versuchsaufbau zur Bestimmung der Dissoziationskonstante <ol><li> Vorbereitung der Mischung in Tabelle 2 als Master Mix beschrieben. </li><li> Bereiten Aktien des Liganden mit fünfzehn verschiedenen Konzentrationen, die das Zehnfache im letzten Experiment verdünnt wird. Idealerweise sind Konzentrationen mindestens zwei Größenordnungen oberhalb und unterhalb der geschätzten K d, und in der Mitte die Konzentrationen auf der geschätzten K d. Konzentrieren sich auf sieben der Punkte innerhalb einer Größenordnung des geschätzten K D, vier weitere Punkte auf jeder Seite von diesem; wenn es eine Wahl, umfassen mehr Punkte auf Werte, die Sättigung sind. HINWEIS: Wenn notwendig, machbar, um die Versuchsbedingungen zu ändern, so dass die Liganden-Aktien zum doppelten experimentelle Konzentration, wo Liganden Löslichkeit ist die Begrenzung sind ist es. </li><li> Fügen Sie 120 ul des Master-mischen bis acht Vertiefungen einer U-förmigen Platte mit 96 Vertiefungen, um als Reservoir für bequeme Abgabe des Mastermixes handeln. Verwenden Sie einen 8-Kanal-Pipette bis 18 ul in eine Spalte einer PCR-Platte zu verzichten. Wiederholen Sie für weitere fünf Säulen, auf insgesamt 48 gefüllte Vertiefungen in einer 6 x 8 Muster auf der Platte geben. </li><li> Mit 20 ul der Liganden Aktien oder des Lösungsmittels in die Vertiefungen in einer U-förmigen Platte mit 96 Vertiefungen zu trennen. Mit einem 8-Kanal-Pipette absaugen 2 ul von acht verschiedenen Liganden Aktien (oder Lösungsmittel). Fügen Sie diese auf eine Spalte der PCR-Platte, die mit Master-Mix in Schritt 2.3 gefüllt war. Wiederholen Sie mit den gleichen acht Liganden / Lösungsmittelvorräte für zwei weitere Säulen. Saugen Sie 2 ul den verbleibenden acht Liganden oder Lösungsmittel Aktien, und fügen Sie diese zu einem vierten Spalte in der Platte. Wiederholen Sie dies für zwei weitere Säulen. Dies wird dreifachen Proben für alle 16 Liganden und Lösungsmittel Proben geben. </li><li> Legen Sie eine qPCR Dichtung über die Platte (siehe Schritt 1.4). </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g fürzwei min. </li><li> Die Platte wird in der qPCR Instrument. Führen Sie einen thermischen Denaturierung mit den in Schritt 1.6 angegebenen Parametern. </li><li> Zum Abschluss des Instruments auszuführen, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Analysieren&quot; auf dem Bildschirm. Speichern Sie das Ergebnis Datei. </li><li> Öffnen Sie die Shift-Protein Thermal-Software. Erstellen Sie eine neue Studie; im Eigenschaften-Registerkarte, geben diesem einen Namen, und in der Registerkarte Bedingungen, Detail die Liganden. </li><li> Bewegen Sie die Registerkarte Experiment Dateien, und importieren Sie die Datei gespeicherten Ergebnisse (XXX.eds), und stellen Sie die Inhalte jeder gut. HINWEIS: Template-Dateien sind online unter http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Bewegen Sie die Registerkarte Analyse, und drücken Sie die &quot;Analyze&quot;-Taste. <ol><li> Wählen Sie die &quot;Replikate&quot; Registerkarte aus dem Menü auf der linken Seite des Bildschirms, um die Ergebnisse als dreifach zu zeigen. Bewerten Sie die Zuverlässigkeit der Daten auf der Grundlage, wie eng die dreifach sind. Should die dreifach zeigen schlechte Reproduzierbarkeit, untersuchen Sie die Rohdaten eng. </li><li> Analysieren der Daten unter Verwendung sowohl der Boltzmann-Derivative oder Verfahren, um die Schmelztemperatur zu bewerten. Wählen Sie die &quot;Ergebnisse reproduzieren&quot; Registerkarte, und in der &quot;Ergebnisse reproduzieren Handlung&quot;, drücken Sie die &quot;Plot von&quot; Taste zwischen &quot;Tm - Boltzmann&quot; und &quot;Tm - Derivative&quot;. Wählen Sie die Methode, die die höhere Reproduzierbarkeit für die Probe gibt. Exportieren Sie die Ergebnisse zur weiteren Untersuchung mit Excel über die Registerkarte Export. HINWEIS: Für die Proben, die mehrere Übergänge zeigen, ist es fast immer am besten, um die Derivate-Methode in mehreren Schmelze-Modus verwenden. Die Ergebnisse werden in einem Register abgegrenzt Format exportiert. Es ist am besten, um die exportierte Datei in Excel öffnen, und sofort im Excel-Format speichern. </li><li> Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal, darunter eine Wiederholung an einem anderen Tag, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Sollte die Datenanalyse (siehe Schritt 3 unten)zeigen, dass der Wert von K d unterscheidet sich deutlich von der ursprünglichen Schätzung, verändern die Ligandenkonzentrationen entsprechend (siehe Schritt 2.2), um eine gute Auswahl von Werten um K d zu gewährleisten. </li></ol> 3. Datenanalyse, um die Dissoziation bestimmen, unter thermischen Denaturierung Constant <ol><li> Erstellen Sie eine Tabelle in Excel der Liganden-Konzentrationen und die Schmelztemperatur. </li><li> Öffnen Sie die GraphPad Prism Software und ein XY-Tabelle zu erstellen. Geben Sie die Daten mit Hilfe der X-Spalte für den Liganden-Konzentrationen und der Y-Spalte für die Schmelztemperatur Ergebnisse. Hinweis: Ein Beispiel ist gezeigt 1B. Ein Skript mit den Gleichungen vorgeladen, und alternative Anweisungen zur Verwendung der SPSS Statistik-Paket, sind online unter http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> In der Registerkarte Analyse, wählen Sie die Option Analyse Parameter zu änderns (Strg + T). Um das richtige Modell zu gelangen, wählen Sie &quot;Neu&quot; und &quot;Neue Gleichung&quot;. Legen Sie die Gleichung in Tabelle 3 als &quot;Single-Site-Ligandenbindung&quot; beschrieben. HINWEIS: Ein Beispiel dieser Schritte wird in 1C gezeigt. Bei Verwendung der Skript mit Gleichungen vorgeladen, kann der entsprechende Gleichung gerichtet, die aus der Liste und nicht eingegeben werden. Ableitung dieser Gleichung ist in einem Anhang. </li><li> Wählen Sie die &quot;Regeln für die Anfangswerte&quot; ein, und geben Sie Regeln für Anfangswerte wie in Tabelle 3 aufgeführt. </li><li> Schränken den Parameter P, als &quot;Konstante gleich&quot; und geben die Endkonzentration des Proteins (in der gleichen Einheit wie der Ligand in angegeben). </li><li> Wählen Sie OK, um die Analyse durchzuführen. HINWEIS: Ein Beispiel dieser Schritte wird in 1D gezeigt. Die Grafik-Software erzeugt eine Figur, die die Daten und die Passform zum Modell. Beispiele für tiese Analysen werden in den repräsentativen Daten angezeigt. </li></ol> 4. Montage Daten an Kooperationsmodelle Um Daten in einem kooperativen Modell passen, wählen Sie entweder zwischen einer einfachen Genossenschaftsmodell oder ein Modell, bei dem zwei separate Dissoziationskonstanten definiert sind. Der erste Ansatz ist im Falle der negativen Kooperativität bevorzugt, oder als erste Untersuchung. Aber im Prinzip ist es besser, in Fällen positiver Kooperativität zu modellieren zwei verschiedenen Dissoziationskonstanten 18. In diesem Fall kann die Modellierung gehen davon aus entweder sequenzielle Bindung von Liganden, oder unabhängige Bindung von Liganden. <ol><li> Führen Sie die gleichen Schritte wie in Anfangs Protokoll 3. jedoch in Schritt 3.3, legen Sie eine der Gleichungen in Tabelle 3 als &quot;Simple Kooperationsmodell&quot; aufgeführt, &quot;Sequential Bindung von zwei Liganden&quot; oder &quot;Independent Bindung von zwei Liganden&quot; 18. </li><li> Wählen Sie die entsprechenden Regeln für die Anfangswertewobei jede dieser Gleichungen in Tabelle 3 verbunden. </li><li> Prüft die Übereinstimmung des Modells mit den Daten. Sollten die Daten passen schlecht, sollten Sie ein anderes Modell. Hinweis: Es ist auch wichtig, sorgfältig zu prüfen, das die Anpassung der Schmelztemperatur auf die Daten durch die Protein Thermal Shift-Software (Schritt 2.9): Manchmal ist es notwendig, die Parameter hier ändern, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Eine weitere Überlegung ist, ob der Bereich von Datenpunkten ist ideal, und ob es irgendwelche anomalen Punkte: entweder eine begrenzte Anzahl von Daten an beiden Seiten der K d oder eine einzige anormale Stelle (insbesondere bei den höchsten Konzentrationen Ligand), erheblich beeinträchtigen kann die Ergebnisse. </li><li> Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal (siehe Schritt 2.12), um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. </li></ol> 5. Fitting Daten an Kurven, die Binary Verschiebungen in der Schmelztemperatur Gelegentlich anstelle einer abgestuften Reaktion auf Liganden, Proteine ​​wurdenbeobachtet, um eine binäre Antwort, wo gebunden Probe wird deutlich von ungebundenen Probe getrennt erlassen. Ein Beispiel ist in der repräsentativen Ergebnisse (Figur 4) vorgesehen. In diesem Fall werden Anpassung der Schmelztemperaturen keine gute Passform für K d. <ol><li> Exportieren Sie die Ausgabe der Rohdaten aus der Protein Thermal Shift-Software. Für jeden Temperaturpunkt, die Berechnung der mittleren Fluoreszenz für die Nullliganden und höchsten Ligandenkonzentrationen. Tabellarisch die Ergebnisse von jedem Datenpunkt neben diesen. HINWEIS: Die hier erstellten Fehler weniger als der Fehler in den Einbauschmelztemperaturen ist. </li><li> Öffnen Sie die SPSS Statistik-Paket. Kopieren der Temperaturen, die beiden mittleren Datenmengen, und die Daten für jedes Experiment zu einem Datenfenster in SPSS. In der Registerkarte Variable, stellen Sie die mittlere Datenmenge ohne Liganden als &quot;gering&quot;, und die mittlere Datenmenge für die höchste Liganden-Konzentration als &quot;hoch&quot;. </li><li> Laden Sie die Syntax-Datei zur Verfügungonline unter: http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Wählen Sie &quot;Ausführen → Ausführen all&quot;. </li><li> Kopieren Sie den Anteil gebunden Ergebnisse in eine neue Excel-Arbeitsmappe mit den entsprechenden Liganden-Konzentrationen. </li><li> Öffnen Sie die Graphpad Software und ein XY-Tabelle zu erstellen. Geben Sie die Daten mit Hilfe der X-Spalte für den Liganden-Konzentrationen und der Y-Spalte für die Schmelztemperatur Ergebnisse. In der Registerkarte Analyse, wählen Sie &quot;Änderungsanalyse Parameter&quot;. Um das richtige Modell zu gelangen, wählen Sie &quot;Neu&quot; und &quot;Neue Gleichung&quot;. Geben Sie die Gleichung in Tabelle 3 angegeben, als &quot;Analyse von binären Verschiebungen der Schmelztemperatur&quot; aufgeführt. </li><li> Wählen Sie die &quot;Regeln für die Anfangswerte&quot; ein, und geben Sie Regeln für die in Tabelle 3 aufgeführt Anfangswerte. Beschränken Sie den Parameter P, als &quot;Konstante gleich&quot; und geben Sie die endgültige Konzentration des Proteins (in den gleichen Einheiten wie die ligand in) angegeben. Anmerkung: Beispiele für die Ausführung dieser Boxen für das Protokoll in Abschnitt 3 sind in Abbildung 1C, D gezeigt. </li><li> Wenn es eine gute Passform, die Ergebnisse können durch Extrapolation zu dem erwarteten Ergebnis bei unendlicher Liganden-Konzentration verbessert werden. Aus dem Modell des Anteils an jedem Liganden-Konzentration gebunden, untersuchen Sie den Wert für den höchsten Wert der Ligandenkonzentration. Wenn dies 0,99 oder größer ist, ist die weitere Analyse unwahrscheinlich, Ergebnisse zu verbessern. </li><li> Wenn der Anteil weniger als 0,99 ist, ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich, um die Auswirkungen des ungebundenen Proteins in der höchsten Konzentration Ligand Probe zu korrigieren. In Schritt 5.2 zu schreiben, den Anteil des Liganden an der höchsten Stelle der Ligandenkonzentration (aus Stufe 5.7) in die Zelle gebunden R2 (eine andere Zelle verwendet werden kann, und R2 ersetzt entsprechend der Gleichung in Tabelle 3). Erstellen Sie eine zusätzliche Spalte nach dem Mittelwert der höchsten Ligandenkonzentration Ergebnisse. In den TannenT-Zelle, kopieren Sie die Gleichung in Tabelle 3 aufgeführt als &quot;Hochgerechnet auf Liganden-Konzentration unendlich&quot;. Kopieren Sie diese Formel, um die restlichen Zellen in dieser Spalte. Anmerkung: Diese Berechnung entfernt den Effekt des ungebundenen Proteins in der höchsten Ligandenkonzentration. Der Unterschied zwischen dem Liganden von freiem Protein und dem höchsten Ligandenkonzentration wird durch den Kehrwert des Anteils bei der höchsten Konzentration Ligand gebunden ist, um die erwartete Differenz zwischen vollständig gebundenen und ungebundenen Proteinzustände bei jeder Temperatur bereitzustellen Punkt multipliziert. Diese Differenz addiert oder von ungebundenen Zustand subtrahiert, um die erwartete Fluoreszenz vollständig Liganden gebundenes Protein zu geben. </li><li> Ersetzen Sie die Spalte für maximale Ligandenkonzentration in der SPSS Datenblatt mit dieser neuen Spalte, und wiederholen Sie den Datenanpassung. Hinweis: Die Schritte 5,7-5,9 müssen möglicherweise wiederholt werden, wenn das Modell schlägt vor, eine weitere deutliche Veränderung des Anteils bei den maximalen Liganden gebunden concentrati(falls dies der Fall ist, wäre es wahrscheinlich ideal, um das Experiment mit einem anderem höhere Liganden-Konzentration Punkt zu wiederholen). </li><li> In Fällen, in denen das Protein eine binäre Verschiebung und zeigt kooperatives Verhalten schlug die Gleichung in Schritt 5.5 ist mit den aus Schritt 4.1 substituiert sein. Die &quot;Top&quot; und &quot;Bottom&quot;-Parameter sollte von 1 und 0 bzw. ersetzt werden. </li><li> Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal (siehe Schritt 2.12), um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. </li></ol></li></ol>

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<li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li>
<li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie nichts offenzulegen haben.

Differential Scanning fluorimetrisch hat seine Macht als robuste und vielseitige Methode zur Charakterisierung von Proteinen und Identifizierung potenzieller Proteinliganden gezeigt. Die gut dokumentierten Erfolge bei der Beschleunigung Proteinstabilisierung, Arzneimittelforschung (vor allem in weniger gut finanzierten Laboratorien) und Kristallisation 10,23-25 ​​haben sie eine attraktive Methode für die anfängliche Screening von Verbindungen hergestellt. Verbindungen, Proteine ​​hinzugefügt zeigen eine klare Dosis-abhängigen Anstieg der scheinbaren Schmelztemperatur 7,9. Jedoch gab es einige Versuche, um die Ergebnisse aus diesen Experimenten verwendet, um scheinbare Bindungskonstanten in der Rangfolge von Verbindungen auf ihre Affinität zu helfen zu bestimmen. Hier stellen wir ein Verfahren zum systematischen Bestimmen einer scheinbaren Dissoziationskonstante von Proteinen in Gegenwart eines Liganden. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass DSF schnell und robust stellen Schätzungen der Dissoziationskonstante fürein Protein-Ligand-Kombination. Die beobachteten Daten können mit handelsüblichen Werkzeugen manipuliert werden, um eine schnelle Bestimmung der K d zu schaffen, ohne dass Annahmen über den wahrscheinlichen Wert der Parameter vorzunehmen. Das Verfahren hat einen wesentlichen Vorteil gegenüber einer vergleichbaren Verfahren, sparsam sowohl Protein und Zeit erforderlich. Das hier beschriebene Experiment wird 0,13 mg Protein verbrauchen pro Versuch (etwa 0,4 mg für Experimente in dreifacher Ausfertigung wiederholt). Dieser Vergleich mit isothermer Titrationskalorimetrie (ITC), in einem einzigen Experiment mit durchschnittlich 40 kDa-Protein eine ähnliche Menge zu verbrauchen. Der vollständige Satz von Experimenten für dieses Protokoll erforderlich wäre, etwa 4 Stunden, einschließlich der Herstellung verbraucht, für eine Reihe von Experimenten. Auch dies ist wahrscheinlich sehr viel schneller als Verfahren, wie ITC oder Oberflächen-Plasmon-Resonanz, die während leistungsfähige erfordern oft erhebliche Optimierung besten Daten zu erzielen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es nach wie vor ein Bedarf an sorgfältig die Rohdaten, die Anpassung der Daten an die Schmelztemperatur zu bestimmen, und die Passform des Schmelztemperaturdaten an die Dissoziationskonstante zu bestimmen. Ein erstes Problem ist die Form der in dem Protein Schmelzen hergestellt Rohdaten. In einigen Fällen kann die Form nicht auf die in 1A beobachtet nähern. Häufige Probleme sind geringe Temperaturschwankungen auf die Ligandenbindung, hohe Hintergrundfluoreszenz, und ungewöhnliche mehrere Übergänge in der Temperatur. Niedertemperatur-Verschiebungen auf der Bindung von Liganden eine Reihe gesehen. Für dieses Verfahren ist der kritischste Parameter der Fehler in der T m-Messung, verglichen mit der Temperaturverschiebung. Die Daten können in der Regel relativ gut ausgestattet, wenn die Standardabweichung von Dreifachmessungen nicht 10% der Schmelztemperatur Verschiebung zwischen ungebundenem und gebundenem Protein vollständig nicht übersteigt. Unsere Erfahrung ist, dass, wenn diese Temperaturratur Verschiebungen sind nur 2 ° C, kann dies ausreichend für die Montage der Daten, wenn die einzelnen Datenpunkte sind sehr genau. Ein zweites Thema ist ungewöhnlich geformte Kurven. Diese unterscheiden sich oft von freiem Protein und Ligand gebundenen Formen, wie die Ligandenbindungsarten beeinflusst Entfaltung des Proteins. In diesen Fällen muss der Benutzer prüfen, ob die Daten mit angemessenen Berücksichtigung der Modelle verwendet werden, um für die Bestimmung der Schmelztemperatur und der Dissoziationskonstante eingesetzt werden. Ein weiteres häufiges Problem ist, dass die Zugabe von Cofaktor an das Protein (zB MgCl 2 in unserem Beispiel mit Hexokinase) erforderlich, um verlässliche Daten zu erhalten. Unsere Erfahrung hat in der Phase der Ausgangswerte unter wesentlich ist für den Erhalt der besten Ergebnisse waren, daß eine sorgfältige Abwägung aller Faktoren wahrscheinlich in dem Experiment. Darüber hinaus können alternative Behandlungen theoretischen Eigenschaften dieser Daten 15,17 offenbaren. Schließlich ist es nicht ungewöhnlich, dass einige Proteine, contain nativ exponierten hydrophoben Regionen zu hohen Hintergrundfluoreszenz zeigen. Es gibt eine Anzahl von Lösungen für diese Probleme, die an anderer Stelle 6,9 bewertet wurden. Insbesondere kann der Benutzer prüfen, ob ein an die Boltzmann-oder abgeleitete Modelle (beispielsweise 4), und im Fall der Verwendung von Derivaten, ob mehrere Schmelzen modelliert werden verwendet. Die beiden Methoden der Modellierung des thermischen Entfaltungs unterscheiden, dass die Boltzmann-Methode passt die experimentellen Daten an die Boltzmann-Gleichung, unter der Annahme einer regelmäßigen S-Form auf die Entfaltungskurve. Im Gegensatz dazu nimmt die Ableitung Verfahren der ersten Ableitung der experimentellen Daten an jedem Punkt (unten in Figur 1A), und hält die Schmelztemperatur der Punkt der höchsten ersten Ableitung sein. Das Derivat im allgemeinen Verfahren liefert eine höhere Schmelztemperatur um ca. 2 - 3 ° C beträgt. Die meisten Proteine ​​wird eine konsequentere RückErgebnis (dh niedriger ist der Standardfehler der Schmelztemperatur für Dreifachversuche) für eine der beiden Methoden. Dies ist normalerweise eng mit der präzisen Form des Proteins Entfaltungskurve bezogen, und es ist erforderlich, empirisch zu bestimmen, die beste Methode in jedem Fall. Wobei die Ableitung Modell verwendet wird, ist es auch wichtig, mehrere Schmelz Ereignisse zu berücksichtigen. Einige Daten zeigen deutlich Beweise für mehrere Übergänge, und in diesen Fällen sind die Ergebnisse wahrscheinlich einfacher zu interpretieren, wenn diese mehrere Schmelz Ereignissen modelliert. Im Rahmen dieses Protokolls ist es oft der Fall, dass die Zugabe des Liganden kann zu einem Protein von mit mehreren Schmelzübergänge zu einem einzigen Übergang ändern (zB durch Stabilisierung der meisten thermisch instabil Domäne) oder umgekehrt. Wir würden uns daher dafür ein, dass die Rohdaten zusammen vor der Prüfung, welcher Ansatz am besten zu nutzen sein wird, untersucht. Nach der modelling der einzelnen Schmelztemperaturen können weitere Probleme bei der Anpassung dieser an die in dem Protokollabschnitt dargestellt Modelle ergeben. Es ist zwingend notwendig, sorgfältig zu prüfen, um die Passform der Dissoziationskonstante Gleichung einer logarithmischen Skala, wie diese Analyse oft betont Diskrepanzen zwischen den beobachteten Daten und dem Modell (e .B., Abbildung 3). Während die erhaltenen Ergebnisse sind in der Regel robust, Pflege in der Interpretation bietet die Möglichkeit, bessere Ergebnisse zu extrahieren, und die meisten Sinn, aus den Daten. Ein besonderes Problem durch diese Daten erhoben ist die Interpretation, die auf Proteine, die Kooperativität zeigen oder mehrere Bindungsereignisse platziert werden soll, in DSF. Wir haben bis heute nur beobachtet, dieses Phänomen in Proteinen, die erwartet, mehrere spezifische Bindungsereignissen (zB WcbM, ein Protein, dessen beste Homolog ist ein Multimer 26 und die als Multimer von Grßenausschlußchromatographie wirkt [Daten nicht sindgezeigt]). Es ist überhaupt nicht klar, dass die in DSF Denaturierung beobachteten negativen Kooperativität zeigt an, dass das Enzym wird letztlich zeigen negativer Kooperativität: eher, kann dies ein Hinweis auf komplexe Bindung, die mehr gründlich mit einem breiteren Spektrum von Methoden erforscht werden müssen. Dies läßt darauf schließen, uns jedoch, dass umfangreichere Studien solcher Proteine ​​wahrscheinlich, um interessante Effekte zu identifizieren. Die für die Dissoziationskonstante dieser Methode bestimmten Werte sind in der Regel von der gleichen Größenordnung wie diejenigen, die durch andere Verfahren, wie beispielsweise isotherme Titrationskalorimetrie und Oberflächenplasmonresonanz ist. Jedoch sind die Absolutwerte beobachtet häufig höher als unter Verwendung dieser Verfahren beobachtet. Dies ist zumindest teilweise eine Folge der Tatsache, dass die Dissoziationskonstante wird bei der Schmelztemperatur des Proteins mit Liganden beobachtet. Diese K d ist im allgemeinen höher als die bei physiologischen Temperaturen. Die dissociation konstant bezogen auf die Temperatur der Reaktion, die durch die Gleichungen: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg"> [1] <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg"> [2] (Wobei θ c ist die Standard-Referenzkonzentration, Δ r G der Gibbs-Energie Veränderung der Reaktion ist, R die molare Gaskonstante ist, Δ H der Enthalpieänderung in dem Reaktions und Δ S die Entropie Änderung der Reaktions .) Reaktionen mit Dissoziationskonstanten im messbaren Bereich dieses Verfahren im allgemeinen einen negativen Δ r G, so dass die Wirkung einer Erhöhung der Temperatur auf die Gleichung [1] wird die Dissoziationskonstante zu erhöhen. Sowohl die Δ H und Δ S Begriffe, die Gibbs-Energie darstellen (Gleichung [2]) sind Temperature abhängigen 27, und die Wirkung auf die Dissoziationskonstante wird von der Größe und dem Vorzeichen dieser Temperaturabhängigkeiten ab und wird notwendigerweise Interaktion abhängig ist. Folglich ist es nicht unerwartet, daß die nach diesem Verfahren ermittelte Dissoziationskonstanten sind manchmal größer als die Methoden, die bei Raumtemperatur betrieben werden bestimmt. Temperaturabhängigkeit ist natürlich auch eine Einschränkung der vielen anderen Verfahren, die dazu neigen, die Dissoziationskonstante bei Temperaturen unterhalb der physiologischen Temperatur bereitzustellen. Weitere Einschränkung des DSF-Methode ist, daß es ein markiertes Verfahren, anders als ITC. Die Fluoreszenzmarkierung verwendet (SYPRO orange) ist hydrophob, und so in einigen Fällen mit der Bindung von Liganden an Proteine ​​hydrophobe konkurrieren können. Folglich ist es wahrscheinlich, dass in einigen Fällen die Dissoziationskonstante erhalten werden künstlich durch die Konkurrenz mit der Bezeichnung angehoben werden. Jedoch für den Vergleich von verschiedenen Liganden (die primäre Verwendung vonDSF), sind die Unterschiede kaum signifikant genug, um die Rangfolge von Verbindungen, die durch Affinität beeinträchtigt zu sein. Ein möglicher Nachteil dieser Methode ist die Nachweisgrenze, die erreicht werden kann. Im Prinzip sollte es nicht möglich sein, einen Wert für K d, die kleiner als 50% der Proteinkonzentration und sogar Werte in diesem Bereich wahrscheinlich von zweifelhafter Genauigkeit ist es genau zu messen. Während die Nachweisgrenze in diesem Ende des Bereichs kann ein wenig durch die Reduzierung der Konzentrationen von Protein und Farbstoff verlängert werden, wird die Empfindlichkeit des Instruments weitere Verringerung der Proteinkonzentration zu verhindern. In ähnlicher Weise wird das obere Ende der Empfindlichkeit durch die Löslichkeit des Liganden bestimmt werden. Eine mathematisch robuste Schätzung für K d zu erhalten, ist es sehr wichtig, um Daten mit 90% der in den Liganden-gebundenen Form vorliegt Protein, das Ligandenkonzentrationen erfordert als ca.-Angaben zu erhaltenly zehnmal K d (Annahme, dass keine Kooperativität). Die Nachweisgrenze wird daher notwendigerweise ein Zehntel der Löslichkeit des Liganden in der betreffenden Puffer sein. Dies bedeutet, daß die Nachweisgrenze der Methode liegt typischerweise im Bereich zwischen 1 um und zwischen 1 und 100 mm, abhängig von dem Protein und dem Liganden. Zusammenfassend ist ein Differential-Scanning-Fluorimetrie vielseitige Technik für eine breite Palette von Proteinen. Verwendung der hier vorgestellten Verfahren ist es möglich, schnell und kostengünstig bestimmt die Affinität des Proteins für die verschiedenen Liganden. Dies hat ein großes Potenzial für die Anwendung in der Proteinreinigung und Stabilisierung, die Aufklärung der Funktion oder Spezifität von Enzymen aus Metagenomen, und in der Wirkstoffforschung, vor allem in kleinen Labors.

Alle Proteine ​​binden, mit unterschiedlichen Affinitäten, um eine breite Palette von anderen Molekülen aus einfachen Ionen zu anderen großen Makromolekülen. In vielen Fällen, Proteine ​​zu binden, um kleine Molekül Partner als Teil ihrer normalen Funktion (beispielsweise eine Kinase-Bindung an ATP). Andere Wechselwirkungen kann unabhängig funktionieren können, sind jedoch experimentell nützlich als Werkzeuge (beispielsweise kleine Moleküle, Proteine ​​zu stabilisieren, um die Kristallisation Erfolg zu verbessern oder zu unterstützen bei der Aufrechterhaltung der Proteine ​​in Lösung); während kleine Moleküle, die an aktiven Stellen und allosterischen Zentren von Proteinen binden kann, als Inhibitoren wirken, und so modulieren die Aktivität von Enzymen. Es gibt eine Vielzahl von Techniken, die verwendet werden kann, um die Affinität der Proteine ​​für die Partner-Moleküle zu bestimmen. Isothermen Titrationskalorimetrie 1 wird allgemein als &quot;Goldstandard&quot; angesehen, da es reich Informationen über Reaktionen ist Etikett kostenlos, und hat für einen begrenzten Möglichkeitenrtifacts des Experiments. Trotz der jüngsten Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Instrumentierung und Automatisierung der Versuchsaufbau ist es jedoch immer noch in Bezug auf die Proteinbedarf relativ teuer, hat im besten Fall einen niedrigen bis mittleren Durchsatz und ist am besten geeignet, um Interaktionen mit mittelschwerer bis hohe Affinitäten (10 nM bis 100 uM K d) 2. Andere Label freie Verfahren wie Oberflächenplasmonenresonanz-oder Doppelschicht-Interferometrie 3 bieten höhere Durch und haben die Empfindlichkeit erreicht werden, um kleinere Moleküle so niedrig wie 100 Da zu erkennen. Allerdings sind hohe Durchsatz Instrumente für diese Methoden vergleichsweise teuer sind, werden nur gerechtfertigt, wenn es eine ständige Durch relevanter Projekte, und so dürften unzugänglich vielen akademischen Laboratorien zu sein. Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF oder thermofluor) wurde erstmals 2001 4 als ein Verfahren zur Wirkstoffsuche beschrieben. In diesem method werden die Proteine ​​mit einem Fluoreszenzfarbstoff inkubiert (zunächst Naphthalin-Sulfonsäure-Farbstoffe verwendet wurden), die ihre Fluoreszenz bei der Bindung an den hydrophoben Bereichen der Proteine ​​verändert. Das Protein-Farbstoff-Probe wird dann erwärmt, und die Fluoreszenz überwacht die Wärme ansteigt. Die Entfaltung des Proteins, und die Belichtung des hydrophoben Teile des Proteins, verursacht eine charakteristische Muster in der Fluoreszenz als eine Funktion der Temperatur (Abbildung 1a). Das Experiment kann in kleinen Mengen in kommerziellen quantitativen PCR-Gerät durchgeführt werden, so dass in einem einzigen Experiment kann eine große Anzahl von Proben gleichzeitig getestet werden (gewöhnlich 48, 96 oder 384 Proben, je nach Gerätetyp). Experimente können in der Regel in der Nähe von einer Stunde durchgeführt werden, wodurch die Möglichkeit einer Hochdurchsatzanalyse der Proben 5. Weitere Verbesserungen der Methodik haben die Annahme von Farbstoffen mit besseren spektralen Eigenschaften 6,7 gesehen </sup&gt;, generische Instrumente zur Datenanalyse, und schlug vor, Protokolle für die ersten Screening 8,9. Die Bandbreite der Anwendungen des Verfahrens auf die Einrichtung optimale Bedingungen für die Herstellung und Lagerung von Proteinen 10 und auf die Identifizierung von potentiellen Bindungspartnern, um die Kristallisation 11 Beihilfen erweitert worden, mit einem besonderen Fokus. Die relativ hohe Durchsatz der Methode, mit relativ geringen Kosten in Protein (~ 2 g pro Reaktion), und die Anwendbarkeit zur Untersuchung schwach bindende Moleküle hat DSF einen wertvollen Werkzeug für Fragment basiertes Wirkstoffdesign, vor allem im akademischen Kontext 12-14. Trotz der breiten Anwendung des DSF zum Studium von Protein-Ligand-Wechselwirkungen haben nur wenige Studien Bestimmung von Dissoziationskonstanten aus diesen Studien beschrieben. Allerdings sind diese tendenziell detaillierten Gleichungen zur Beschreibung der Entfaltung des Proteins, mit vielen Parametern, die zu wenige Daten oder in einigen Fällen E montiert werden muß produzierenstimated 7,15-17. Diese Methoden sind von besonderer Bedeutung in schwierigen Fällen, wie dicht verbindlich Verbindungen oder Proteine, die ungewöhnliche Übergängen. Jedoch für viele Labors sind diese detaillierte Analysen zu umständlich für den Routineeinsatz. Wir haben daher alternative Behandlungen schlagen für verschiedene Szenarien und zeigen, wie diese verwendet werden, um Daten aus verschiedenen Protein-Ligand-Wechselwirkungen, die zu passen. Unsere Methode verwendet das StepOne qPCR Instrument, für die maßgeschneiderte Datenanalyse-Software ist vorhanden; Während dies beschleunigt die Datenanalyse, können die Ergebnisse von anderen Instrumenten mit zuvor veröffentlichten Verfahren 9 bearbeitet werden, und dasselbe stromabwärts Analyse durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>Das StepOne real time PCR-Instrument</td><td>Life Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF kann mit vielen anderen Instrumenten durchgeführt werden. Das StepOne-Gerät verfügt über eine sehr komfortable Software für die Datenanalyse.</td></tr><tr><td>Software für die thermische Verschiebung von Proteinen v1.0</td><td>Life Technologies</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Schnelle optische 48-Well-Platten&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Dichtband&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375323</td><td>Bio-rad Art.-Nr. 223-9444 ist ein alternativer Lieferant</td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit U-Boden</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S6650</td><td>Für einen Anbieter kleinerer Volumina verwenden Sie Sigma Teile-Nr. S5692</td></tr><tr><td>SPSS Statistik Version 20</td><td>IBM</td><td></td><td>Andere Statistikpakete bieten ähnliche Funktionen</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Andere Statistikpakete bieten eine ähnliche Funktionalität</td></tr><tr><td>Handapplikator (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase aus Saccharomyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>10141520</td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung der protein-ligand-wechselwirkungen mit differential scanning fluorimetrie

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Eine breite Palette von Methoden sind derzeit für die Bestimmung der Dissoziation zwischen einem Protein konstant und die Interaktion kleine Moleküle zur Verfügung. Allerdings sind die meisten von ihnen ist der Zugriff auf spezielle Ausrüstung, und erfordern oft eine gewisse Kompetenz, um effektiv zu etablieren zuverlässige Experimente und Daten zu analysieren. Differential Scanning fluorimetrisch (DSF) wird zunehmend als eine robuste Methode zur ersten Screening von Proteinen zu interagieren kleine Moleküle, entweder zur Identifizierung physiologischen Partnern oder für Hit Entdeckung eingesetzt. Diese Technik hat den Vorteil, dass es nur eine PCR-Maschine für die quantitative PCR und so geeignete Instrumentierung ist in den meisten Einrichtungen benötigt; Eine exzellente Auswahl von Protokollen sind bereits verfügbar; und es gibt starke Präzedenzfälle in der Literatur für mehrere Anwendungen des Verfahrens. Frühere Arbeiten mehrere Mittel zur Berechnung Dissoziationskonstanten von DSF Daten vorgeschlagen, aber diese sind mathematisch anspruchsvoll. Hier haben wir DMonstrate Verfahren zum Schätzen Dissoziationskonstanten von einer moderaten Menge an DSF experimentellen Daten. Diese Daten können in der Regel gesammelt und an einem einzigen Tag analysiert werden. Wir zeigen, wie verschiedene Modelle verwendet werden, um Daten von der einfachen Bindungsereignisse gesammelt zu passen, und wo kooperative Bindung oder unabhängige Bindungsstellen vorhanden sind. Schließlich präsentieren wir ein Beispiel für die Datenanalyse in einem Fall, wo Standard-Modelle nicht gelten. Diese Methoden werden mit den Daten auf handelsüblichen Kontrollproteine ​​gesammelt und zwei Proteine, die von unserem Forschungsprogramm veranschaulicht. Insgesamt bietet unsere Methode eine einfache Möglichkeit für die Forscher, um schnell zu gewinnen weitere Einblicke in Protein-Ligand-Interaktionen mit DSF.

Die dynamische Differential-Fluorimetrie ist eine weit verbreitete Methode zum Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle auf Wechselwirkungen mit Proteinen. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um diese Analysen zu erweitern, um eine Schätzung der Dissoziationskonstante zwischen einem kleinen Molekül und seinem Proteinpartner zu erhalten.

Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dissoziationskonstante für eine Proteinligandeninteraktion abzuschätzen. Dies wird erreicht, indem zunächst Mischungen des Proteins mit unterschiedlichen Konzentrationen des Liganden zusammen mit einem Indikatorfarbstoff hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, diese Proben zu erhitzen und gleichzeitig die Fluoreszenz des Indikators aufzuzeichnen, um die Entfaltung des Proteins zu überwachen.Als nächstes werden die Kurven der Proteinentfaltung in eine Reihe von Schmelztemperaturen umgerechnet. Der letzte Schritt besteht darin, diese Daten an ein geeignetes Modell anzupassen, um die Dissoziationskonstante zu schätzen. Letztendlich wird die dynamische Differenzfluorometrie eingesetzt, um die Wechselwirkung eines Proteins mit seinen Liganden besser zu verstehen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Isothermie, Titration, Kalorimetrie und Oberflächenplasmaresonanz besteht darin, dass diese Methode innerhalb weniger Stunden mit nur moderaten Probenmengen in einem Instrument durchgeführt werden kann, das bereits in den meisten Instituten verfügbar ist. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Proteinchemie zu beantworten, wie z. B. die Affinität von Liganden zu Proteinen und die relative Stärke von Wechselwirkungen. Im Allgemeinen würden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Auswahl der zu verwendenden Stichproben und die Analyse der Daten schwierig sein können.Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie die folgenden Lösungen vor. Ein Gemisch, das die in dieser Tabelle aufgeführten Reagenzien und Bestände des interessierenden Liganden in der höchsten verfügbaren Konzentration sowie sechs zehnfache Verdünnungen dieser Konzentration enthält. Wenn aus früheren Daten eine ungefähre Dissoziationskonstante bekannt ist, sind mindestens zwei Konzentrationen über und unter dem kd vorzubereiten.Eine Beispieltabelle ist hier dargestellt. Aliquotieren Sie 18 Mikroliter des Gemisches in jede der acht Vertiefungen. Geben Sie in der A-Q-P-C-R-Platte zwei Mikroliter Lösungsmittel in die erste Vertiefung, in jede der verbleibenden sieben Vertiefungen, fügen Sie zwei Mikroliter von jedem Mitglied der Ligandenverdünnungsreihe hinzu.Platzieren Sie die A-Q-P-C-R-Dichtung über der Platte, um eine gute Abdichtung der Platte zu erreichen. Platzieren Sie einen Handapplikator in der Mitte der Platte, streichen Sie die Versiegelung zu einer Seite hin glatt und wiederholen Sie den Vorgang dann auf der anderen Hälfte der Platte. Zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 500 mal G, um Luftblasen zu entfernen.Platzieren Sie als Nächstes die Platte in einem QPCR-Instrument der ersten Stufe. Wählen Sie die Option Schmelzkurve aus, die die Gesteinsfilter verwenden, und wählen Sie die schnelle Rampengeschwindigkeit. Führen Sie am Ende des Gerätelaufs eine thermische Denaturierung durch.Klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" auf dem Bildschirm. Speichern Sie die Ergebnisdatei. Öffnen Sie die Software für die thermische Verschiebung des Proteins.Erstellen Sie auf der Registerkarte "Eigenschaften" eine neue Studie. Geben Sie ihr einen Namen, und geben Sie auf der Registerkarte "Bedingungen" die Liganden an. Wechseln Sie zur Registerkarte Experimentdateien, und importieren Sie die gespeicherte Ergebnisdatei.Legen Sie den Inhalt der einzelnen Elemente fest. Wechseln Sie zur Registerkarte Analyse und klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren, um die Ergebnisse zu analysieren. Prüfen Sie, ob das Protein in Gegenwart von Lösungsmittel allein ein ähnliches Ergebnis liefert wie in dieser Abbildung gezeigt.Untersuchen Sie als Nächstes die Schmelztemperaturen, die in den Ergebnissen des Replikatschmerzes beobachtet wurden. Stellen Sie sicher, dass dies einen deutlichen Anstieg der Schmelztemperatur mit zunehmender Ligandenkonzentration zeigt. Diese Daten werden verwendet, um einen ungefähren Wert für die Dissoziationskonstante zu liefern, wie in der Begleitarbeit beschrieben.Diese Lösungen werden für das Verfahren zur Bestimmung der Dissoziationskonstante benötigt, ein Mastermix, wie in dieser Tabelle beschrieben, und Bestände des Liganden in 15 verschiedenen Konzentrationen, die verzehnfacht werden. Im abschließenden Experiment. Im Idealfall werden Ligandenkonzentrationen eingeschlossen, die mindestens zwei Größenordnungen über und unter der geschätzten kd liegen, und die Konzentrationen auf die geschätzte kd zentriert.Hier sehen Sie ein Beispiel für eine Verdünnungsreihe. Konzentrieren Sie sich auf sieben der Punkte innerhalb einer Größenordnung der geschätzten KD mit weiteren vier Punkten auf jeder Seite davon. Wenn Sie zur Auswahl stehen, fügen Sie weitere Punkte bei Werten ein, die gesättigt sind.Geben Sie 120 Mikroliter des Mastermixes in jede der acht Vertiefungen in einer 96-Well-Platte mit U-Boden, um als Reservoir für die bequeme Abgabe des Mastermixes zu dienen. Verwenden Sie dann eine Achtkanalpipette, um 18 Mikroliter des Mastermixes in eine Säule einer PCR-Platte zu dosieren. Wiederholen Sie dies für weitere fünf Säulen, um insgesamt 48 gefüllte Vertiefungen in einem Muster von sechs x acht auf der Platte zu erhalten.Geben Sie als Nächstes 20 Mikroliter der Ligandenstiele oder des Lösungsmittels in jede der acht Vertiefungen. In einer anderen 96-Well-Platte mit U-Boden aspirieren Sie mit einer Achtkanalpipette zwei Mikroliter von acht verschiedenen Ligandenstämmen oder Lösungsmitteln und fügen diese zu einer Säule der PCR-Platte hinzu, die mit dem Mastermix gefüllt wurde. Wiederholen Sie den Vorgang mit denselben acht Liganden oder Lösungsmittelmaterialien.Für zwei weitere Säulen aspirieren Sie zwei Mikroliter der verbleibenden acht Liganden- oder Lösungsmittelstöcke und geben diese in eine vierte Säule in der Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für zwei weitere Spalten. Dadurch erhalten Sie dreifache Proben für alle 16 Liganden- und Lösungsmittelproben.Legen Sie das A-Q-P-C-R-Siegel über die Platte. Die Platte wird zwei Minuten lang bei 500 mal G zentrifugiert. Setzen Sie die Platte in das QPCR-Gerät ein und führen Sie eine thermische Denaturierung mit den zuvor angegebenen Parametern am Ende des Gerätelaufs durch.Klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" auf dem Bildschirm. Speichern Sie die Ergebnisdatei. Öffnen Sie die Software für die thermische Verschiebung des Proteins.Erstellen Sie auf der Registerkarte "Eigenschaften" eine neue Studie. Geben Sie ihr einen Namen und beschreiben Sie auf der Registerkarte "Bedingungen" die Liganden. Wechseln Sie zur Registerkarte Experimentdateien, importieren Sie die gespeicherten Ergebnisdateien, und legen Sie den Inhalt der einzelnen Dateien fest.Wechseln Sie zur Registerkarte "Analyse" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren". Wählen Sie die Registerkarte Replizierungen aus dem Menü auf der linken Seite des Bildschirms, um die Ergebnisse anzuzeigen. In dreifacher Ausfertigung.Beurteilen Sie die Zuverlässigkeit der Daten anhand der Genauigkeit der Tripladate. Sollten die Triplikate eine schlechte Reproduzierbarkeit aufweisen. Untersuchen Sie die Rohdaten genau.Analysieren Sie die Daten sowohl mit der Boltman- als auch mit der Ableitungsmethode. Um die Schmelztemperatur zu beurteilen, wählen Sie die Registerkarte Ergebnisse replizieren und schalten Sie im Diagramm der Replikationsergebnisse die Schaltfläche Diagramm nach zwischen tm, boltzmann und TM derivative um. Wählen Sie die Methode aus, die die Reproduzierbarkeit der Probe erhöht.Bei Proben, die mehrere Übergänge aufweisen, ist es fast immer am besten, die Ableitungsmethode im Mehrfachschmelzmodus zu verwenden. Exportieren Sie die Ergebnisse für weitere Untersuchungen mit Excel über die Registerkarte "Exportieren". Beginnen Sie diese Analyse, indem Sie in Excel eine Tabelle mit den Ligandenkonzentrationen und der Schmelztemperatur erstellen.Öffnen Sie die GraphPad-Prismensoftware und erstellen Sie eine XY-Tabelle. Geben Sie die Daten in der Spalte X für die Ligandenkonzentrationen und in der Spalte Y für die Ergebnisse der Schmelztemperatur ein. Wählen Sie auf der Registerkarte Analyse die Option Anpassung der nichtlinearen Regressionskurve aus.Um das richtige Modell einzugeben, wählen Sie Neu und neue Gleichung erstellen. Fügen Sie die entsprechende Gleichung als Ligandenbindung an einer Stelle ein. Aktivieren Sie das Feld Regeln für Anfangswerte, und geben Sie Regeln für Anfangswerte ein.Beschränken Sie den Parameter P auf konstant gleich, um die Endkonzentration des Proteins einzugeben. Wählen Sie Analysieren aus, um die Analyse durchzuführen, zusätzliche Analysen, um Daten an ein kooperatives Modell anzupassen oder Daten an Kurven anzupassen. Das Zeigen von binären Verschiebungen der Schmelztemperatur wird im begleitenden Protokolltext beschrieben.Diese Methode wurde verwendet, um die Wechselwirkung von Hexokinase mit Glukose zu messen. Ein erstes Screening deutet auf eine wahrscheinliche KD von 0,2 bis 1,7 Millimolar hin. Die Ergebnisse eines größeren Screenings zeigen eine gute Anpassung an das Modell für ein einzelnes Bindungsereignis mit einer KD von 1,2 plus oder minus 0,1 Millimolar, die mutmaßliche HETO SQUA L Transferase WCBM zeigt eine starke thermische Verschiebung bei der Bindung an GTP.Ein erstes Screening deutete auf eine KD von 200 bis 500 Mikromolaren hin. Ein detailliertes Experiment deutet auf eine scheinbare KD von 120 plus oder minus 20 Mikromolar hin. Wenn jedoch eine logarithmische Skala für die X-Achse verwendet wird, gibt es eine signifikante Diskrepanz zwischen dem Modell und der Datenanalyse derselben Daten mit einem kooperativen Modell, das eine hervorragende Übereinstimmung mit den Daten zeigt, was bedeutet, dass WCBM in seiner Bindung an GTPA antikooperativ ist, ein eher ungewöhnliches Ergebnis wird mit dem mutmaßlichen BIP beobachtet 60, oxy Beta D mano, Heur two oh, ACE WCBI.Ohne Liganden und bei hohen Ligandenkonzentrationen wird ein einfaches monophasisches Schmelzmuster beobachtet. Bei mittleren Ligandenkonzentrationen werden jedoch zwei unterschiedliche Schmelzpeaks beobachtet. Der Übergang zwischen den beiden Peaksätzen ist dosisabhängig über den gesamten Konzentrationsbereich der Modellierung des biphasischen Schmelzens.Als Summe eines Anteils des Liganden passen die Ergebnisse des freien und hohen Liganden gut zu den Daten. Diese Anpassung wird verbessert, indem das für eine hohe Ligandenkonzentration beobachtete Ergebnis auf eine vollständige Belegung extrapoliert wird. Die Daten, die für den Anteil von WCBI an den Liganden erhalten wurden, zeigen eine hervorragende Anpassung an ein einfaches Bindungsmodell.Mit einer KD von 58 plus oder minus zwei Mikromolaren Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier oder fünf Stunden durchgeführt werden, einschließlich Wiederholungen, wenn sie richtig ausgeführt wird Nach diesem Verfahren. Andere Methoden wie die Tiptop-Venenfluoreszenz und die isotherme Titrationskalorimetrie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Temperaturabhängigkeit und STA-Geometrie zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Schätzung für die Dissoziationskonstante einer Interaktion mit Hilfe der differenziellen Scanning-Grippe bestimmen können.

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video beschreiben wir die Fluoreszenz-Anisotropie-Technik, um die Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor-markierten Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS)-Protein und der Elongationsfaktor-ähnlichen 1 GTPase (EFL1) zu untersuchen. Bei der Inkubation von SBDS-Proteinen mit allmählich steigenden Konzentrationen von EFL1 wird ein stetiger Anstieg der Anisotropie beobachtet, was auf eine erfolgreiche Interaktion zwischen den beiden Proteinen hinweist.

Fluoreszenzanisotropie-basierter Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Dieses Video demonstriert die dynamische Differenzkalorimetrie — eine Technik zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einem Biomolekül und einem Liganden. Die Bindung eines DNA-Aptamers und eines thermolabilen Liganden wird untersucht, indem wiederholte Heiz- und Abkühlzyklen auf die Probe angewendet und Scans für die thermodynamische Analyse durchgeführt werden.

Dynamische Differenzkalorimetrie zur Untersuchung der Interaktion zwischen DNA-Aptamer und thermolabilen Liganden

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Protein-Wechselwirkungen sind im Herzen von einer Funktion der Zelle. Kalorimetrische und spektroskopischen Techniken werden allgemein zu charakterisieren sie verwendet. Hier beschreiben wir Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug, um die Wechselwirkung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und dem Elongationsfaktor-like 1 GTPase (EFL1) mutiert zu studieren.

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Hier präsentieren wir eine unterstützte Lipiddoppelschicht im Rahmen einer mikrofluidischen Plattform zur Untersuchung von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen unter Verwendung eines etikettfreien Verfahrens auf Basis der pH-Modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für schnelle Charakterisierung der biomolekularen Faltung und Interaktionen mit thermolabilen Liganden mit differential scanning Kalorimetrie verbindlich.

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Der Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) kann verwendet werden, um kleine ligandenbindende Proteine eines Organismus unter Verwendung einer ORFeome-Bibliothek zu identifizieren.

Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)

Die Überwachung von Änderungen der Schmelztemperatur eines Zielproteins(z. B.Thermal Shift Assay, TSA) ist eine effiziente Methode zum Screening von Fragmentbibliotheken von einigen hundert Verbindungen. Wir präsentieren ein TSA-Protokoll, das eine robotergestützte Nano-Differential Scanning Fluorimetry (Nano-DSF) zur Überwachung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz und der Lichtrückstreuung für das Fragmentscreening implementiert.

Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie für das Screening in der fragmentbasierten Lead-Discovery

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zum Nachweis der Bindung zwischen Verbindungen und Proteinmolekülen, die die Vorteile eines minimalen Proteinprobenverlusts und einer hohen Datengenauigkeit bietet.

Nachweis der CD40-Protein-Umbelliferon-Wechselwirkung mittels dynamischer Differenzialfluoreszenz

Dieses Protokoll zeigt die Grundlagen und praktische Anwendungen der Phase und Differential Interferenz Kontrast (DIC)...

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Lernen Sie die differentielle Scanning-Fluorimetrie zur Bestimmung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Schätzung von Dissoziationskonstanten mit moderaten Probenmengen.

Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

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