Name: Antikörperfärbung in C. Elegans Mit der Freeze--Cracking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Lernen Sie die Freeze-Cracking-Methode zur Antikörperfärbung in C. elegans. Diese Technik minimiert chemische Behandlungen und ermöglicht präzise Proteinlokalisierung in vivo.

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Die Finanzierung wurde von NSF CCLI # 0633618 und der Ohio University zur Verfügung gestellt. Einige Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center geliefert. Graduate Student Reetobrata Basu erscheint in dem Video.

HINWEIS: Mehrere Protokollschritte sind mit Optionen für die Einrichtung und Vorbereitung abhängig von den spezifischen Bedingungen des Experiments vorgestellt. Für diese Fälle sind alternative Schritte A, B, C usw. dargestellt Das Protokoll mit alternativen Schritte ist in Fig. 1 skizziert. 1. Vorbereitung von Polylysin beschichtete Objektträger Drei verschiedene Arten von Folien verwendet werden können, abhängig von dem gewünschten Kompromiß zwischen der Leichtigkeit der Herstellung, relativ Haftung und nicht-spezifische Bindung des Antikörpers. Details der Objektträgerpräparations Alternativen sind unten in den Schritten 1A-1C in der Reihenfolge zunehmender Komplexität und Adhäsion gegeben. Folien mit diesen verschiedenen Verfahren hergestellt werden, können für ein einzelnes Experiment zusammen verwendet werden. 1A. Keine Rutsche Vorbereitung Im Handel erhältliche Polylysin beschichtete Objektträger bieten geringe Haftung und niedrigen Hintergrund. 1B. Slide preparation Optimum für Methanol-Aceton-Fixierung Medium Haftung und geringe Hintergrund. <ol><li> Bereiten Sie einen Polylysin-Lösung für das Eintauchen der Objektträger: In 400 mg mit sehr hohem Molekulargewicht (150.000 - 300.000 D) Poly-L-Lysin zu 200 ml doppelt destilliertem Wasser. 2 ml 10% Natriumazid Lager (Endkonzentration 0,1%) als Konservierungsmittel. ACHTUNG: trocken Natriumazid ist reaktiv und alle Formen sind giftig. Maske tragen und Handschuhe beim Wiegen Pulver zu 10% Lager in doppelt destilliertem Wasser zu machen. </li><li> Wischen einzelne Ende Milchglasobjektträger mit fusselfreien Tüchern, Entfernen Flecken und Partikel. Dies sollte auch auf Objektträger mit der Bezeichnung gekauft getan werden &quot;vorgereinigt.&quot; </li><li> Die Objektträger Rücken an Rücken in einer Objektträgerhalter, Glasküvette oder andere Dia-Färbung Behälter, halten mattierte Kanten und nicht ganz perfekt ausgerichtet (um spätere Trennung einfacher). Zeigen Scheibe Halter im Becherglas mit 70% Ethanol (Alkohol Reagenzqualität nicht erforderlich) mit 1% HCl in diWasser gestillt oder füllen Küvette zu Ebene der Zuckerguss. Steinschlag in der Lösung für mindestens 5 min. ACHTUNG: Diese Lösung ist ätzend, Handschuhe tragen. HINWEIS: Diese Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden können (bis zu mehreren Monaten). </li><li> Spülen Sie Folien in destilliertem Wasser läuft für 1 min. </li><li> Trockenrutschen komplett in einer staubfreien Umgebung entweder, indem in einem Ofen 40-60 ° C für 30-60 Minuten oder über Nacht bei Raumtemperatur zu halten. </li><li> Die Objektträger in Polylysin-Lösung (für unfrosted Teile) auf Wippe für 15 min. </li><li> Wiederholen Trocknung von Folien. </li><li> Wiederholen Polylysin-Lösung Inkubation und Trocknungsschritte. </li><li> Trennen Sie die Folien mit einem schlanken Metallgegenstand mit einem Gewicht von einer dünnen Spachtel. Wenn sie korrekt eingehalten werden, sind sie schwierig zu trennen. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (Schutzbrille) und die Arbeit an Tischpapier (nach Gebrauch weggeworfen werden), da kleine Glassplitter fliegen können lose, wenn Folien voneinander getrennt sind. </li><li> Shop Dias in Rein(Staubfrei) Dia-Box bei 4 ° C bis benötigt. </li></ol> 1C. Schieben Vorbereitung optimal für Formaldehyd-Fixierung Höchste Haftung, aber hohe Hintergrund. <ol><li> Objektträger mit der Methode 1B Wohnung in einer staubfreien, ofenfeste Form (für das Trocknen im Ofen) oder auf einer flachen Oberfläche staubfrei vorbereitet (für die Lufttrocknung). </li><li> Platzieren einer 20-60 &amp;mgr; l Tropfen der Polylysin-Lösung auf die Mitte der einzelnen Folien. </li><li> Trocken Folien vollständig im Ofen oder bei Raumtemperatur. Die Polylysin hinter blass Ovale lassen, wie es verdunstet. Diese Ovale sind sehr Kleber. Leider sind sie auch für die primären und sekundären Antikörper zu binden, auch nach der Blockierung. </li><li> Shop Folien sauber (staubfrei) Dia-Box bei 4 ° C bis benötigt. </li></ol> 2. Herstellung von Frozen Nematode Slides Bereiten Nematoden für die Färbung durch Spülen vollständig frei von Bakterien mit der Methode 2A (für Platten von Nematoden) oder2B (für einzelne Nematoden). 2A. Herstellung von Folien aus Platten von Nematoden <ol><li> Stellen Sie ein flaches Stück Metall auf Trockeneis Vorkühlung. </li><li> Verwenden Sie destilliertes Wasser und einer Glaspipette (verringert Verlust von Würmern) oder Mikropipette, um Würmer aus NGM-Platte mit Bakterien in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen spülen. Die Platten können synchronisiert werden oder gemischt Alters; verwenden Sie keine Platten mit vielen dauers (schwer zu knacken) oder verhungert Würmer (erhöhte Autofluoreszenz), sofern erforderlich. </li><li> Mit destilliertem Wasser spülen die Würmer 3-4x, bis sie frei von Bakterien. (Um den Verlust von Würmern verringern die gleiche Glaspipette.) Zum Pellet Würmer, entweder wir sie auf der Bank sitzen für 3-5 min (zu meist Erwachsene auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln) oder Spin 30 Sekunden bei ~ 1000 rpm (~ 500 g) in einer Tischzentrifuge (für Erwachsene, Larve, sammeln und Embryonen). </li><li> Entfernen Sie die meisten von Wasser aus Rohr mit Würmern, so dass etwa die doppelte Menge Wasser wie Würmer (mindestens jedoch 25 ul Gesamtvolumen). </li><li&gt; Etiketten mattierte Seite der &quot;Boden&quot; (in Schritt 1) ​​behandelt Polylysin Folien mit wasserfester Tinte und Objektträger auf Zähler nächsten Behälter mit Trockeneis Etikett nach oben. </li><li> Eine gleiche Anzahl von regelmäßigen (sauber gewischt, aber nicht behandelt Polylysin) &quot;oben&quot; Folien zur Verfügung. </li><li> Platz ~ 25 ul Würmer im Wasser auf dem &quot;Boden&quot; haftRutsche und die Ausbreitung der Flüssigkeit, die die Würmer über den mittleren Abschnitt des Schlittens mit der Seite der Pipettenspitze. </li><li> Lassen Sie die Würmer für 30 Sekunden bis 2 Minuten zu begleichen. Wenn der Schieber entsprechend klebrig, werden die Enden der Schnecken halten, wie sie den Schieber kontaktieren. </li><li> Halten Sie den Boden gleiten in einer Hand und legen Sie den Oberschlitten über den Boden gleiten, so dass alle, aber die Vereiste Bereiche überlappen. Die Flüssigkeit sollte die Folien leicht auseinander halten, so dass die Würmer noch leicht bewegen lassen Sie sich nicht die Folien gleiten übereinander -. Diese verdreht die Würmer. </li><li> Drücken Sie vorsichtig gerade nach unten sleicht auf den Oberschlitten, mit dem Daumen und Zeigefinger jeder Hand. Mit der idealen Menge an Druck, wird ein paar der größten Hermaphroditen am Rande der Folien reißen, während die meisten Erwachsenen und Larven wird jede Folie zu kontaktieren, aber intakt bleiben. </li><li> Sofort und vorsichtig (ohne zu rutschen) setzen die Folien auf dem Stück Metall auf Trockeneis. Die Folien sollten innerhalb einer Minute eingefroren erscheinen. Halten Sie auf Trockeneis für 5 Minuten, bis sie gründlich eingefroren. </li><li> An diesem Punkt können die Objektträger in ein Eingabefenster bei -80 ° C für mehrere Tage gelagert werden. (Wenn sie bei -80 ° C gehalten Wochen sind, wird das Wasser anfangen zu sublimieren entfernt und die Würmer nicht so gut färben). Wenn Folien werden bei -80 ° C gelagert, lassen Sie sie &quot;warm up&quot; auf Trockeneis für 10 min vor Rissbildung. </li><li> Gehen bis 3 (Fixierung) Schritt. </li></ol> 2B. Herstellung von Folien aus einzelnen Nematoden <ol><li> Stellen Sie ein flaches Stück Metall auf Trockeneis precHügel. </li><li> Verwenden Sie einen Wurm holen, um einzelne Nematoden zu einem Wassertropfen auf einem NGM Platte übertragen, um sie von Bakterien zu befreien. Nematode (n) sollte gut zugeführt, um die Autofluoreszenz zu verringern, wenn möglich. Wiederholen Übertragung auf neue Spots von Wasser wie nötig, bis Wurm (n) frei von Bakterien. </li><li> Beschriften mattierte Seite der &quot;Boden&quot; Polylysin-Objektträger mit wasserfester Tinte und Objektträger auf Zähler nächsten Behälter mit Trockeneis Etikett nach oben. Eine gleiche Anzahl von weniger haft &quot;oben&quot; (unbehandelt) Folien zur Verfügung. </li><li> Platzieren 5-10 &amp;mgr; l-Tropfen Wasser auf den Bereich der Bodenträger mit Polylysin doppelt behandelt. Verwenden Sie die größere Lautstärke, wenn die Übertragung mehr Würmer, um das Wasser zu verdunsten vor Fertigstellung zu verhindern. </li><li> Übertragen Sie die Schnecke (s) an die Wassertropfen mit dem Wurm-Pick, mit dem Mikroskop zu beobachten, wie die Würmer sinken, um die klebrige Gleitfläche berühren. Übertragen so wenig wie ein Wurm, so viele wie 20 + Würmer pro Tropfen. </li><li> Halten Sie den Boden slide in einer Hand und legen Sie den Oberschlitten über den Boden gleiten, so dass alle, aber die Vereiste Bereiche überlappen. </li><li> Sofort und vorsichtig (ohne zu rutschen oder Kompression) setzen die Folien auf dem Stück Metall auf Trockeneis. Halten Sie auf Trockeneis für 5-30 min. (Diese Folien lagern langfristig, da die Folien leicht austrocknen.) </li><li> Gehen bis 3 (Fixierung) Schritt. </li></ol> 3. Fixierung Fixierungsmittel sind notwendig, um &quot;fix&quot; das Antigen an Ort und Stelle in der Zelle, entweder durch Ausfällen (&quot;light-Fixierung&quot;) oder Vernetzung (&quot;harte Fixierung&quot;) das Antigen. Die Fixierung kann Antigenität stören, die meisten bekannten Antikörper funktionieren am besten mit einer bestimmten Fixierung Zustand. Für neue Antikörper, sollte ein Bereich der Fixierung Bedingungen getestet werden. Für jede Fixierung, ist der erste Schritt, um Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung herzustellen. Weiter fix Folien mit Nematoden zur Antikörperfärbung nach Methode A (Lichtfix mit Methanol und Aceton) oder B (härter fix mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd). <ol><li> Bereiten Sie eine sterile 10x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) Stammlösung durch Zugabe von 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g Na 2 HPO 4 • H 2 0, 2,4 g KH 2 PO 4, 20 ml 10% Natriumazid Lager. Um diese Stammlösung zu machen, wiegen Natriumazid Pulver zu 10% ige Lösung in doppelt destilliertem Wasser zu machen. Rühren Sie mit Kochsalzlösung sanfte Wärme bis gelöst. ACHTUNG: trocken Natriumazid ist reaktiv und alle Formen sind giftig. Tragen Maske und Handschuhe bei der Arbeit mit trockenen Natriumazid oder Lösungen. </li><li> Lassen Salz cool (Tris pH temperaturempfindlich ist), dann pH-Wert auf 7,2 mit 1-10 M NaOH. Top auf 1 L mit doppelt destilliertem Wasser und Autoklaven zu sterilisieren. Lagerung bei Raumtemperatur und verdünnt auf 1x als mit sterilem doppelt destilliertem Wasser benötigt. ACHTUNG: NaOH ist ätzend - Handschuhe während der Anwendung zu tragen. </li></ol> 3A. Licht fix mit Methanol-Aceton- <ol><li> Setz 100% Methanol, 100% Aceton und 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in Küvetten auf Eis für mindestens 10 min Vorkühlung. ACHTUNG: Methanol und Aceton sind giftig, Handschuhe. </li><li> Nehmen Sie ein Paar von unteren und oberen Dias aus dem Trockeneis, schnell verdrehen sie auseinander, und sofort tauchen die &quot;unten&quot; slide in eiskaltem Methanol für 2 min. Die &quot;Top&quot;-Rutsche können verworfen werden. </li><li> Objektträger aus Methanol kaltem Aceton für 4 min Eis. Wenn die Folien hatte viele Würmer, die meisten (90%) wird in dem Update fallen, auch mit den am besten vorbereiteten Folien. Wenn einzigen Wurm Träger wurden richtig vorbereitet, sollten die Würmer eingehalten bleiben. </li><li> Zeigen oder tauchen Sie die Folien in das Glas mit PBS (abzuspülen Fixiermittel) und fahren bis 4 (Färbung) Schritt. </li></ol> 3B. Fest fix unter Verwendung von Formaldehyd oder Glutaraldehyd <ol><li> Verdünnen Reagenzqualität Formaldehyd oder Glutaraldehyd-Lösung in 1x PBS auf 0,5-4% Endkonzentration. Aliquots (1,5 ml) may gespeichert dicht bei -20 bis -30 ° C begrenzt werden; auftauen Aliquots auf Eis kurz vor der Verwendung. HINWEIS: Formaldehyd-Lösungen mit der Zeit abgebaut und an der Luft. ACHTUNG: Formaldehyd und Glutaraldehyd sind giftig, Handschuhe und arbeiten in der Kapuze. </li><li> Nehmen Sie ein Paar von unteren und oberen Dias aus dem Trockeneis, schnell verdrehen sie auseinander, und sofort legen Sie die &quot;unten&quot; slide mit Würmern in der flachen Schale mit Deckel. (Der Oberschlitten kann verworfen werden). </li><li> Unmittelbar pipettieren 200 ul giftig Fixiermittel über der Mitte der Fläche des Objektträgers mit Würmern. Das Fixiermittel wird teilweise an Ort und Stelle einzufrieren, dann schmelzen, um einen größeren Bereich der Folie abzudecken. </li><li> Wenn die Würmer nicht völlig mit Fixiermittel bedeckt, sofort und vorsichtig mehr Fixiermittel mit einer Mikropipette. Nicht Fixiermittel über den Rand der Folie fließen. </li><li> Decken Sie die Schüssel mit einem Deckel und lassen für 10 min bis über Nacht bei Raumtemperatur. Seien Sie sicher, dass das Gericht wird befeuchtet, wenn längere Inkubationen are verwendet - dies kann durch Zugabe von gefalteten feuchten, fusselfreien Tüchern in die Schale durchgeführt werden. Lassen Sie sich nicht die Tücher berühren Sie die Folien. </li><li> Nach der vollständigen Fixierung vorsichtig pipettieren Fixiermittel mit losen Würmer in ein 1,5-ml-Röhrchen und tauchen Sie die Folie in eine Küvette mit PBS. </li><li> Drehen Sie das Rohr mit Würmern, die locker für 30 Sekunden kam mit hoher Geschwindigkeit zu pelletieren. Zweimal mit PBS spülen Würmer, verarbeitet dann parallel zu den Schnecken auf den Folien (tut Schritte Mikrozentrifugenröhrchen statt auf Folien). </li><li> Gehen bis 4 (Färbung) Schritt. </li></ol> 4. Antikörperfärbung Die Antikörperfärbung Protokoll ist ähnlich wie Standard-Protokolle für jedes Gewebe auf Folien. Dieses Protokoll ist für alle Folien, unabhängig von der Herstellung in den Schritten 1-3. <ol><li> Antikörper herzustellen Puffer durch Mischen 700 ml doppelt destilliertem Wasser, 100 ml 10-fach PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% Endkonzentration), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM final), 1 g BSA (0,1% Endkonzentration), 5 ml 10% iger azide-Lösung (0,05% endg.). pH-Wert auf 7,2 mit HCl, fügen Sie dann doppelt destilliertem Wasser auf 1 L; lagern bei 4 ° C </li><li> Bereiten Blockieren durch Rekonstitution Esel-Serum mit doppelt destilliertem Wasser, dann Zugabe von 5 ml Serum 45 ml Antikörperpuffer (final 10% Serum). </li><li> Bereiten Sie Primär-und Sekundärantikörperlösungen durch Verdünnen Antikörper in Antikörperpuffer plus 1% BSA. Empfohlene Verdünnungen 1:50-1:2,000 für Primärantikörper und 1:1,000-1:5,000 für Sekundärantikörper (Cy3or OG488 konjugierte Antikörper gegen Esel verwendet, um primäre Antikörper erhöhen Arten). </li><li> Bereiten DAPI Lager durch Mischen von 2,5 mg / ml in doppelt destilliertem Wasser; Store in 8 ul Aliquots bei -30 ° C eingefroren ACHTUNG: DAPI ist ein giftiges DNA-bindenden Farbstoff, Handschuhe, während Einwaage aliquotiert. </li><li> Vorbereitung 10 ml Mounting Medium durch Mischen von 200 mg n-Propylgallat, 0,3 ml 1 M Tris, pH 9, 2,7 ml doppelt destilliertem Wasser in einem 15 ml konischen Röhrchen. Hitze bei 65 ° C für etwa 10 min bis gelöst.In 7 ml Glycerin und eine 8 ul Aliquot von DAPI und Wirbel auch. Aliquot Medium in 1,5-ml-Röhrchen, in Folie wickeln und nur im Dunkeln bei 4 ° C (sowohl Luft und Licht verschlechtern die Mittel - wenn es mehr gelb, verwerfen in Biohazard Abfall). ACHTUNG: n-Propylgallat ist eine reaktive Anti-Oxidationsmittel, Handschuhe beim Wiegen. </li><li> Übertragen Objektträger in eine Küvette mit Sperren für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (bevorzugt über Nacht hart fix). Vermeiden Sie Schütteln, um zu verlieren, Würmer zu vermeiden. </li><li> Objektträger auf Glas mit primären Antikörper oder Objektträger flach in einer Schüssel und befeuchtet oben mit jeweils 100-500 ul primären Antikörper-Färbung. Dias über Nacht bei 4 ° C ohne Schütteln inkubiert. </li><li> Nach der primären Antikörper-Inkubation, Transfer gleitet, um Glas PBS Färbung. </li><li> Filterblock durch den Trichter mit Filterpapier und bei 4 ° C gefüttert, und wenn steril filtriert alle 1-2 Wochen, können Sperren für 1 oder mehrere Monate wiederverwendet werden. Ebenso filtern und speichernprimären Antikörper bei 4 ° C für die Wiederverwendung (bis zu 10 oder mehr Runden der Färbung). </li><li> Rinse gleitet dreimal (~ 20 min jeweils) in Antikörperpuffer. </li><li> Die Objektträger in sekundäre Antikörper in einem lichtdichten Behälter Färbung und Inkubation 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Objektträger auf Glas PBS Färbung. Filter und sparen sekundären Antikörper bei 4 ° C für die Wiederverwendung (für bis zu 10 oder mehr Runden-Färbung). </li><li> Rinse gleitet dreimal (~ 20 min jeweils) in Antikörperpuffer. </li><li> Objektträger zu PBS und lassen in PBS (Minuten bis über Nacht bei 4 ° C) bis bereit zu montieren. </li><li> Arbeiten Sie schnell auf einzelne Folien, so dass die Würmer auf der Vorderseite der Folie bleiben nass. Einen Objektträger aus dem PBS, trocknen Rückseite der Folie mit einem fusselfreien abwischen, und auf Küchenpapier. </li><li> Platz ~ 20 ul Montagemedium über Würmer, so dass es zu etwa gleichen Teilen Mittel-und PBS auf Schiebe-Kipp-Schiebe sanft auf die beiden Lösungen mischen. CAUTION: Montage Medium ist giftig. </li><li> Kippschiebers so Mattrand ist niedriger und Lösung sammelt in der Nähe von Zuckerguss, dann legen Sie einen Rand von 24 x 60 mm Deckglas auf Lösung. </li><li> Senken Sie die Deckglas, um Luftblasen (die Bleich erhöhen und stören Leser) zu minimieren. Wenn sich Blasen bilden, heben Sie den Rand des Deckglases langsam, dann relower ohne Verschieben des Deckglases über die Würmer. </li><li> Die Kante der Folie vorsichtig trocknen, ohne den Deckglas, durch Zusammendrücken der Kanten mit einem fusselfreien zu wischen. Der relativ trockene Kante der Folien müssen rund um den Rand des Deckglases sichtbar </li><li> Deckglas mit 2-3 Schichten Nagellack. Dias können in einem flachen Trägerhalter bei Herstellung und Lagerung vor Licht zu schützen platziert werden. Sobald Schlitten gut verschlossen und trocken, reinigen Sie die Deckglas-und Rückseite der Folie. </li><li> Gut verschlossenen Folien können im Dunkeln Tage bei 4 ° C oder Wochen bei -20 ° C gehalten werden, Über längere Zeiträume, DAPI staining von DNA und die meisten grünen Farbstoffe (z. B. 488 nm Anregung) verblassen. Verschließen Sie das Deckglas mit Nagellack nach Bedarf, z. B. nach Verwendung eines Ölimmersionsobjektiv. </li></ol>

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Der Autor erklärt, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Das gefrierCrack Protokoll ist eines von mehreren Verfahren zur Antikörperfärbung in C. elegans. Es bietet eine relativ einfache Möglichkeit, Würmer Fleck, erfordert aber spezifische Reagenzien und Praxis für optimale Ergebnisse. Kritische Schritte (in Abbildung 1 dargestellt) umfassen: 1) Bei Objektträgervorbereitung (siehe Schritte 1 und 2) manuelle Kompression der Nematoden (siehe Schritte 2 und 3) schnelle Fixierung (siehe Schritt 3). Erstens, um die Haftung der Nematoden auf die Objektträg...

Um die zellulären und subzellulären Lokalisation von Proteinen zu bestimmen, haben Wissenschaftler traditionell mit Antikörpern ausgewählt, um bestimmte Proteine ​​spezifisch erkennen, ein markierter Gewebe. In einigen Modellorganismen wie C. elegans, Antikörperfärbung wurde oft durch molekulargenetische Techniken, die Ergebnisse schneller erzielen ersetzt. Diese umfassen die Umwandlung Organismen mit Konstrukten aus Genfusionen zwischen dem Promotor und der codierenden Regionen des Gens von Interesse und das grün fluoreszierende Protein. Jedoch unterliegen einer Anzahl von Artefakten, einschließlich der Probleme mit Kenntnis der wahren Promotor und Veränderungen in der Expression von Konstrukten mit hoher Kopienzahl (die üblichen Techniken in C. elegans) 2,3 molekularen Techniken. Daher Färbung mit Antikörpern bleibt ein Ziel für viele Wissenschaftler, die Proteinfunktion in vivo. Anfärben mit Antikörpern Gewebe kann schwierig sein, da eineAntikörpern kann nur ihre Antigen in einer bestimmten Konformation 1 zu erkennen. Zum Beispiel können Antikörper nur denaturiert oder intakten Antigen fixiert in einer bestimmten Weise zu erkennen und nicht das Antigen in situ zu erkennen. Das Problem der Antikörperfärbung in Nematoden wird durch die Tatsache, dass die Kutikula der Nematoden bildet eine relativ undurchlässige Barriere, die Blockierung des Zugangs von Antikörpern gegen Gewebe verstärkt. Es gibt mehrere verschiedene Methoden für die Antikörper-Färbung verwendet in C. (4 in unserer bisherigen Arbeit überprüft) elegans. Um intakte Fleck &quot;Würmer&quot;, wurden Methoden entwickelt, zu frieren und tauen in einem relativ harten Fixiermittel (Formaldehyd oder Glutaraldehyd), die Frost-Tau-Zyklen helfen, die Nagelhaut zu knacken, um eine schnelle Durchdringung der Fixiermittel 5 zu ermöglichen. Nach der Fixierung wurde die Kutikula permeabilisiert, um das Eindringen der Antikörper zu ermöglichen; Methoden enthalten eine Behandlung mit Reduktionsmitteln, Collagenase oder beides 5-7. Diese Treatments Morphologie erhalten, aber oft reduziert oder zerstört Antikörpererkennung. Alternative Methoden sind Dissektion 8 bis Antikörper Eindringen zu ermöglichen. &quot;Freeze-Cracking&quot; ist eine Möglichkeit, den Zugang zum Inneren des Halb intakt Wurm gewinnen, damit Antikörperfärbung 9-10. Gefrier Cracken kann mit einer Vielzahl von Befestigungs Bedingungen durchgeführt werden, während die Vermeidung Kollagenase-und Reduktionsbehandlungen. Die Nematoden sind zwischen zwei Folien gelegt Klebstoffe, gefroren, und dann werden die Folien voneinander getrennt sind, so dass die meisten der Nematode auf der Bodenschieber und viel von der Kutikula auf der oberen Folie. Die untere Folie kann in Fixiermittel gelegt und die gesamte Folie mit haft Nematoden durch den Antikörper Färbeverfahren übertragen. Die Methode hat derzeit zwei große Schwierigkeiten. Erstens ist es schwierig, die richtige Menge von Druck notwendig, um die Nematoden, ohne ernsthaft zu verformen aufgeteilt anzuwenden. Zweitens sind viele der Würmer wird nicht sTick ​​zu jeder Folie, und werden in der Fixiermittel oder Spülungen verloren. Doch mit den richtigen Folien und Praxis wird das Verfahren rasch ergeben Nematoden mit vernünftigen Morphologie, die mit einer Vielzahl von Fixiermittel und Antikörpern verwendet werden kann. Das Verfahren kann leicht in Abhängigkeit von dem Ziel der Experimentator variiert werden. Wenn Färbung der einzelnen Nematoden erwünscht ist (z. B. um zu bestimmen, ob eine einzelne Transformante wurde Antikörperfärbung verändert), gleitet dann mit maximaler Haftung (aber höhere Hintergrundfärbung) verwendet werden können, wie Labor hergestellte Folien mit zusätzlichen Polylysin (siehe unten). Für Formaldehyd oder Glutaraldehyd-Fixierung, sollte höher Adhäsions-Objektträger (Labor vorbereitet Polylysin Dias) verwendet werden, da Nematoden mehr haften schlecht auf Polylysin nach diesen Fixierungen. Wenn Wildtyp-Nematoden werden mit Methanol und / oder Aceton fixiert, gleitet dann mit geringerer Haftung und geringer Hintergrundfärbung verwendet werden sollte (kommerziell oder labor vorbereiteten Folien). Wenn eine Vielzahl von Antikörpern und Fixiermittel werden im Labor verwendet werden, kann eine Auswahl von Folien voraus hergestellt und gelagert, bis sie benötigt werden. Nach dem Zugriff auf die Nematoden-Gewebe wurde gewonnen, Antikörperfärbung Verfahren folgen Standardverfahren (mit längeren Inkubationszeiten Merkmal von Geweben statt Zellen 1,11).

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysin-Objektträger (Marke ESCO)</td><td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>Objektträger der Marke Sigma eignen sich auch für</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td><stark>WICHTIG:</stark> Marke und hohes Molekulargewicht von Polylysin kritischer</td></tr><tr><td>einfacher mattierter Rand Objektträger</td><td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>Andere Marken sind geeignet</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>TOXIC, tragen Sie Handschuhe und Maske, während Sie das Pulver abwiegen, um 10% Vorrat zu erhalten. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie Stammlösung</td></tr><tr><td>Coplin Färbeglas</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>Andere Marken sind geeignet</td></tr><tr><td>5-Objektträger-Versandtasche</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>71549-01</td><td>Eine von vielen verschiedenen Marken von kleinen Objektträgerhaltern, geeignet zum Färben von</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><stark>WICHTIG:</stark> Normale Formalinlösungen (37% Formaldehyd) sind NICHT geeignet. Entweder 1) Crysatlaline paraformaldehyd in Phosphatpuffer auflösen und in kleinen Aliquoten gefroren lagern. Oder 2) Kaufen Sie Paraformaldehyd in Elektronenmikroskopiequalität in Aliquoten. GIFTIG - Handschuhe tragen; Entsorgen Sie überschüssiges Waschbecken mit Wasser.</td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung, 25% in Wasser</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td><stark>WICHTIG:</stark> Glutaraldehyd in Elektronenmikroskopiequalität in Ampullen kaufen; GIFTIG - Handschuhe tragen; Entsorgen Sie überschüssiges Waschbecken mit Wasser.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>Andere Marken sind geeignet</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Fisher</td><td>ICN820451</td><td>Andere Marken sind geeignet</td></tr><tr><td>Eselserum, lyophilisiert</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>Andere Marken sind geeignet</td></tr><tr><td>Cy3 Donkey Anti-Maus IgG Multi-Labeling</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>Dieses Unternehmen wird für hochwertige Multi-Label-Antikörper (affinitätsarmiert) empfohlen. Wählen Sie den geeigneten Farbstoff und das geeignete Antigen (Tier, das zur Aufzucht des Primärantikörpers verwendet wurde). </td></tr><tr><td>n-Propylgallat</td><td>Fisher</td><td>ICN10274750</td><td>Andere Marken eignen sich DAPI</td></tr><tr><td>, 4',6'-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>D 9542</td><td>TOXIC. Tragen Sie Handschuhe und dosieren Sie in kleine Aliquots und feeze, um die Exposition zu minimieren</td></tr><tr><td>Whatman #1 Filter mit 15 cm Durchmesser</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas #1 1/2 Rechteck 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 Dicke ist optisch am besten</td></tr><tr><td>Objektträgermappe</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>Andere Marken sind geeignet</td></tr></tbody></table>

antikörperfärbung in<em&gt; c. elegans</em&gt; mit der &quot;freeze--cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Um C. Fleck elegans mit Antikörpern müssen die relativ undurchlässig Kutikula durch chemische oder mechanische Verfahren umgangen werden. &quot;Freeze-Cracking&quot; ist eine Methode verwendet, um körperlich ziehen Sie die Nagelhaut von Nematoden durch Komprimieren Nematoden zwischen zwei haftenden Folien, Einfrieren, und ziehen Sie die Folien auseinander. Gefrier Cracken liefert eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Zugang zu den Geweben ohne chemische Behandlung erhalten und kann mit einer Vielzahl von Fixiermitteln verwendet werden. Sie führt aber zum Verlust von vielen der Proben und die erforderliche Kompression der Probe mechanisch verformt. Praxis ist erforderlich, um Rückgewinnung der Proben mit guter Morphologie zu maximieren. Gefrier Cracken kann für bestimmte Fixierbedingungen, Rückgewinnung der Proben oder niedrige nicht-spezifische Färbung optimiert werden, aber nicht für alle Parameter auf einmal. Für Antikörper, die sehr schwer Fixierung Bedingungen erfordern und tolerieren die chemischen Behandlungen erforderlich, um chemisch permeabilisieren die Nagelhaut, treatment intakter Nematoden in Lösung bevorzugt werden. Wenn der Antikörper erfordert eine leichtere Lösung oder, wenn die optimale Fixierung Bedingungen bekannt sind, bietet gefrier Cracken eine sehr nützliche Methode, um schnell zu testen, die den Antikörper und spezifische subzelluläre und zelluläre Lokalisation Information für das Antigen von Interesse zu ergeben.

Wenn Würmer richtig komprimiert, rissig, und leicht fixiert ist, kann nahezu die gesamte Schnecken zugänglich Antikörper-Färbung (siehe Abbildung 2). Die Lage der Kerne durch DAPI-Färbung angezeigt anzeigt, welche Teile der Schnecke sind intakt, wenn die Würmer zu einem härteren Fixiermittel wie Formaldehyd ausgesetzt wird, kann sich die Morphologie der Schnecke verzerrt werden (wie durch die unnatürlich wellige Aussehen der gesehen Muskeln in den Fig. 3A-D). Ein weiteres häufiges Probl...

&quot;Freeze-Cracking&quot;, ein Verfahren zur Freilegung der inneren Gewebe des Nematoden C. elegans, um Antikörper für die Proteinlokalisierung, wird demonstriert.

Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Antikörperfärbung an C. elegans durchzuführen. Dazu werden die Nematoden abgespült, auf Objektträger verteilt und vorsichtig zwischen zwei Klebeobjektträger komprimiert, die anschließend auf Trockeneis gefroren werden. Danach werden die Objektträger getrennt, um die Nematoden aufzubrechen, und unmittelbar in Fixansatz gegeben. Die Nematoden werden anschließend mit Hilfe standardmäßiger Antikörper-Färbetechniken gefärbt. Die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine erfolgreiche Antikörperfärbung von semi-intakten Nematoden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Fixierung intakter Nematoden, besteht darin, dass die chemische Behandlung der Probe minimiert wird. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Vorbereitung der Objektträger und Nematoden etwas schwierig zu demonstrieren ist.Das Verfahren wird von mir und RTO Basu, einem Doktoranden aus meinem Labor, durchgeführt. Um Platten mit Fadenwürmern zur Färbung vorzubereiten, kühlen Sie zunächst ein flaches Metallstück auf Trockeneis ab, indem Sie es mit destilliertem Wasser und einer Glaspipette spülen. Überführen Sie Würmer, die auf einer 60 Millimeter NGM-Platte mit Bakterien gezüchtet wurden, in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Würmer können synchronisiert oder unterschiedlichen Alters sein, vermeiden Sie jedoch Platten mit vielen Dauersformen, die schwer zu öffnen sind, oder verhungerte Würmer, da diese die Autofluoreszenz erhöhen. Verwenden Sie hierfür dieselbe Glaspipette.Spülen Sie die Würmer drei bis vier Mal mit destilliertem Wasser, um sie von Bakterien zu befreien. Lassen Sie sie anschließend, um hauptsächlich adulte Exemplare zu sammeln, drei bis fünf Minuten lang auf dem Pult ruhen. Nachdem sich die Würmer am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, entfernen Sie den größten Teil des Wassers aus dem Röhrchen, wobei etwa die doppelte Würmervolumenmenge an Wasser verbleibt, jedoch mindestens ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern.Beschriften Sie die mattierte Seite der Polylysin-Objektträger mit wasserfester Tinte und legen Sie die Objektträger mit der Beschriftungsseite nach oben neben einen Behälter mit Trockeneis auf die Laborbank. Dies dient als unterer Objektträger. Halten Sie eine gleiche Anzahl sauberer, nicht mit Polylysin behandelter Objektträger bereit.Obere Objektträger verfügbar. Danach pipettieren Sie etwa 25 Mikroliter Würmer in Wasser auf den unteren Haftungsobjektträger und verteilen die Würmer mit der Seite der Pipettenspitze über die Mitte des Objektträgers. Lassen Sie sie 30 Sekunden bis zwei Minuten lang absetzen. Die Enden der Würmer bleiben haften, sobald sie die Objektträger berühren. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, die Würmer während der nächsten Schritte so wenig wie möglich zu verformen. Am besten gelingt dies, indem man geduldig ist, alles vorbereitet hat und nicht zu viel Koffein trinkt, sodass die Hände schön ruhig bleiben.Halten Sie die untere Objektträgerplatte in einer Hand und legen Sie die obere Objektträgerplatte darauf, sodass sich alle Bereiche bis auf die mattierten Teile überlappen. Die Flüssigkeit sollte die Objektträger leicht voneinander getrennt halten, sodass die Würmer noch etwas Bewegungsfreiheit besitzen. Achten Sie darauf, dass die Objektträger nicht gegeneinander verrutschen, da dies die Würmer verrenken könnte.Danach mit Daumen und Zeigefinger jeder Hand vorsichtig senkrecht auf den oberen Objektträger drücken. Bei der richtigen Druckstärke platzen einige der größten Hermaphroditen am Rand des Objektträgers auf. Während die meisten erwachsenen Tiere und Larven jeden Objektträger berühren, bleiben sie zunächst intakt; die Objektträger daher sofort und vorsichtig auf ein Metallstück auf Trockeneis legen, ohne dass sie verrutschen. Innerhalb einer Minute erscheinen die Objektträger gefroren, sollten aber fünf Minuten lang dort verbleiben, um eine vollständige Durchfrierung sicherzustellen.Die Objektträger sind nun bereit für die Fixierung. Falls die Weiterverarbeitung nicht sofort erfolgt, lagern Sie die Objektträger mehrere Tage lang in einer beschrifteten Box bei minus 80 Grad Celsius. Sie sollten innerhalb einer Woche nach der Herstellung verwendet werden.Verwenden Sie die Objektträger nicht nach langer Lagerung. Individuelle Nematoden können auch auf Objektträgern ähnlich wie zuvor gezeigt vorbereitet werden. Legen Sie ein flaches Metallstück auf Trockeneis, um es abzukühlen.Verwenden Sie anschließend einen Wurmlöffel, um einzelne Nematoden auf einen Wassertropfen auf einer NGM-Platte zu überführen, um sie von Bakterien zu befreien. Die Nematoden sollten gut gefüttert sein, um die Autofluoreszenz zu verringern. Falls erforderlich, wiederholen Sie die Übertragung auf neue Wassertropfen, bis der Wurm frei von Bakterien ist.Bereiten Sie anschließend die obere und untere Objektträgerplatte wie zuvor vor. Geben Sie dann unter mikroskopischer Beobachtung einen Tropfen Wasser von fünf bis 10 µL auf den mit Polylysin behandelten Bereich der unteren Objektträgerplatte. Übertragen Sie mit einem Wurmlöffel bis zu 20 Würmer in den Wassertropfen.Die Würmer sollten absinken, um die klebrige Objektträgeroberfläche zu berühren. Dann die Deckglasobjektträger wie zuvor auflegen, jedoch nicht zusammendrücken, sondern sicherstellen, dass die Objektträger nicht sofort verrutschen. Die Objektträger auf das Metall auf Trockeneis legen.Im Trockeneis fünf bis 30 Minuten lang lagern und anschließend sofort mit der Fixierung fortfahren. Diese Objektträger können nicht für eine spätere Verwendung aufbewahrt werden. Um die Würmer leicht zu fixieren, beginnen Sie damit, Färbegefäße mit Fixierungslösungen auf Eis zu stellen, um sie 10 Minuten lang abzukühlen.Die benötigten Lösungen sind 100 % Methanol, 100 % Aceton und phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Nehmen Sie ein Paar untere und obere Objektträger aus dem Trockeneis, drehen Sie sie schnell auseinander und tauchen Sie den unteren Objektträger unverzüglich für zwei Minuten in eiskaltes Methanol ein; entsorgen Sie den oberen Objektträger. Überführen Sie anschließend die Objektträger aus dem Methanol in eiskaltes Aceton für vier Minuten.Wenn die Objektträger viele Würmer enthielten, fallen die meisten von ihnen selbst bei sorgfältig vorbereiteten Präparaten in das Fixierungsmittel ab. Bei ordnungsgemäß vorbereiteten Einzelwurm-Präparaten sollten die Würmer haften bleiben. Zum Schluss wird das Fixierungsmittel abgespült, indem die Objektträger in das Gefäß mit PBS getaucht werden.Die Objektträger sind nun bereit für die Färbung und können mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd fixiert werden. Verdünnen Sie dazu eine reinstqualitative Formaldehyd- oder Glutaraldehydlösung in PBS auf eine Endkonzentration von 0,5 bis 4 %. Aliquote können bei minus 20 bis minus 30 Grad gelagert und nach Bedarf aufgetaut werden. Beachten Sie, dass Formaldehyd und Glutaraldehyd sehr toxisch sind; tragen Sie daher stets Handschuhe und arbeiten Sie im Abzug.Nehmen Sie ein Paar untere und obere Objektträger aus dem Trockeneis und trennen Sie sie sofort schnell durch Verdrehen. Legen Sie den unteren Objektträger, auf dem sich die Würmer befinden, in eine flache Schale mit Deckel, entsorgen Sie den oberen Objektträger umgehend und pipettieren Sie 200 Mikroliter der Fixierlösung über die Mitte des Bereichs des Objektträgers. Die Fixierlösung gefriert teilweise an der Stelle ein und schmilzt anschließend, um einen größeren Bereich des Objektträgers zu bedecken.Falls die Würmer nicht sofort vollständig und sorgfältig mit Fixansatz bedeckt sind, fügen Sie mithilfe einer Mikropipette weiteren Fixansatz hinzu. Lassen Sie den Fixansatz nicht über den Rand der Objektträgerplatte laufen. Geben Sie gefaltete, feuchte, fusselfreie Tücher in die Schale, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.Die Tücher dürfen die Objektträger nicht berühren. Danach die Schale mit einem Deckel abdecken und nach der Fixierung 10 Minuten bis über Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen. Anschließend die Fixierlösung mit losen Würmern vorsichtig mit einer Pipette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Danach den Objektträger in ein Färbeglas mit PBS eintauchen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit den Würmern für 30 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit, um sie zu pelletieren. Waschen Sie die Würmer zweimal mit PBS. Fahren Sie anschließend parallel zur Färbung der Würmer auf dem Objektträger fort.Die Antikörper-Färbung erfolgt nach einem Protokoll, das den Standardprotokollen für Gewebeproben auf Objektträgern ähnelt und im beigefügten Dokument ausführlich beschrieben ist. Nach der Färbung die Objektträger in PBS überführen und bis zu 12 Stunden bei vier Grad Celsius darin belassen, bis sie zum Aufziehen bereit sind. Zum Aufziehen einen Objektträger aus dem PBS entnehmen.Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um die Rückseite zu trocknen, und legen Sie sie dann kurz rasch auf ein Papiertuch. Geben Sie etwa 20 Mikroliter Eindeckmedium über die Würmer, sodass sich ungefähr gleiche Teile Medium und PBS auf dem Objektträger befinden.Kippen Sie die Objektträger vorsichtig, um die beiden Lösungen zu mischen. Vorsicht: Das Eindeckmedium ist toxisch. Halten Sie dabei die mattierte Kante.Neigen Sie den Objektträger so, dass sich die Lösung in der Nähe der Bereifung sammelt. Legen Sie dann eine Kante einer 24 mal 60 Millimeter großen Deckglas auf die Lösung, um Luftblasen zu minimieren, die eine stärkere Bleiche verursachen und die Beobachtung beeinträchtigen. Senken Sie das Deckglas vorsichtig ab.Falls Blasen entstehen, heben Sie langsam den Rand der Deckglasabdeckung an. Senken Sie sie dann erneut ab, ohne über die Würmer zu schieben. Geben Sie gegebenenfalls mehr PBS hinzu, um Luftblasen zu beseitigen.Drücken Sie mit einem fusselfreien Tuch vorsichtig die Ränder der Deckglas-Objektträger-Kombination zusammen, um die Kante zu trocknen. Die Kante des Objektträgers muss ringsum außerhalb der Kante des Deckglases sichtbar sein und darf nicht zu nass sein. Versiegeln Sie das Deckglas und tragen Sie zwei bis drei Schichten Nagellack auf die Kante auf.Wenn das Objektträgerpräparat gut versiegelt und trocken ist, reinigen Sie die Deckgläser und die Rückseite des Objektträgers und legen Sie es in die Vertiefungen eines Objektträgerhalters. Versiegelte Präparate können über mehrere Tage bei vier Grad Celsius oder über Wochen bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden. Bei längerer Lagerung kann die Färbung der DNA und die meisten grünen Farbstoffe verblassen; verschließen Sie das Deckglas bei Bedarf erneut mit zusätzlichem Nagellack, insbesondere nach der Verwendung eines Immersionsobjektivs mit Öl.Die folgenden repräsentativen Bilder wurden mit Objektträgern aufgenommen, die während der ersten Antikörperfärbungsversuche von Studierenden im Zellbiologielaborkurs angefertigt wurden. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für die Köpfe zweier erwachsener Hermaphroditen, die ordnungsgemäß komprimiert, angebrochen und leicht mit Methanolacetat fixiert wurden. Sie wurden mit mehreren Antikörpern und Farbstoffen markiert.In diesem Fall ist nahezu der gesamte Wurm für Antikörper zugänglich. Bei der Färbung zeigt die Lokalisation der Kerne, wie durch DPI-Färbung angegeben, welche Teile des Wurms intakt sind. Wenn die Würmer einer stärkeren Fixierung, beispielsweise mit Formaldehyd, unterzogen werden, kann sich die Morphologie des Wurms verzerren.Das ist in diesen Bildern an der wellenförmigen Erscheinung der in Rot dargestellten Muskulatur zu erkennen. Ein weiteres häufiges Problem, das mit der Verwendung stärkerer Fixiermittel verbunden ist, ist eine ungleichmäßige Fixierung oder Durchdringung bestimmter Gewebe. Dies zeigt sich hier daran, dass die in Rot dargestellte Muskulatur nur in einem Teil des Wurms angefärbt ist.Hier weist das Vorhandensein anderer Färbungen, einschließlich der DNA, die in Blau dargestellt ist, darauf hin, dass zumindest ein Teil des Körpers vorhanden war. Das sich ergebende Muster einer partiellen Färbung kann nach etwas Übung leicht erkannt werden, sodass die gesamte Verteilung der Färbung bestimmt werden kann, auch wenn ein einzelner Wurm eine ungleichmäßige Färbung aufweist. Häufige Probleme, die bei der Gefrierrissmethode unter Verwendung beliebiger Fixierungsbedingungen auftreten, werden hier veranschaulicht.Das häufigste Problem ist eine Verdrehung der Probe aufgrund einer relativen Bewegung der beiden Objektträger. Während der Kompression zeigt die Morphologie der gefärbten Gewebe, dass der Körper des Wurms unmittelbar hinter der Pharynx verdreht ist. Dieses Bild zeigt außerdem das Problem einer Hintergrundanfärbung, die durch das Anhaften des Antikörpers an die Polylysin-Beschichtung des Objektträgers verursacht wird.Dies kann durch die Verwendung des konfokalen Mikroskops vermieden werden. Beachten Sie, dass auch mit Übung viele einzelne Würmer verloren gehen oder einige der hier gezeigten Probleme aufweisen werden. Sobald die Technik beherrscht ist, können die Probenvorbereitung und Fixierung innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, und die Färbung kann an einem Tag abgeschlossen werden.Mithilfe dieses Verfahrens können verschiedene Fixierungsmethoden durchgeführt werden, um die Färbung für einen bestimmten Antikörper und ein bestimmtes Gewebe zu optimieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Lernen Sie die Freeze-Cracking-Methode zur Antikörperfärbung in C. elegans. Diese Technik minimiert chemische Behandlungen und ermöglicht präzise Proteinlokalisierung in vivo.

Antikörperfärbung in

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