Antikörperfärbung in C. Elegans Mit der "Freeze--Cracking"

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung einer Antikörperfärbung auf C elegance. Dazu werden Nematoden gespült, auf Objektträgern verteilt und vorsichtig zwischen zwei Klebeobjektträgern komprimiert, die anschließend auf Trockeneis eingefroren werden. Als nächstes werden die Objektträger getrennt, um die Nematoden aufzubrechen, und sofort in Fixiermittel gelegt.

Die Nematoden werden dann mit Standard-Antikörper-Färbetechniken gefärbt Die Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine erfolgreiche Antikörperfärbung von semi-intakten Nematoden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Fixierung intakter Nematoden besteht darin, dass sie die chemische Behandlung der Probe minimiert. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Vorbereitung der Objektträger und Nematoden etwas schwierig zu demonstrieren ist.

Das Verfahren werden von mir und RTO Basu, einem Doktoranden aus meinem Labor, durchgeführt. Um Platten mit Nematoden für die Färbung vorzubereiten, legen Sie zunächst ein flaches Stück Metall auf Trockeneis, um es mit destilliertem Wasser und einer Glaspipette zu kühlen. Würmer, die auf einer 60-Millimeter-NGM-Platte mit Bakterien zu einem 1,5-Milliliter-Mikro-Fuge-Röhrchen gezüchtet werden. Die Würmer können synchronisiert oder gemischt sein, aber vermeiden Sie die Verwendung von Platten mit vielen Mitgiften, die schwer zu knacken sind, oder ausgehungerten Würmern, die die Autofluoreszenz mit derselben Glaspipette erhöhen.

Spülen Sie die Würmer drei- bis viermal mit destilliertem Wasser ab, um sie von Bakterien zu befreien. Um dann hauptsächlich erwachsene Tiere zu sammeln, lassen Sie sie drei bis fünf Minuten auf der Bank sitzen. Nachdem sich die Würmer am Boden des Röhrchens festgesetzt haben, entferne das meiste Wasser aus dem Röhrchen, so dass etwa das doppelte Volumen des Wassers wie bei Würmern übrig bleibt, aber mindestens 25 Mikroliter Gesamtvolumen.

Beschriften Sie die mattierte Seite der Polylysin-Objektträger mit unauslöschlicher Tinte und legen Sie die Objektträger mit dem Trockeneisetikett nach oben auf die Tischplatte neben den Behälter. Dies dient als untere Folie. Lassen Sie die gleiche Anzahl sauberer Nicht-Polylysine behandeln.

Top-Folien verfügbar. Pipettieren Sie als nächstes etwa 25 Mikroliter Würmer in Wasser auf den unteren Adhärenzobjektträger und verteilen Sie die Würmer mit der Seite der Pipettenspitze über die Mitte des Objektträgers. Lassen Sie sie 30 Sekunden bis zwei Minuten ruhen.

Die Enden der Würmer kleben, wenn sie mit dem Objektträger in Berührung kommen. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, zu verhindern, dass sich die Würmer zu sehr verzerren, wenn Sie die nächsten Schritte ausführen. Der beste Weg, dies zu tun, besteht darin, geduldig zu sein, alles griffbereit zu haben und nicht zu viel Koffein zu trinken, damit Ihre Hände schön ruhig sind.

Halten Sie den unteren Schieber in einer Hand und legen Sie den oberen Schieber so darüber, dass sich alle bis auf die mattierten Teile überlappen. Die Flüssigkeit sollte die Objektträger etwas auseinander halten, damit die Würmer noch etwas beweglich sind. Lassen Sie die Rutsche nicht übereinander gleiten, da sich die Würmer verdrehen.

Drücken Sie dann mit den Daumen und Zeigefingern jeder Hand vorsichtig gerade nach unten auf die obere Folie. Mit dem richtigen Druck brechen einige der größten Hermaphroditen am Rand der Rutsche auf. Während die meisten erwachsenen Tiere und Larven mit jedem Objektträger in Kontakt kommen, aber sofort und vorsichtig intakt bleiben, ohne dass die Objektträger verrutschen, legen Sie sie auf das Metallstück auf Trockeneis. Innerhalb einer Minute erscheinen die Objektträger eingefroren, aber lassen Sie sie dort fünf Minuten lang, um sicherzustellen, dass sie gründlich eingefroren sind.

Die Dias sind nun bereit für die Fixierung. Wenn Sie nicht fortfahren, lagern Sie die Objektträger sofort in einer beschrifteten Schachtel bei minus 80 Grad Celsius für mehrere Tage. Sie sollten innerhalb von etwa einer Woche nach ihrer Herstellung verwendet werden.

Verwenden Sie die Objektträger nicht nach längerer Lagerung. Einzelne Nematoden können auch auf Objektträgern in einer ähnlichen Methode wie der zuvor gezeigten präpariert werden. Lege ein flaches Stück Metall auf Trockeneis, um es zu kühlen.

Als nächstes überträgst du mit einem Wurmpickel einzelne Nematoden in einen Tropfen Wasser auf einer NGM-Platte, um sie von Bakterien zu befreien. Die Nematoden sollten gut gefüttert werden, um die Autofluoreszenz zu verringern. Wenn möglich, wiederholen Sie die Übergabe an neue Wasserstellen nach Bedarf, bis der Wurm frei von Bakterien ist.

Bereiten Sie als Nächstes die oberen und unteren Folien wie zuvor vor. Geben Sie dann einen fünf bis 10 Mikroliter großen Tropfen Wasser auf den mit Polylysin behandelten Bereich des unteren Objektträgers, während Sie mit einem Mikroskop beobachten. Verwende einen Wurmpickel, um bis zu 20 Würmer in den Wassertropfen zu übertragen.

Die Würmer sollten nach unten sinken, um die klebrige Gleitfläche zu berühren. Platzieren Sie dann die obere Folie wie zuvor, aber drücken Sie sie nicht zusammen und achten Sie darauf, dass die Folien nicht sofort verrutschen. Legen Sie die Rutschen auf das Metall auf Trockeneis.

Fünf bis 30 Minuten auf Trockeneis aufbewahren und sofort mit der Fixierung fortfahren. Diese Folien können nicht für eine spätere Verwendung aufbewahrt werden. Um die Würmer leicht zu fixieren, stellen Sie zunächst Färbegläser mit Fixierlösungen auf Eis und kühlen Sie sie 10 Minuten lang.

Die benötigten Lösungen sind 100 % Methanol, 100 % Aceton und phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Nehmen Sie ein Paar untere und obere Folie aus dem Trockeneis, drehen Sie sie schnell auseinander und tauchen Sie die untere Folie sofort zwei Minuten lang in eiskaltes Methanol, dann entsorgen Sie die obere Folie. Übertragen Sie anschließend die Objektträger vier Minuten lang von Methanol auf eiskaltes Aceton.

Wenn die Objektträger viele Würmer enthielten, fallen die meisten von ihnen auch bei gut vorbereiteten Objektträgern im Fixiermittel ab. Wenn einzelne Wurmobjektträger ordnungsgemäß vorbereitet wurden, sollten die Würmer haftend bleiben. Zum Schluss, um das Fixiermittel abzuspülen, tauchen Sie die Objektträger in das Glas mit PBS.

Die Objektträger sind nun bereit für die Färbung, um eine harte Fixierung mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd durchzuführen. Beginnen Sie mit dem Verdünnen von Formaldehyd oder Glutaraldehydlösung in Reagenzqualität in PBS auf eine Endkonzentration von 0,5 bis 4 %Aliquots können bei minus 20 bis minus 30 Grad gelagert und bei Bedarf aufgetaut werden. Denken Sie daran, dass Formaldehyd und Glutaraldehyd immer sehr giftig sind, daher müssen Sie Handschuhe tragen und in einem Abzug arbeiten.

Nehmen Sie ein Paar untere und obere Slides aus dem Trockeneis und drehen Sie sie sofort auseinander. Legen Sie den unteren Objektträger mit den Würmern in eine flache Schale mit Deckel, entsorgen Sie den oberen Objektträger sofort und pipettieren Sie 200 Mikroliter des Fixiermittels über die Mitte des Objektträgerbereichs. Bei Würmern friert das Fixiermittel teilweise an Ort und Stelle ein und schmilzt dann, um einen größeren Bereich des Objektträgers zu bedecken.

Wenn die Würmer nicht sofort und vorsichtig vollständig mit Fixiermittel bedeckt sind, fügen Sie mit einer Mikropipette mehr Fixiermittel hinzu. Lassen Sie das Fixiermittel nicht über den Rand des Objektträgers fließen. Geben Sie gefaltete, feuchte, fusselfreie Tücher in die Schüssel, um sie feucht zu halten.

Lassen Sie die Tücher nicht mit den Objektträgern in Berührung kommen. Decken Sie dann die Schale mit einem Deckel ab und lassen Sie sie nach Abschluss der Fixierung 10 Minuten über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Übertragen Sie das Fixiermittel vorsichtig mit einer Pipette mit losen Würmern in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Tauchen Sie dann den Objektträger in ein Färbeglas, das PBS enthält.

Drehe das Rohr mit den Würmern 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit, um sie zu pelletieren. Spülen Sie die Würmer zweimal mit PBS ab. Fahren Sie dann damit fort, sie parallel zu den Würmern auf dem Objektträger zu färben.

Das Antikörperfärbeprotokoll ähnelt den Standardprotokollen für jegliches Gewebe auf Objektträgern und ist im Begleitdokument ausführlich beschrieben. Übertragen Sie die Objektträger nach dem Färben auf PBS und lassen Sie sie dort bis zu 12 Stunden bei vier Grad Celsius verbleiben, bis sie montiert werden können. Um die Folien zu mounten, entfernen Sie eine Folie aus dem PBS.

Trocknen Sie die Rückseite mit einem fusselfreien Tuch ab und legen Sie sie dann schnell kurz auf ein Papiertuch. Geben Sie etwa 20 Mikroliter Einbettmedium über die Würmer, so dass ungefähr gleiche Teile Medium und PBS vorhanden sind. Auf der Folie.

Kippen Sie den Schieber vorsichtig, um die beiden Lösungen zu mischen. Achtung: Eindeckmedium ist giftig. Halten Sie den mattierten Rand fest.

Kippen Sie den Schieber so, dass sich die Lösung in der Nähe des Zuckergusses sammelt. Legen Sie dann eine Kante eines 24 x 60 Millimeter großen Deckblatts auf die Lösung, um Luftblasen zu minimieren, die das Ausbleichen verstärken und die Betrachtung stören. Senken Sie den Deckslip vorsichtig ab.

Wenn sich Blasen bilden, heben Sie den Rand des Deckglases langsam an. Dann, ohne über die Würmer zu rutschen, senken Sie es wieder ab. Fügen Sie bei Bedarf mehr PBS hinzu, um Luftblasen zu beseitigen.

Drücken Sie die Ränder des Deckblatts mit einem fusselfreien Tuch zusammen und schieben Sie es vorsichtig zum Abtrocknen des Randes. Der Rand des Objektträgers muss rundum um den Rand des Deckglases sichtbar sein und darf nicht zu nass sein. Versiegeln Sie den Deckglas und tragen Sie zwei bis drei Schichten Nagellack auf den Rand auf.

Sobald die Folie gut versiegelt und trocken ist, reinigen Sie den Deckglas und die Rückseite der Folie und legen Sie sie in eine Vertiefung des Objektträgerhalters. Versiegelte Objektträger können über längere Zeiträume Tage bei vier Grad Celsius oder Wochen bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden. Feuchte Flecken von DNA und die meisten grünen Farbstoffe verblassen und versiegeln Sie den Deckglas bei Bedarf mit mehr Nagellack, insbesondere nach der Verwendung einer Ölimmersionslinse.

Die folgenden repräsentativen Bilder wurden anhand von Objektträgern aufgenommen, die während der ersten Antikörperfärbeversuche von Studenten in einem zellbiologischen Laborkurs erstellt wurden. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für die Köpfe von zwei erwachsenen Hermaphroditen, die ordnungsgemäß komprimiert, gerissen und leicht mit Methanolaceton fixiert sind. Sie wurden mit mehreren Antikörpern und Farbstoffen markiert.

In diesem Fall ist praktisch der gesamte Wurm für Antikörper zugänglich. Bei der Färbung zeigt die Position der Zellkerne, wie sie durch DPI-Färbung angezeigt wird, an, welche Teile des Wurms intakt sind. Wenn die Würmer einem härteren Fixiermittel wie Formaldehyd ausgesetzt werden, kann sich die Morphologie des Wurms verformen.

Dies ist auf diesen Bildern als wellenförmiges Erscheinungsbild der rot dargestellten Muskeln zu sehen. Ein weiteres häufiges Problem, das mit der Verwendung von härteren Fixiermitteln verbunden ist, ist die ungleichmäßige Fixierung oder Penetration bestimmter Gewebe. Dies ist hier zu sehen, wo der rot dargestellte Muskel nur in einem Teil des Wurms fleckig ist.

Hier deutet das Vorhandensein anderer Färbungen, einschließlich DNA, die in Blau dargestellt sind, darauf hin, dass zumindest ein Teil des Körpers vorhanden war. Das resultierende Muster der partiellen Färbung kann mit der Praxis leicht identifiziert werden, so dass die gesamte Verteilung der Färbung bestimmt werden kann, selbst wenn ein einzelner Wurm eine ungleichmäßige Färbung aufweist. Häufige Probleme, die bei Gefrierrissen unter allen Fixierungsbedingungen auftreten, sind hier dargestellt.

Das häufigste Problem ist das Verdrehen der Probe aufgrund der Relativbewegung der beiden Objektträger. Während der Kompression Hier deutet die Morphologie des gefärbten Gewebes darauf hin, dass der Körper des Wurms direkt hinter dem Rachen verdreht ist. Dieses Bild zeigt auch das Problem der Hintergrundfärbung aufgrund von Antikörpern, die an dem Polylysin haften, das den Objektträger bedeckt.

Dies kann durch den Einsatz des Konfokalmikroskops vermieden werden. Beachten Sie, dass selbst mit etwas Übung viele einzelne Würmer verloren gehen oder einige der hier gezeigten Probleme aufweisen. Einmal gemeistert, kann die Vorbereitung und Fixierung in einer Stunde und die Färbung an einem Tag durchgeführt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Vielzahl von Fixierungsmethoden durchgeführt werden, um die Färbung für einen bestimmten Antikörper und ein bestimmtes Gewebe zu optimieren.