Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die verschiedenen Zelltypen in den Hoden zu trennen. Ernten Sie zunächst eine gemischte Population von Zellen aus der Maus. Die Hoden laden die Zellen und den BSA-Gradienten in die Haltevorrichtung.

Lassen Sie nun die Zellen durch den BSA-Gradienten sedimentieren. Sammeln Sie dann die Fraktionen und kombinieren Sie sie basierend auf der Zellzusammensetzung. Letztendlich wird die Geschwindigkeitssedimentation mit dem Stay-Put verwendet, um verschiedene Zelltypen von den Hoden zu trennen, basierend auf Unterschieden in Größe und Dichte.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie facts besteht darin, dass man große Mengen verschiedener Zelltypen mit relativ hoher Reinheit mit einfachen Glaswaren und Schwerkraft isolieren kann. Befestigen Sie die zwei-, Zwei-Liter-Zylinder und die Zellenladekammer auf der oberen Plattform und verbinden Sie alles mit zwei kleinen Rohrstücken mit Rohrschellen. Klemmen Sie alle Rohre fest und verschließen Sie den Auslauf an der ganz rechten Zwei-Liter-Flasche.

Platzieren Sie einen kleinen Rührstab in der Ladekammer der Zelle und einen größeren Rührstab in den Zwei-Liter-Zylinder ganz links. Stellen Sie dann die zwei Liter fassende Sedimentationskammer auf die Plattform. Positionieren Sie das Metallleitblech direkt auf der Öffnung am Boden der Sedimentationskammer, um ein Verwirbeln der Flüssigkeit und eine Störung des Zellgradienten während der Fraktionssammlung zu verhindern.

Setze nun den Deckel auf die Sedimentationskammer. Tragen Sie eine sehr kleine Menge Vakuumfett auf die Mattfuge des Dreiwegehahns auf. Klemmen Sie dann den Absperrhahn an den Boden der Sedimentationskammer und verbinden Sie so die Mattglasfugen des Absperrhahns und der Sedimentationskammer.

Verbinden Sie anschließend die Zellenladekammer mit einem Schlauch mit dem rechten Auslass des Absperrhahns. Schließen Sie den Absperrhahn, befestigen Sie dann den Küvettenfraktionierungsschlauch am linken Auslass des Absperrhahns und klemmen Sie das kleine Röhrchen ganz unten fest. Gießen Sie die 2%ige BSA-Lösung in den linken Zwei-Liter-Zylinder.

Gießen Sie die 4%ige BSA-Lösung in den rechten Zwei-Liter-Zylinder. Stellen Sie sicher, dass sich keine großen Blasen in den Schläuchen befinden, die diese Zylinder verbinden. Gießen Sie Krebspuffer in die Zellladekammer und füllen Sie den Schlauch, der diese Kammer mit der Sedimentationskammer verbindet.

Stellen Sie sicher, dass keine großen Blasen vorhanden sind, die den Farbverlauf stören könnten. Drücken oder schnippen Sie bei Bedarf vorsichtig auf den Schlauch, um die Blasen zu entfernen. Vergewissern Sie sich, dass sich alle Crebs im Röhrchen und nicht in der Zellkammer befinden.

Lassen Sie eine kleine Menge Krebspuffer in die Sedimentationskammer fließen. Lassen Sie dann fast den gesamten Puffer in den Zellfraktionierungsschlauch ab. Um das Röhrchen zu füllen und große Blasen zu entfernen, platzieren Sie den Fraktionssammler direkt unter der Sedimentationskammer.

Vergewissern Sie sich, dass alle Fraktionsröhrchen an Ort und Stelle sind, und decken Sie sie mit Plastikfolie ab, um eine Kontamination zu vermeiden. Entkapseln Sie die Hoden in einer separaten Platte, die acht Milliliter Krebs enthält. Machen Sie mit einer Pinzette einen Schnitt in die dünne Membran, die die Samenkanälchen umgibt.

Halten Sie die Membran nun mit einer weiteren Pinzette fest. Schieben Sie die Tubuli aus der Membran heraus und von ihr weg. Übertragen Sie vier Milliliter Krebs, der die Tubuli enthält, in jedes konische Röhrchen mit 25 Millilitern Kollagenaselösung.

Bei 33 Grad Celsius 10 Minuten schütteln, bis die Tubuli ein spaghettiartiges Aussehen entwickeln. Lassen Sie dann die Tubuli fünf Minuten lang am Boden des Röhrchens absetzen. Gießen Sie den Überstand aus und waschen Sie ihn zweimal mit 25 Millilitern Krebs bei Raumtemperatur, so dass sich die Tubuli jedes Mal am Boden des Röhrchens absetzen können.

Lassen Sie etwa fünf Milliliter Krebs in jeder Tube. Nach der Inkubation der Tubuli mit Trypsin. Verwenden Sie eine Pipette mit breitem Durchgang, um die Lösung mit den Tubuli zu rühren.

Pipettieren Sie sie etwa 10 Mal ein und aus. Die Lösung sollte eher wie eine einzellige Suspension aussehen. Filtrieren Sie nun jede 30-Milliliter-Einzelzellensuspension durch ein 100-Mikron-Maschensieb.

Zählen Sie nach dem Kombinieren der Zellsuspensionen die Gesamtzahl der Zellen. Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn so positioniert ist, dass er den Durchfluss von der Zellkammer in die Sedimentationskammer leitet. Drehen Sie beide Rührstäbchen auf niedrige Stufe.

Gießen Sie dann die Zellsuspension in die Zellkammer. Öffnen Sie den Absperrhahn, damit die Zellen langsam mit einer Geschwindigkeit von 10 Millilitern pro Minute in die Sedimentationskammer fließen. Schließen Sie dann den Absperrhahn, um die Zellen aus der Zellkammer zu waschen.

Gießen Sie fünf Milliliter 0,5%ige BSA-Lösung und lassen Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 10 Millilitern pro Minute in die Sedimentationskammer abtropfen. Schließen Sie den Absperrhahn und wiederholen Sie die BSA-Wäsche noch viermal. Öffnen Sie nun die Klemmen zwischen der Zellkammer und den beiden Zwei-Liter-Zylindern, um die Flüssigkeit sofort mit einer Geschwindigkeit von 40 Millilitern pro Minute in die Sedimentationskammer abzulassen, und stellen Sie die Durchflussmenge so ein, dass es etwa 20 bis 30 Minuten dauert, bis der BSA-Gradient in die Sedimentationskammer geladen ist.

Überwachen Sie auf eine dünne, ungestörte Zellschicht, die auf dem BSA-Gradienten liegt. Sobald der größte Teil des BSA geladen ist, schließen Sie den Absperrhahn und drehen Sie ihn in die Position, in der die Flüssigkeit aus der Sedimentationskammer in das Fraktionierungsrohr abfließen kann. Schalten Sie nun die Rührplatten aus und lassen Sie die Zellen eine Stunde und 45 Minuten sedimentieren.

Nachdem die Sedimentation abgeschlossen ist, befestigen Sie das Fraktionsrohr an den Fraktionssammler. Stellen Sie die Durchflussmenge mit dem Absperrhahn so ein, dass alle 45 Sekunden 10 Milliliter pro Sammelrohr gesammelt werden. Sobald alle Fraktionen gesammelt sind, analysieren Sie die Fraktionen mikroskopisch für verschiedene Zellpopulationen.

Verschiedene Zelltypen können anhand der Zellgröße und der Kernmorphologie unterschieden werden, um die Reinheit jeder Fraktion zu bestimmen. Übertragen Sie 10 Mikroliter DPI-gefärbte Zellen auf einen Objektträger. Legen Sie ein Deckglas auf und analysieren Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Ziehen Sie die Fraktionen, die in Größe und Kernmorphologie ähnlich sind, um Zellpopulationen zu erstellen. Ein typisches Präparat von ca. 22 Hoden. Mit diesem Stay-Put-Verfahren ergeben sich etwa 10 bis die achten Zellen.

Metagene Zelltypfraktionen von Perper können mit einer Kombination aus Licht- und Fluoreszenzmikroskopie schnell analysiert werden. Myotische, Spermatogonien- und somatische diploide Zellen sind die größten Zellen in den Hoden und enthalten große Zellkerne, die sich relativ homogen mit dpi färben. Runde Spermatiden sind kleinere Zellen mit kleineren runden Kernen, im Allgemeinen mit einem hell färbenden Chromo-Zentrum, das verdichtet, verlängernde Spermatiden sind kleine Zellen mit sichelförmigen Kernen.

Sobald die Zellfraktionen kombiniert sind, kann die Reinheit durch westliche Blutanalyse der Zelllysate weiter bestimmt werden. Häufige Marker für myotische Zellen sind die Synap Neal Complex one Proteine. Häufige Marker für kondensierende Spermatiden sind Übergangsproteine oder Protamin.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben Stunden durchgeführt werden, wenn sie nach ihrer Entwicklung richtig ausgeführt wird. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Spermatogenese den Weg, um zelluläre Prozesse in verschiedenen Zelltypen aus den Hoden zu erforschen.